Este trabalho demonstrou a construção de minibibliotecas de \"Expressed Sequence Tags\" (EST) com o uso de RT-PCR de baixa estringencia e \"primer\" consenso-degenerado. Através do estudo de parâmetros críticos como concentração de sais, temperatura e velocidade de ciclagem, composição dos \"primers\" e qualidade do RNA mensageiro, foi possível padronizar um protocolo. Tal protocolo permitiu um aumento do numero de seqüências por minibiblioteca em relação a protocolos similares existentes na literatura (Dias neto et al., 1997 e 2000) sem perda de características desejáveis como amplificação preferencial do centro dos genes e nomalização das mensagens. As seqüências produzidas levaram a um significativo aumento das seqüências de EST de S. mansoni disponíveis publicamente e permitiu a detecção da existência de novos fragmentos de genes expressos na fase adulta do parasita. Neste trabalho também clonamos uma apirase de S. mansoni cuja a seqüência não havia sido descrita anteriormente. O gene possui cerca de 2,7 mil pares de bases e codifica para uma proteína de 544 aminoácidos. Esta foi expressa em sistema heterologo e utilizada para obtenção de anticorpos policlonais contra esta proteína. Utilizando estes anticorpos foi possível detectar a proteína no tegumento do parasita. / This work demonstrates the construction of EST minilibraries employing low stringency RT-PCR and consensus-degenerate primers. Through the study of critical parameters such as salt concentration, cycling temperature and ramp speed, composition of primers and quality of messenger RNA a standard protocol was obtained. Such protocol allowed an increase in the number of sequences per minilibrary in relation to similar protocols in the literature (Dias Neto et al., 1997 and 2000) without no loss in desirable characteristics such as preferential amplification of the central portion of messages and normalization of messages. The sequences produced allowed a significant increase in the publicly available EST sequences of S. mansoni and permitted discovery of new gene fragments expressed in adult stage of the life cycle of the parasite. In this work we also cloned an apyrase of S. mansoni whose sequence had never been described previously. The gene has about 2.7 kilobases and codes for a protein of 544 aminoacids. This protein was expressed in a heterologous system and was used for production of a polyclonal antibody. This antibody was used for detection of this protein in the tegument of the parasite.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10052018-143753 |
| Date | 24 February 2003 |
| Creators | Marco, Ricardo de |
| Contributors | Verjovski-Almeida, Sergio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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