O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13102011-085856 |
| Date | 11 July 2011 |
| Creators | Khusal, Ketna Guilhermino |
| Contributors | Alves, Maria Julia Manso |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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