A aterosclerose é uma doença crônica onde duas características marcantes são observadas: retenção de lipídios e inflamação. Compreender as interações entre as células do sistema imunológico e as lipoproteínas envolvidas na aterogênese são desafios urgentes, uma vez que as doenças cardiovasculares são a principal causa de morte no mundo. Os macrófagos são cruciais para o desenvolvimento de placas ateroscleróticas e para a perpetuação da inflamação em tais lesões; estas células também estão diretamente envolvidas na ruptura de placa instável. Recentemente diferentes populações de macrófagos estão sendo identificadas nas lesões ateroscleróticas. Embora macrófagos M2 tenham sido identificados, a função destas células na aterosclerose ainda não está definida. Neste projeto, avaliamos se a adição de LDLox altera a função de macrófagos M2. Resultados: 1- Foi possível observar que os M2 se mantem viáveis após o estímulo com as lipoproteínas. 2- Quando avaliamos a expressão de moléculas co-estimulatórias, receptores Scavenger, lectinas e integrinas na superfície das células, observamos que a adição de LDLn ou LDLox em 2 concentrações diferentes (5 e 50ug/ml), por diferentes períodos de tempo não alterou a expressão de nenhum dos marcadores avaliados. A presença de LDL também não alterou outra função primordial dos M2, a capacidade de fagocitose. 3- Quando investigamos a presença de citocinas no sobrenadante das culturas estimuladas ou não com as lipoproteínas, identificamos um aumento na secreção de IL-8, uma citocina pró-inflamatória, na presença de LDLox, semelhante ao observado com a população de macrófagos M1. 4- Avaliamos se os macrófagos M2 estimulados ou não com LDL mantem sua capacidade de favorecer a angiogênese. Observamos que nas culturas estimuladas com o sobrenadante das culturas dos M2 mantidos na presença de LDLox houve uma inibição significativa da formação de túbulos pelas HUVECs. 5- Observamos que na presença do meio condicionado dos M2 estimulados com LDLox ocorreu uma intensa degradação dos filamentos de matriz extracelular produzida por MEFs. 6- Avaliamos a expressão gênica de componentes de matriz, membrana basal, moléculas de adesão, proteases e também inibidores de protease nestas células. Dos 96 genes avaliados, observamos que a adição de LDLox reduziu a expressão de 10 genes de maneira significativa, entre eles: beta-Actina (ACTB), Colágeno 6A2 (Col6A2), Integrina alfa 6 (ITGA6), Metaloproteinase 15 (MMP15), molécula de adesão celular endotelial plaquetária (PECAM) e Inibidor de metalopeptidase 2 (TIMP2). A adição de LDLox aumentou significativamente somente a expressão de trombospondina (TSP1). A adição de LDLn não alterou a expressão de nenhum gene de forma significativa. 7- A adição de LDLox induziu aumento da expressão da TSP1 e redução da expressão de colágeno 6, quando comparadas aos macrófagos M2 sem estímulo. Nossos resultados indicam que a adição de LDLox altera diversas funções dos macrófagos M2 in vitro. Em especial detectamos uma inibição significativa na angiogênese e também a secreção de mediadores que induzem a degradação da matriz extracelular. A adição de LDLox também inibiu a expressão de genes envolvidos com a estabilização da matriz extracelular. Nossos resultados sugerem que esta população de células pode contribuir para a perpetuação do processo inflamatório e degradação tecidual observados na lesão dos pacientes. Assim, acreditamos que este projeto contribuiu para o esclarecimento da participação dos M2 na patologia da aterosclerose / Atherosclerosis is a chronic disease where two key characteristics are observed: lipid retention and inflammation. Understanding the interactions between the cells of the immune system and the lipoproteins involved in atherogenesis are urgent challenges, since cardiovascular diseases are the leading cause of death in the world. Macrophages are crucial for the development of atherosclerotic plaques and for the inflammation in such lesions; These cells are also directly involved in unstable plaque rupture. Recently different populations of macrophages are being identified in atherosclerotic lesions. Although M2 macrophages has been identified, the function of these cells in atherosclerosis has not yet been defined. This project, we evaluated whether the addition of OxLDL alters the function of M2 macrophages. Results: 1- M2 macrophages remain viable after stimulation with the lipoproteins. 2- When evaluated the expression of co-stimulatory molecules, Scavenger receptors, lectins and integrins on the surface of the cells. We observed that the addition of LDLn or OxLDL at 2 different concentrations (5 and 50 ?g / ml) for different time periods did not alter the expression of any of the evaluated markers. 3- The presence of LDL also did not alter other primordial function of M2 cells, phagocytosis. 4- Was observed that cultures stimulated with conditioned medium of OxLDL-stimulated M2 there was a significant inhibition of tubule formation by HUVECs. 5- We observed that in the presence of OxLDL-stimulated M2 cells conditioned médium an intense degradation of the matrix filaments occurred. 6- We evaluated the gene expression of matrix components, basement membrane, adhesion molecules, proteases and also protease inhibitors in these cells. Of the 96 evaluated genes, we observed that the addition of OxLDL significantly reduced the expression of 10 genes, among them: Actin-beta (ACTB), Collagen 6A2 (Col6A2), Integrin alfa 6 (ITGA6), Metaloproteinase 15 (MMP15), Platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM) and metallopeptidase 2 inhibitor (TIMP2). The addition of OxLDL significantly increased only the expression, thrombospondin-1 (TSP1). Addition of LDLn did not significantly alter the expression of any gene. 7- That OxLDL addition induced increased TSP1 expression and reduced collagen 6 expression, when compared to M2 macrophages without stimulation. Our results indicate that the addition of OxLDL alters several M2 macrophages functions in vitro. In particular we detected a significant inhibition in angiogenesis and also the secretion of mediators that induce the degradation of the extracellular matrix. The addition of OxLDL also inhibited the expression of genes involved in extracellular matrix stabilization. Our results suggest that this cell population may contribute to the perpetuation of the inflammatory process and tissue degradation observed in the lesion of the patients. Thus, we believe that this project contributed to better understand the participation of M2 in the pathology of atherosclerosis
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29112017-101149 |
| Date | 12 September 2017 |
| Creators | Gonçalves, Fernanda Magalhães |
| Contributors | Kalil Filho, Jorge Elias |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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