Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/20599 |
| Date | 19 March 2019 |
| Creators | Scheib, Ulrike |
| Contributors | Peter, Hegemann, Birte, Höcker, Holger, Dobbek |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY 3.0 DE) Namensnennung 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/ |
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