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Previous issue date: 2006-11-23 / Universidade Federal de Sao Carlos / Disintegrins are snake venom protein, of low molecular weight, rich in cysteines and RGDcontaining peptides that bind specifically to integrins αIIbβ3, α5β1, and αvβ3 expressed on
platelets, endothelial and tumor cells. The biological effects of these peptides are related with
biological process of cellular adhesion where receptors called integrins are presents. This
dissertation describes the optimization of purification and additional characterization of a
recombinant RGD-disintegrin of Bothrops alternatus, DisBa-01.. The DisBa-01 is a
recombinant RGD-disintegrin, which interacts with αIIbβ3 integrin, inhibiting platelet
aggregation and proliferation of endothelial and some tumor cells. In this work, a new
protocol of purification was proposed for most efficient purification of the DisBa-01. The
recombinant disintegrin, DisBa-01, was expressed in an optimizedbacterial system
(Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and purified by affinity chromatography. In
this new protocol, the product of the purification in nickel column is submitted ion exchange
chromatography. The use of the ion exchange chromatography as second step for purification
increased the purity degree and the protein yield. The purified protein had its N-Terminal
portion sequenced in 20 amino acids residues and its molecular mass determined by mass
spectrometry. The mass spectrometry assay confirmed the mass of the DisBa-01 as 11.658
Da. The RGD-disintegrin pure had the tag of polihistidinas removed with thrombin. The
cleavage of the tag of histidinas with thrombin was efficient. Polyclonal antibodies against
DisBa-01 have also been produced in mice. The reactivity of these antibodies was observed
through imunoblotting. These results provided one better form of obtain the pure protein as
well as significant additional information for a better characterization of recombinant RGDdisintegrin, DisBa-01, which could be useful for the study of RGD-disintegrin, recombinant
or native, and integrin. / Desintegrinas são proteínas de veneno de serpentes, de baixo peso molecular, ricas em
cisteína e em geral um peptídeo contendo o motivo RGD que liga especificamente a
integrinas αIIbβ3, α5β1, e αvβ3 de plaquetas, células endoteliais e células tumorais. Os efeitos
biológicos desses peptídeos estão relacionados com processos biológicos de adesão celular
onde receptores denominados integrinas estão presentes. Esta dissertação descreve a
otimização da purificação de uma desintegrina-RGD recombinante de Bothrops alternatus,
DisBa-01, e a caracterização adicional desta proteína. A DisBa-01 é uma desintegrina-RGD
recombinante que interage com a integrina αIIbβ3 inibindo agregação plaquetária e
proliferação de células endoteliais e algumas células tumorais. Neste trabalho, um novo
protocolo de purificação foi proposto para a purificação mais eficiente da DisBa-01. A
desintegrina, DisBa-01, foi expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli
BL21(DE3)pET28a+DisBa-01) e purificada em coluna de afinidade. Neste novo protocolo, o
produto da purificação na coluna de níquel é submetido à cromatografia de troca-iônica. O
uso da cromatografia de troca-iônica aumentou o grau de pureza e o produto protéico final. A
proteína purificada teve o N-terminal seqüenciado em 20 resíduos de aminoácidos. A massa
molecular foi determinada por espectrometria de massa que confirmou como 11.658 Da a
massa da proteína. A desintegrina-RGD pura teve a cauda de polihistidinas eficientemente
removida com proteólise com trombina. Anticorpos policlonais contra DisBa-01 foram
produzidos em camundongos. A reatividade desses anticorpos foi observada através de
imunoblotting. Estes resultados estabelecem uma nova forma de obtenção da proteína pura,
assim como informações adicionais significativas de uma melhor caracterização da
desintegrina-RGD recombinante, DisBa-01, que pode ser útil para o estudo de desintegrinas-
RGD, recombinantes ou nativas, e interações com integrinas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/5435 |
| Date | 23 November 2006 |
| Creators | Pontes, Carmen Lucia Salla |
| Contributors | Araújo, Heloísa Sobreiro Selistre de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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