Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:12:04Z
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2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / A estratégia de humanização de anticorpos tem sido eficiente para melhorar o uso clínico desses biofármacos. Porém, a manipulação da cadeia polipeptídica, eventualmente, leva a uma perda de afinidade, reduzindo sua eficácia. Este estudo é uma continuação dos testes necessários para a melhoria da afinidade de ligação, de um anticorpo humanizado pelo Grupo de Imunologia Molecular da UnB. Em trabalhos anteriores descritos pelo grupo, um anticorpo anti-CD3 humanizado para fins clínicos, foi comparado com o anticorpo original murino quanto a sua capacidade de ligação ao antígeno humano CD3. Os resultados sugeriram que parte da afinidade foi perdida durante o processo de humanização. Então, este estudo visa compreender a interação química e estrutural entre o anti-CD3 humanizado e seu antígeno. Para isto, foram realizadas mutagêneses sítio-dirigidas por PCR overlap, no anticorpo humanizado, com base na estrutura cristalina do complexo OKT3-CD3, que identificou a participação de ligação dos resíduos de aminoácidos chave envolvidos na ligação. Os anti-CD3 com as mutações de interesse foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) na forma de fragmento de anticorpo FvFc (scFv ligado diretamente aos domínios CH2-CH3 de IgG 1 humana). Purificamos estas proteínas e, em paralelo, produzimos um CD3 de cadeia única recombinante usando um sistema de expressão de antigenos solúveis em bactéria. Os anticorpos mutados e o antígeno, serão usados em testes de afinidade, competição, bloqueio e proliferação usando as técnicas de ELISA e FACS. O mapeamento detalhado dos resíduos chave envolvidos intimamente com a ligação ao antígeno, permitirá o desenvolvimento mais eficaz de anticorpos anti-CD3 para uso clínico no futuro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The strategy of antibody humanization has been effective in improving the clinical use of biopharmaceuticals. Thus, the manipulation of the polypeptide chain, eventually leads to an affinity loss, reducing its effectiveness. This study is a continuation of the tests needed to improve the binding affinity of an antibody humanized by the Group of Molecular Immunology, UnB. In previous work described by the group, a humanized anti-CD3 antibody for clinical purposes, was compared with the original murine antibody and its ability to bind to the human CD3 antigen. The results suggested that part of the affinity was lost during the process of humanization. So, this study aims to understand the chemical and structural interaction between the anti-CD3 humanized antibody and its antigen. With this pourpose, we performed site-directed mutagenesis in the humanized antibody, based on the crystal structure of the complex CD3-OKT3 (a murine monoclonal antibody), which identified the participation of key binding residues involved in binding. Some amino acids residues of the humanized anti-CD3, were selected and modified by PCR overlap. Mutants were produced Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in the form of antibody fragment FvFc (a scFv linked to human IgG1 CH2-CH3 domains). We purified this protein and in parallel, produced a scFv CD3 recombinant expression system that permits the purification of soluble bacterial antigens. The recombinant molecules will be used in assays for affinity, competition, blocking and proliferation using the ELISA and FACS. The detailed mapping of key residues intimately involved with binding to the antigen, will allow the development of more effective anti-CD3 antibody for clinical use in the future.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/19922 |
| Date | 29 February 2012 |
| Creators | Paula, Janaína do Nascimento Lima Matias de |
| Contributors | Maranhão, Andréa Queiroz, Brígido, Marcelo de Macedo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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