Type II restriction endonucleases recognize specific DNA sequences and cleave DNA at fixed positions within or close to this sequence. BpuJI recognizes the 5’-CCCGT sequence, but in contrast to other enzymes its cleavage site is very variable. This study shows that BpuJI is a dimer in solution and consists of two separate domains. The N-domain binds to the target sequence as a monomer, while the C-domain is responsible for nuclease activity and dimerization. The nuclease activity is repressed in the apo-enzyme and becomes activated upon specific DNA binding by the N-domains. The activated C-domain cleaves DNA near the target site. In addition, it possesses an end-directed nuclease activity and preferentially cuts ~3 nt from the 3’ terminus. This leads to a very complicated pattern of DNA cleavage. Bioinformatics and mutational analysis revealed that the BpuJI C-domain harbours a PD (D/E)XK active site and is structurally related to archaeal Holliday junction resolvases. The crystal structure of the BpuJI N-domain bound to cognate DNA was solved at 1.3 Å resolution. It revealed two winged-helix subdomains, D1 and D2. The recognition of the target sequence is achieved the amino acid residues located on both the HTH motifs and an N-terminal arm. The BpuJI DNA recognition domain is most similar to the nicking endonuclease Nt.BspD6I. The modelling suggests that Nt.BspD6I could share the specificity-determining regions with BpuJI. / II tipo restrikcijos endonukleazės atpažįsta specifines DNR sekas ir kerpa DNR šiose sekose arba šalia jų. BpuJI, atpažįstanti 5’-CCCGT seką, skiriasi nuo kitų fermentų tuo, kad jos kirpimo vieta yra labai variabili. Čia parodoma, kad BpuJI yra dimeras, sudarytas iš dviejų monomerų, kurie turi po du atskirus domenus. BpuJI N domenas atpažįsta taikinį kaip monomeras, o C-domenas pasižymi nukleaziniu aktyvumu ir dimerizuojasi. Apo-fermento nukleazinis aktyvumas yra nuslopintas. N-domenams atpažinus taikinį, aktyvuojamas C-domenas, kuris perkerpa DNR šalia taikinio. Be to, aktyvuotas C-domenas yra nespecifinė nukleazė, linkusi nukirpti ~3 nt nuo buko dvigrandės DNR galo. Taigi, BpuJI DNR karpymo pobūdis yra labai sudėtingas. Bioinformatinė analizė ir kryptinga mutagenezė parodė, kad BpuJI C-domenas turi PD-(D/E)XK struktūrinę sanklodą ir yra panašus į archėjų Holidėjaus jungtis karpančias nukleazes. Išsprendus 1,3 Å skiriamosios gebos BpuJI N-domeno/DNR komplekso erdvinė struktūrą, paaiškėjo, kad šį domeną sudaro du „sparnuotą“ spiralė-linkis-spiralė motyvą turintys subdomenai. BpuJI taikinį atpažįsta aminorūgštys, esančios N-rankoje ir abiejų spiralė-linkis-spiralė motyvų atpažinimo spiralėse. BpuJI N-domenas yra labiausiai panašus į Nt.BspD6I nukleazę, kerpančią vieną DNR grandinę. Nt.BspD6I/DNR komplekso struktūros modelis rodo, kad Nt.BspD6I ir BpuJI taikinį atpažįstantys struktūriniai elementai yra panašūs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LABT_ETD/oai:elaba.lt:LT-eLABa-0001:E.02~2009~D_20091215_091842-18511 |
| Date | 15 December 2009 |
| Creators | Sukackaitė, Rasa |
| Contributors | Sasnauskas, Kęstutis, Kirvelienė, Vida, Mildažienė, Vida, Klimašauskas, Saulius, Meškys, Rolandas, Lubys, Arvydas, Matulis, Daumantas, Šikšnys, Virginijus, Gražulis, Saulius, Vilnius University |
| Publisher | Lithuanian Academic Libraries Network (LABT), Vilnius University |
| Source Sets | Lithuanian ETD submission system |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Doctoral thesis |
| Format | application/pdf |
| Source | http://vddb.library.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2009~D_20091215_091842-18511 |
| Rights | Unrestricted |
Page generated in 0.002 seconds