CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / INCT - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia / A tuberculose (Tb) é uma infecção heterogênea causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), com altos índices de mortalidade. O principal método diagnóstico consiste em achados bacteriológicos, carecendo de alternativas mais eficazes. Acurácia, agilidade e acessibilidade no diagnóstico são cruciais para a contenção do fluxo infeccioso. Neste trabalho, objetivamos caracterizar o padrão de expressão de 27 citocinas na saliva e no soro de pacientes com Tb em associação com o tempo de tratamento, avaliar a aplicação de peptídeos sintéticos, TBC10 e TB2C10, em ensaios imunoenzimáticos e biossensor para o diagnóstico da Tb pela saliva e selecionar ácidos nucleicos ligantes de proteínas específicas. 27 citocinas, em soro e saliva de 86 indivíduos, foram dosadas simultaneamente por kit multiplex. Os indivíduos foram agrupados em TB (doentes sem tratamento), TBT (doentes em curso de tratamento), TBTDO (doentes ao término do tratamento), PPD+ (saudáveis reativos ao teste tuberculínico PPD) e C- (saudáveis não reativos ao PPD). Nove citocinas apresentaram maior expressão em TB que em C-. A expressão IL-2, IL-15 e IL-4 na saliva foi significativamente diferente entre doentes e PPD+. Todos os grupos positivos para Tb apresentaram maior expressão de IL-2, IL15, IL-8, IL-9 na saliva que indivíduos saudáveis. Os valores obtidos para IP-10 no soro permitiu distinguir os grupos positivos entre si e negativo, apresentando potencial pra monitoramento do tratamento de Tb. Seis citocinas, IL-13, IL-10, IL-6, IL-2, IL-15 e IL-8, foram significativamente mais expressas no soro dos grupos positivos que de saudáveis. O score associando as quatro citocinas com melhor representatividade na saliva e as seis no soro, permitiu predizer a infecção por Mtb com assertividade de 77% na saliva e 96% no soro. A quantificação de citocinas pode auxiliar no diagnóstico de Tb. Para validação dos peptídeos sintéticos, TBC10 e TB2C10 foram testados em imunoensaios pra detecção de IgA específica de tuberculose presente em saliva. Ambos foram capazes de discriminar doentes de saudáveis com sensibilidade de 94,12% e especificidades 76,92% e 84,62%, com valores de p<0,0001. Foi realizado um biopanning de anticorpo para caracterização molecular dos ligantes de IgA específica de Tb, a partir de um fago C10. Obteve-se um scFv (fragmento variável de cadeia única) capaz de se ligar a TBC10, TB2C10 e a proteínas de Mtb, o que permitiu delinear os prováveis epítopos de proteínas de Mtb reconhecidos pela IgA. SELEX foi utilizado para selecionar moléculas de DNA ligante de TBC10 e TB2C10. Quatro aptâmeros apresentaram capacidade de reconhecer os biomarcadores e também proteínas de Mtb. Tanto o scFv quanto os aptâmeros de DNA selecionados a partir dos biomarcadores puderam reconhecer proteínas de Mtb, confirmando a fidelidade dos epítopos das proteínas e dos biomarcadores. Os biomarcadores TBC10 e TB2C10 apresentaram alto potencial de aplicação para diagnóstico de Tb através da saliva, os aptâmeros, úteis para confirmação da identidade dos epítopos ligantes a IgA, apresentaram potencial para fins diagnósticos e terapêuticos, assim como os scores utilizados a partir da expressão de citocinas em soro e saliva permitem predizer a infecção ativa de tuberculose. / Tuberculosis (TB) is a heterogeneous infection caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), with high mortality rates. The main diagnostic method consists of bacteriological findings, lacking more effective alternatives. Accuracy, agility and accessibility in diagnosis are crucial for the containment of infectious flow. In this work, we aimed to characterize the expression pattern of 27 cytokines in the saliva and serum of patients with Tb in association with the time of treatment, to evaluate the application of synthetic peptides, TBC10 and TB2C10, in immunoenzymatic and biosensor assays for the diagnosis of Tb by saliva and select specific protein binding nucleic acids. 27 cytokines, in serum and saliva of 86 individuals, were simultaneously dosed by multiplex kit. The individuals were grouped into TB (untreated patients), TBT (patients undergoing treatment), TBTDO (patients at the end of treatment), PPD + (healthy individuals reactive tuberculin test PPD) and C- (healthy non-reactive to PPD). Nine cytokines presented greater expression in TB than in C-. The expression IL-2, IL-15 and IL-4 in saliva was significantly different between patients and PPD +. All Tb-positive groups had higher expression of IL-2, IL-15, IL-8, IL-9 in saliva than healthy individuals. The values obtained for IP-10 in the serum allowed to distinguish the positive groups from each other and negative, presenting potential for monitoring the treatment of Tb. Six cytokines, IL-13, IL-10, IL-6, IL-2, IL-15 and IL-8 were significantly more expressed in serum than the positive groups. The score associated with the four cytokines with better representativeness in the saliva and the six in the serum allowed to predict Mtb infection with assertiveness of 77% in saliva and 96% in serum. Quantification of cytokines may aid in the diagnosis of Tb. For the validation of the synthetic peptides, TBC10 and TB2C10 were tested in immunoassays for the detection of specific IgA of tuberculosis present in saliva. Both were able to discriminate healthy patients with sensitivity of 94.12% and specificities 76.92% and 84.62%, with values of p <0.0001. An antibody biopanning was performed for molecular characterization of Tb-specific IgA ligands from a C10 phage. A scFv (single chain variable fragment) was obtained capable of binding to TBC10, TB2C10 and Mtb proteins, which allowed to delineate the likely epitopes of Mtb proteins recognized by IgA. SELEX was used to select TBC10 and TB2C10 binding DNA molecules. Four aptamers were able to recognize the biomarkers and also Mtb proteins. Both the scFv and the DNA aptamers selected from the biomarkers were able to recognize Mtb proteins, confirming the fidelity of protein epitopes and biomarkers. The biomarkers TBC10 and TB2C10 presented high potential of application for diagnosis of Tb through saliva, the aptamers, useful for confirming the identity of IgA binding epitopes, presented potential for diagnostic and therapeutic purposes, as well as the scores used from the expression of cytokines in serum and saliva allow prediction of active tuberculosis infection. / Tese (Doutorado)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufu.br:123456789/21217 |
| Date | 31 October 2017 |
| Creators | Morais, Léa Duarte da Silva |
| Contributors | Goulart, Luiz Ricardo, Bessa, Theolis Costa Barbosa, Croda, Julio Henrique Rosa, Silva, Robinson Sabino, Cunha, Thulio Marquez |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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