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Previous issue date: 2006-10-30 / Schistosomiasis, caused by Schistosoma mansoni, is the second most prevalent parasitic
disease worldwide causing chronic disease in millions of people in developing countries.
Similarly, fascioliasis, caused by the trematode Fasciola hepatica, represents a recognized
unsolved agricultural problem responsible for economic losses as well as causing a
significant number of human infections worldwide. Although chemotherapy for both
parasites has been available, this approach has limitations, including high reinfection
rates in endemic areas. Vaccines represent the most attractive long-term alternative to
invert this scenario. Accordingly, the World Health Organization selected S. mansoni fatty
acid-binding protein 14kDa (Sm14) as one out of two anti-schistosome vaccine priority
candidates for human clinical trials. Furthermore, Sm14 is the only vaccine candidate to
have been shown to afford significant immune protection against both of the above-mentioned
helminthes. The objective of this study was to develop and evaluate in mice a
recombinant subunit vaccine containing the Sm14 fused to the B subunit of the heat-labile
enterotoxin of Escherichia coli (LTB), which is a potent immunoadjuvant; furthermore,
was describe the production and characterization of monoclonal antibodies (MAbs)
against the Sm14 for use as a tool to detect and characterize Sm14 and for
development of future diagnostic test. The ltb and sm14 gene were obtained by PCR
amplification from E. coli DNA and plasmid pAESm14, respectively, and fused by PCR.
The recombinant chimera was expressed in E. coli and purified by nickel affinity
chromatography. Groups of outbreed Swiss mice were immunized with three footpad
doses of either rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 plus aluminum hydroxide (Al(OH)3), rSm14 plus
Al(OH)3, rLTB or Al(OH)3. Levels of protection were determined by number of worms
recovered after S. mansoni cercarial challenge. The pooled sera of immunized mice were
evaluated by ELISA and Western blot. The results showed that the chimera protein was
able to elicit specific antibody production to rSm14 and rLTB, however the use of LTB as
adjuvant to rSm14 immunization failed to enhance protection against challenge.
Furthermore, seven MAbs were obtained after immunization of BALB/c mice with
rLTB/Sm14. MAbs isotyping revealed that five were of the isotype IgG1, one belonged to
the IgG2b isotype and another to the IgM isotype. These MAbs will be usefull for
monitoring protein expression in recombinant systems, protein stability and may have
potential for developing diagnostic test. / A esquistossomose, causada por Schistosoma mansoni, é a segunda doença parasitária
mais prevalente no mundo causando doença crônica em milhões de pessoas em países
em desenvolvimento. Semelhantemente, a fasciolose, causada pelo trematódeo Fasciola
hepatica, representa um reconhecido problema agrícola responsável por perdas
econômicas assim como causa um significante número de infecções em humanos por
todo mundo. Embora a quimioterapia para ambos os parasitas esteja disponível, ela
tem apresentado limitações, incluindo altas taxas de reinfecção em áreas endêmicas.
Vacinas representam a alternativa mais atraente para inverter este cenário. Assim, a
Organização Mundial da Saúde selecionou a proteína ligadora de ácidos graxos 14kDa
de S. mansoni (Sm14) como uma de duas candidatas à vacina anti-esquistossomose
prioritárias para triagem clínica em humanos. Além disso, a Sm14 é a única proteína
candidata a vacina que induz imunidade protetora significativa contra ambos os
helmintos acima mencionados. O objetivo deste estudo foi desenvolver e avaliar em
camundongos uma vacina de subunidade contendo a Sm14 fusionada com a
subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), a qual é um potente
imunoadjuvante; além disso, foi descrever a produção e caracterização de anticorpos
monoclonais (MAbs) contra a Sm14 para usa-los como uma ferramenta para detectar e
caracterizar a Sm14 e para o desenvolvimento de futuro teste diagnóstico. Os genes ltb
e sm14 foram amplificados por PCR a partir do DNA de E. coli e do plasmídeo
pAESm14, respectivamente, e fusionados por PCR. A quimera recombinante foi
expressa em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade em coluna com níquel.
Grupos de camundongos suíços não singênicos foram imunizados por via subcutânea
com três doses de rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 mais hidróxido de alumínio (Al(OH)3), rSm14
plus Al(OH)3, rLTB ou Al(OH)3. Os níveis de proteção foram determinados através do
número de parasitas recuperados após desafio com cercárias de S. mansoni. O pool de
soros dos camundongos imunizados foi avaliado por ELISA e Western blot. Os
resultados mostraram que a proteína quimera foi capaz de estimular a produção de
anticorpos específicos para Sm14 e LTB, contudo o uso de LTB como adjuvante para
imunização de rSm14 falhou em aumentar a proteção contra o desafio. Além disso, sete
MAbs foram obtidos após imunização de um camundongo BALB/c com rLTB/Sm14. A
isotipagem dos MAbs revelou que cinco foram do isotipo IgG1, um pertencente ao
isotipo IgG2b e outro ao isotipo IgM. Estes MAbs serão úteis para monitorar a
expressão da proteína em sistemas recombinantes, a estabilidade protéica e pode ter
potencial para desenvolver teste diagnóstico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1241 |
| Date | 30 October 2006 |
| Creators | Hora, Vanusa Pousada da |
| Contributors | CPF:42251850015, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723107D9, Leite, Fabio Pereira Leivas, CPF:20732660025, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763076J5, Aleixo, José Antonio Guimarães, CPF:15711986600, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783342J3&dataRevisao=null, Conceição, Fabrício Rochedo, Dellagostin, Odir Antônio |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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