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Previous issue date: 2015-03-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work is search for cysteine proteases inhibitors using a bioactivity-guided assay. We have selected different plants for the initial screening. Among all evaluated extracts, the ones obtained from Myrcia lingua Berg. showed to be the most potent. Cathepsin B and L are cysteine proteases which play a role in the degradation of extracellular matrix and facilitate tumor progression. Among the obtained inhibitors, flavonoids were the most active against CTSB (IC50 values from 4.9 to 37.2 μM). On the other side, triterpenes were more potent against CTSL (IC50 values from 2.4 to 39.5 μM). The triterpenes showed competitive inhibition and the flavonoids showed uncompetitive inhibition. Aiming to explore enzyme inhibition on tumor cells, we report proteolysis assay using live cell 3D model that allows to localize and to quantify proteolysis in live triple negative breast cancer cells. The natural inhibitors isolated from plants were evaluated against proteases on cell lysate but did not demonstrate good inhibition and we decided to evaluate synthetic cathepsin B inhibitors. A dipeptide nitrile compound (JK_1) was synthesized and then complexed with ruthenium II (JK_2). Caged bioactive molecules that can be active upon irradiation became a strategy to reduce side effects in surrounding tissues and facilitate spatial control over cysteine protease activity. On pure enzyme activity assay JK_2 was less active under dark (IC50 3.4 μM) comparing with light irradiation (IC50 0.3 μM), corresponding to a ratio of 12:1. Proteolysis assay using live cell demonstrated the inhibition of DQ-collagen IV by reducing fluorescence. Thus, the outcomes of this study could contribute to identify new hits for the development of potential anticancer drugs, once live cell imaging proteolysis assay is useful for verifying the efficacy of cathepsin inhibitors prior to testing in in vivo models. / Este trabalho apresenta o estudo biomonitorado de espécies de plantas do cerrado paulista na busca de inibidores enzimáticos de catepsinas B e L. Dentre todos os extratos avaliados, a espécie Myrcia lingua Berg. se destacou pela elevada potência. Para avaliação da inibição enzimática foram selecionadas as catepsinas B e L, que são cisteíno proteases responsáveis pela degradação da matriz extracelular. Foram isolados compostos bioativos de diferentes classes sendo que os flavonoides foram os mais ativos sobre CTSB (IC50 entre 4,9 - 37,2 μM) e os triterpenos mais eficazes sobre CTSL (IC50 entre 2,4 - 39,5 μM). Os triterpenos foram identificados como inibidores competitivos da CTSL e os flavonoides como inibidores incompetitivos da CTSB. Com intuito de realizar investigação mais detalhada ao nível celular, optou-se por realizar ensaios de avalição da proteólise tumoral in vitro em linhagens de câncer de mama triplamente negativa. Os inibidores naturais apresentaram resultados pouco satisfatórios e com isso buscou-se avaliação de inibidores sintéticos de proteases. O composto sintético dipeptídeo nitrila (JK_1), inibidor da CTSB, foi complexado com rutênio II (JK_2) e através da reação de fotoativação buscou-se uma estratégia para delimitar a ação tecidual dos inibidores como forma de obter uma melhor localização do efeito terapêutico na região tumoral. Sobre a catepsina B o inibidor JK_2 foi menos ativo no escuro (IC50 3,4 μM) quando comparado ao exposto a radiação (IC50 0,3 μM) apresentando uma razão de 12:1. Nos ensaios de proteólise tumoral 3D vizualizou-se inibição da degradação de DQ-colágeno IV através da redução da fluorescência. Deste modo, os resultados obtidos contribuem para a busca de novos protótipos, uma vez que os ensaios proteolíticos em células permitem uma avaliação mais detalhada dos inibidores das proteases, antes de serem encaminhados para testes in vivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6341 |
| Date | 27 March 2015 |
| Creators | Ramalho, Suelem Demuner |
| Contributors | Vieira, Paulo Cezar |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
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