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Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Em resposta à uma variedade de estímulos, os eosinófilos são recrutados da circulação para focos inflamatórios, onde modulam a resposta imune, através da liberação de proteínas derivadas dos grânulos secretores. Eosinófilos secretam suas proteínas através de diferentes maneiras de secreção: i) clássica exocitose dos grânulos; ii) desgranulação por piecemal (PMD), um processo de secreção mediada por vesículas de transporte; e iii) a citólise. Estes mecanismos estão bem caracterizadas em humanos, mas ainda são poucos conhecidas em camundongos. Aqui, foram investigados os mecanismos subjacentes a desgranulação de eosinófilos murinos durante as respostas inflamatórias in vivo (modelo de asma) e in vitro (após estímulos pró-inflamatória). Camundongos Balb/c foram imunizados com uma suspensão de ovalbumina (OVA) (50 mg) e Al (OH) 3 (5 mg) em 200 ml de NaCl a 0,9% nos dias 0 (subcutâneamente) e 14 (por via intraperitoneal). Catorze dias depois, os desafios de OVA (50 mg) foram instilados intranasalmente 3 vezes por semana durante 4 semanas. O grupo controle recebeu solução de NaCl 0,9%. Após o tratamento, os fragmentos de pulmão foram fixados e processados para a microscopia de transmissão de eletrônica (MET). Além disso, a interleucina-13 (IL-13), IL-4, a eotaxina-1 (CCL11) e fator de crescimento transformante beta (TGF-\03B2) foram medidos em tecido pulmonar. Nos experimentos in vitro, os eosinófilos foram isolados a partir do baço de camundongos transgênicos para interleucina-5, estimulados com fator estimulante de colônia granulócito-macrófago[GM-CSF (10 ng / mL)], Lipopolissacarídeo [LPS (100 ng / ml)] ou apenas meio, durante 1 h, imediatamente fixada e processada para MET e avaliação da atividade enzimática de ribonucleases. MET revelou uma intensa infiltrado de eosinófilos no pulmão de animais tratados com OVA, mas estas células foram raramente visualizadas em pulmões dos controles
Análise ultraestrutural de 975 grânulos de secreção de eosinófilos do infiltrado inflamatório pulmonar mostrou que 47% destes grânulos tinham sinais desgranulação associados à PMD, caracterizadas principalmente pela redução da densidade de elétrons, perdas na matriz ou núcleos, matriz grossa e / ou ampliação de grânulos. As vesículas foram visualizadas na proximidade de grânulos em esvaziamento. Os níveis de eotaxina-1, IL-4, IL-13 e EPO no tecido pulmonar dos camundongos estimulados com OVA foram significativamente aumentados em comparação com os controles, enquanto os níveis de TGF-\03B2 não se alterou. Eosinófilos do baço estimuladas in vitro com GM-CSF e LPS apresentaram alterações morfológicas e cerca de 20% de grânulos apresentaram sinais de PMD. Não foram encontrados fusões de grânulo-grânulo ou grânulo-membrana plasmática. Curiosamente, foram identificadas por MET uma distinta bainha eletrodensa em áreas específicas da membrana limitante grânulo, uma característica morfológica que pode estar associados com a secreção de eosinófilos murinos. Nossos dados demonstram que os eosinófilos murinos são capazes de desgranular através PMD durante as respostas inflamatórias in vivo e in vitro. Embora as características morfológicas reconhecidos como indicativo de PMD são menos pronunciada camundongos em comparação com aquelas documentadas em seres humanos, estes sinais podem ser detectados em eosinófilos murinos sob investigação cuidadosa por TEM. Além disso, nosso estudo demonstram que outros sinais morfológicos, não descritas para eosinófilos humanos, pode ser útil para compreender os processos de secreção em eosinófilos de modelos experimentais / Mechanisms governing secretion of proteins underlie the functions of human eosinophils, leukocytes
involved in allergic, inflammatory and immunoregulatory responses. In response to varied stimuli,
eosinophils are recruited from the circulation into inflammatory foci, where they modulate immune
responses through the release of granule-derived protein. Eosinophils secrete proteins from their specific
cytoplasmic granules through different secretion pathways: i) classical granule exocytosis; ii) piecemeal
degranulation (PMD), a secretory process mediated by transport vesicles; and iii) cytolysis. These mechanisms
are well characterized in humans, but are still poorly understood in mice. Here we investigated
the mechanisms underlying eosinophil degranulation of murine models during inflammatory responses
in vivo (asthma model) and in vitro (after stimulation with pro-inflammatory stimuli). Balb/c mice were
immunized with a mixed suspension of ovalbumin (OVA) (50 μg) and Al(OH)3 (5 mg) in 200 μL of 0.9%
NaCl on days 0 (subcutaneously) and 14 (intraperitonealy). Fourteen days later, repetitive OVA challenges
(50 μg) were intranasaly instilled 3 times a week during 4 weeks. The control group received 0.9% NaCl
solution. After treatment, lung fragments were fixed and processed for light and transmission electron
microscopy (TEM). Moreover, interleukin-13 (IL-13), IL-4, eotaxin-1 (CCL11) and transforming growth factor
beta (TGF- β) were measured in the lung tissue. For the in vitro experiments, eosinophils were isolated
from the spleen of interleukin-5 transgenic mice, stimulated with GM-CSF (10 ng/mL), LPS (100 ng/mL) or
medium alone for 1h, immediately fixed and processed to TEM. Both light and TEM revealed an intense
eosinophil infiltration in perivascular and peribronchial spaces of OVA-treated animals, but these cells
were rarely observed in control lungs. Ultrastructural analysis of 975 secretory granules from infiltrating
eosinophils showed that 47% of these granules had degranulation signs associated with PMD, characterized
mainly by reduced electron density, losses in the matrix or cores, coarse matrix and/or granule enlargement.
Vesicles were visualized nearby emptying granules. Eotaxin-1, IL-4, IL-13 and EPO levels in the
lung tissue from OVA-stimulated mice were significantly increased compared to controls while the levels
of TGF- β did not change. Spleen eosinophils stimulated in vitro with GM-CSF and LPS exhibited shape
changes and around 20% of emptying granules. Granule-granule or plasma membrane-granule fusions
were not observed in any situation. Interestingly, we identified by TEM a distinct electron-dense brim at
specific areas of the limiting granule membrane, a novel morphological feature which may be associated
with secretion in mice eosinophils. Collectively, our data demonstrate that mouse eosinophils are able to
degranulate through PMD during inflammatory responses occurring both in vivo and in vitro. Although
the morphological features recognized as indicative of PMD are less pronounced in mice compared to
those documented in humans, these signs can be detected in mice eosinophils under careful investigation
by TEM. Moreover, our study demonstrate that other morphological signs, not described for human
eosinophils, may be helpful to understand the secretory processes in eosinophils from mice models.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12855 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Ferreira, Kennedy Bonjour de Oliveira |
| Contributors | Sabbadini, Josiane, Penido, Carmen, Pereira, Mírian Claudia de Souza, Faria, Suzana Côrte-Leal, Rodrigues, Sandra Aurora Chavez Perez, Melo, Rossana Correa Netto de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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