Las líneas de investigación de la presente tesis se encuentran enmarcadas en dos aspectos de la respuesta de los sistemas biológicos ante la presencia de metales. Los sujetos de investigación son tanto (1) elementos individuales (las proteínas denominadas Metalotioneínas), como (2) redes de respuesta global (Metalómica), y su relación e imbricación con el metabolismo celular (Metabolómica). Las metalotioneínas (MT), aunque ubicuas, son probablemente de origen polifilético, de modo que habrían aparecido numerosas “familias de homología” a lo largo de la evolución. El análisis computacional de los miembros de la familia de metalotioneínas en los genomas de Drosophila (5 formas parálogas), en doce especies (12 conjuntos de ortólogos) condujo a la identificación de 60 secuencias de isogenes/proteínas con secuencias de DNA/proteína altamente conservadas. La conservación en el número de isogenes del sistema MT en Drosophila sugiere que la multiplicidad de estos genes es debida a un evento evolutivo anterior a la especiación de este género. A pesar de exhibir una gran plasticidad, la región cromosómica donde se localizan los componentes del sistema de MT en Drosophila, preserva su localización en el elemento Müller E en las doce especies. La arquitectura de los genes, formados por dos exones y un intrón, también se conserva en el conjunto de ortólogos/parálogos. La reorganización identificada en la región cromosómica donde se localizan las isoformas de MT en Drosophila es debida principalmente a eventos de inversión de DNA que implican orientaciones diferentes de los cinco genes. El análisis de las propiedades de coordinación de metales de la isoforma MtnE la clasifican como una Cu-tioneína de carácter intermedio o no extremo, ya que a pesar de formar complejos homometálicos con el Cu, la capacidad de unión de cobre es menor que la observada para el resto de las isoformas. MtnE muestra la capacidad coordinante menos específica, en comparación con el resto de isoformas, lo que sugiere una función fisiológica relacionada con condiciones en las que se necesite un péptido con amplio espectro de coordinación de metales, por ejemplo condiciones de toxicidad mixta por varios metales, o elevado nivel de toxicidad de Cu en los que apoyaría la acción del resto de isoformas. Además se identificaron dos secuencias (BfMT1 y BfMT2) como potenciales MT en el genoma de Branchiostoma floridae, organismo procordado ubicado en la base evolutiva de los vertebrados. Las secuencias de ORFs, sus regiones reguladoras, y correspondientes productos proteicos, mostraron características que los reafirman como potenciales MT. Los genes BfMT1 y BfMT2 fueron identificados in vivo mediante RT-PCR sobre RNA total de organismos de Branchiostoma lanceolatum. Ambos genes se inducen in vivo en B. lanceolatum en condiciones de exceso de metales (Cd o Cu), mostrando BfMT1 un patrón correspondiente a un gen de expresión basal o constitutiva, mientras que la expresión de BfMT2 se corresponde con la de un gen inducible. El tratamiento de organismos vivos con distintas concentraciones de Cd demostró que en condiciones de exceso de este metal, se produce además una disrupción en la homoestasis del zinc. En cuanto a los elementos de respuesta global, desarrollamos el estudio genómico y transcriptómico de las redes de respuesta de S. cerevisiae como organismo modelo ante dosis excesivas de Zn que alteran sus equilibrios homeostáticos. Resultados previos de nuestro grupo mostraron una interrelación entre las vías metabólicas de respuesta a estrés de Zn y aquellas de distintos metales. Análisis de varios mutantes tolerantes a zinc nos permitió identificar una imbricación relevante entre procesos metabólicos vitales como la respiración, la respuesta a estrés oxidativo, la estabilidad del DNA mitocondrial y la tolerancia a zinc mediante redes de respuesta y señalización global que implican interconexiones de proceso / This thesis is framed in two aspects of the of biological systems responses to metals. The subjects of research are: (1) individual elements (proteins called Metalothioneins), and (2) networks of global response (Metallomics), and their relationship and overlap with cellular metabolism (metabolomics). Computational analysis of the members of the family of MTs in the genomes of Drosophila (5 forms parálogas), twelve species (12 sets of orthologous) led to the identification of 60 isogenes/proteins with highly conserved sequences and architecture of DNA/protein sequences. All the components of the MT system are located in the Müller E element in the twelve species. The MtnE isoform is classified as a not extreme Cu-thionein, despite forming homometallic complexes with the Cu. MtnE shows the less specific coordinating capacity compared with the rest of isoforms, suggesting a physiological function related to the need for a peptide with a broad spectrum of coordination of metals. We also identified two sequences (BfMT1 and BfMT2) as potential MTs in the genome of Branchiostoma floridae. ORFs sequences, their regulatory regions, and corresponding protein products, showed characteristics which confirm them as potential MT. The BfMT1 and BfMT2 genes were identified in vivo using RT-PCR on total RNA from Branchiostoma lanceolatum. Both genes are induced in vivo in B. lanceolatum in excess of metals (Cd or Cu) conditions, showing BfMT1 a pattern corresponding to a basal or constitutive expression gene, while the expression of BfMT2 corresponds with an inducible gene. The treatment of living organisms with different concentrations of Cd showed that under conditions of excess of this metal, there is also a disruption in zinc homoestasis. With respect to the elements of global response, we studied the metabolic responses of S. cerevisiae to high zinc. Previous results of our group showed an interconnection of zinc related metabolic pathways and those related to other metals. Analysis of several mutants tolerant to high zinc allowed us to identify a significant overlap between metabolic life processes such as respiration, oxidative stress response, stability of mitochondrial DNA and tolerance to high zinc through networks of response and global signalling involving interconnected processes.

Drosophila es un modelo versátil para entender las bases genéticas de la señalización celular. En particular, el ojo compuesto de Drosophila proporciona un tejido ideal para estudiar los mecanismos de integración de señales que dirigen la formación de la red de neuronas fotorreceptoras. La vía de Ras/MAPK está involucrada en la determinación de todos los fotorreceptores, pero es particularmente necesaria para la especificación del fotorreceptor R7, ya que su ausencia determina la transformación del R7 en una célula no neural. De manera que durante el desarrollo del ojo, Ras media la decisión entre la diferenciación neural y no neural. Sin embargo, se desconoce el perfil de genes activados por Ras. Con el objetivo de describir este perfil, hemos realizado microarrays comparando diferentes alelos del receptor tirosina quinasa Sevenless (Sev) que participa en la especificación del R7 mediante la activación de la vía de Ras / MAPK. Uno de los genes que responden a la activación de Sev es el gen amyloid protein precursor-like (Appl). El incremento de la expresión de Appl detectado en los microarrays, también se confirmó por hibridación in situ. En un estudio detallado de localización de la proteína, observamos que aunque está presente en todos los fotorreceptores, hay más proteína Appl en R7 y R8, que en los otros. Para evaluar si Ras es necesario para la activación de Appl, realizamos clones con el alelo dominante negativo del gen Epithermal Growth factor Receptor (DERDN). En estos clones no se detectó Appl, mientras que los clones del alelo constitutivamente activo de Ras; RasV12 dieron lugar a la sobreexpresión de Appl. En cualquier otro tejido, RasV12 no produjo expresión ectópica, indicando que Ras es necesario y suficiente para la expresión de Appl aunque esta regulación es dependiente del dominio del ojo. Para ver si el factor de transcripción de la vía; Pnt, es capaz de unirse a Appl para activar su expresión realizamos clones con el alelo de pérdida de función pntΔ88. Estos clones mostraron que la falta de pnt tiene como resultado la ausencia de Appl. En segundo lugar evaluamos la posible unión directa de Pnt a Appl mediante transgénicos de regiones supuestamente enhancers de Appl unido a un promotor mínimo y al gen reportero lacZ. Ninguna de las construcciones fue capaz de dirigir la expresión de lacZ en ojo, sin embargo dos de ellas fueron capaces de dirigirla en cerebro, sugiriendo que estas dos secuencias actúan como unidades reguladoras de la expresión de Appl. Ya que no produjeron expresión en ojo, decidimos sensibilizar la respuesta de las construcciones a Ras, incrementando la actividad de la vía mediante clones RasV12. En este nuevo contexto, los dos ETS que tenían expresión en cerebro, fueron capaces de dirigir la expresión de lacZ. Además la unión de pnt a Appl se confirmó mediante experimentos de InmunoPrecipitación de la Cromatina (CHIP). Ras en ojo es responsable de la determinación de casi todos los fotorreceptores, sin embargo observamos que mientras que la determinación no está afectada en mutantes Appld, sí lo está el funcionamiento del R7. Este fotorreceptor es el único capaz de ver la luz ultravioleta. Mediante experimentos de comportamiento observamos que las moscas Appld tienen disminuida la capacidad de discernir la luz UV. Esta reducción es debida en parte porque el 2% de los axones de R7 de moscas Appld no llegan a hacer la sinapsis. Para tratar de incrementar los efectos observados y poder describir con mayor claridad la función de Appl en ojo, testamos la habilidad de los mutantes Appld de discernir el UV, en combinación con mutantes heterocigotos de proteínas descritas en el proceso de guía de axones. La perdida de función de Appl combinada con el mutante heterocigoto del gen neurotactina (nrt), produjo un claro deterioro de la capacidad del R7 para discernir UV y de los axones pare llegar a hacer la sinapsis demostrando que Appl es necesario para la correcta función del R7. / In a genome wide expression profile search for genes that characterize the Drosophila R7 photoreceptor specification we found Appl, the ortholog of human APP and a key factor in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. We analyzed Appl expression in the eye imaginal disc and found that is highly accumulated in R7 photoreceptor cells. The R7 photoreceptor is responsible for UV light detection. To explore the link between high expression of Appl and R7 function, we have analyzed Appl null mutants and found reduced preference for UV light, likely due to mistargeted R7 axons. Moreover, axon mistargeting and inappropriate light discrimination are enhanced in combination with neurotactin mutants. R7 differentiation is triggered by the inductive interaction between R8 and R7 precursors, which results in a burst of Ras1/MAPK activated by the tyrosine kinase receptor Sevenless. Thus, we have studied whether Ras1/MAPK is responsible for the high Appl expression. Inhibition of Ras1 signaling leads to reduced Appl expression, whereas constitutive activation drives ectopic Appl expression. We show that Appl is directly regulated by the Ras/MAPK pathway through a mechanism mediated by PntP2, an ETS transcription factor that specifically binds ETS sites in the Appl regulatory region. Also, the zebrafish appb expression increased after ectopic fgfr activation in the neural tube of zebrafish embryos, suggesting a conserved regulatory mechanism.