På grund av planerat tillverkningsstopp av instrumenten som används idag på Octapharma AB, så syftar detta projekt till nyutvecklingen av en kvantitativ PCR analysmetod för detektion av HIV-1 i human blodplasma, genom TaqMankemi. Projektet inkluderade design, testning och utvärdering av olika set av primer och probe sekvenser. För att säkerställa specificiteten hos metoden designades primrarna och proberna för att vara komplementära till olika konservativa regioner av HIV-1:s genom. Primer och probe set:en (P/P) testades både individuellt och kombinerat i spädningsserier och genotypspaneler. Analyserna visade att det inte fanns någon korrelation mellan felmatchning av P/P och referenssekvenser hos subtyper, och detektionsnivå. När P/P testades i kombination hittades falsk-positiva signaler i negativa kontroller (4 falsk-positiva signaler; n= 106). Detta åtgärdades genom att utesluta specifika prober(0 falsk-positiva signaler; n= 152)(p = 0,030, Fisher’s exact test). Kombinationen av primer och prober, med någraprober uteslutna, hade en högre detektionsnivå för HIV-1 subtyper än de individuella set:en (29 positiva prover vs 23.5; n= 64), och lyckadesäven detektera åtminstone ett positivt prov hos varje subtyp A, B, C, D, AE, F, G och H. Avsaknaden av korrelation mellan felmatchning av P/P och detektionsnivå, visar på att orsaken av den suboptimala detektionsnivån av subtyper var inte på grund av antalet felmatchningar mellan primer och probe set:en till målsekvenserna. Den högre specificiteten vid kombination av P/P indikerar även att primrar och prober som riktar in sig på olika regioner avHIV-1 genomet ytterligare ökar specificiteten och detektionsnivån hos metoden. / As a result of future instrument discontinuation by Octapharma AB’s manufacturers, this project sought to develop a new quantitative PCR analysis method for the detection of HIV-1 in human blood plasma using TaqMan chemistry. The project included the design, testing and statistical analysis of different sets of novel primer and probe sequences. To ensure specificity, the primer and probe sequences were designed to target conserved regions of the HIV-1 genome. The primer and probe sets were tested both individually and in combination in dilution series and genotype tests. Linear regression analyses showed no correlation between mismatches between the primer and probe sets and the subtype reference sequences tested, and detection rate. When the primer and probe setswere tested in combination, false positive signals were obtained in negative control samples (4 false positive signals; n= 106). However, this obstacle was overcome by the omission of certain probes, resulting in no false positive signals (0 false positive signals; n= 152)(p = 0.030, Fisher’s exact test).The combination of primer and probe sets, with certain probes omitted, had an increased HIV-1 subtype detection rate compared to the individual P/P (29 positive samples detected versus 23.5; n= 64), and were also able to detect at least one positive sample from each of the HIV-1 subtypes A, B, C, D, AE, F, G, and H. The absence of correlation between primer and probe set mismatch and detection rate, suggests that the cause of the suboptimal detection rate of the subtypes was not the result of primer and probe set mismatch to the target sequences. The increased subtype detection rate upon combining the P/P also indicates that targeting different region of the HIV-1 genome further improves the detection rate and specificity of the method.

Invasiv äggstockscancer anses vara en av de mest dödligaste gynekologiska maligniteterna. Granulosacelltumör i äggstocken är en sällsynt subtyp av äggstockstumör, som utgör 1–5% av alla äggstockstumörer. De kan kännetecknas av den långsamma tillväxthastigheten och produktionen av höga östrogennivåer. Återfallsfrekvensen efter den första behandlingen är låg, men dödligheten på ett återfall är så hög som 80%. Det är därför av intresse att undersöka nya terapeutiska mål som kan användas för att behandla granulosacelltumör i framtiden. Granulosacelltumörer tros uppstå från de sena preovulatoriska granulosacellerna eftersom de delar liknande egenskaper; de uttrycker follikelstimulerande hormonreceptorer och producerar östrogen som respons på follikelstimulerandehormoner. Östrogen och dess motsvarande kärnreceptorer, östrogenreceptor α och β spelar en avgörande roll i utvecklingen av äggstocksfolliklarna under äggstockscykeln. Uttrycket av östrogenreceptorn α är ganska lågt i granulosacellerna, istället tros östrogenreceptorn β (ERβ/ESR2) spela den övervägande rollen att aktivera intracellulära signalvägar som främjar cellproliferation och överlevnad i äggstocken. Det finns också många varianter av östrogenreceptorn β, främst ERβ1, ERβ2 ibland kallad för ERβcx, ERβ3, ERβ4, och ERβ5. Deras roll i äggstocken är fortfarande okända och har varit svårt att studera eftersom de saknar ligand-bindningsdomänen. DNA-bindningsdomänen är fortfarande bevarad, så de kan fortfarande vara viktiga transkriptionsfaktorer i äggstocken. Nya ChIP-sekvenseringsresultat från en studie visade att ERβ och leverreceptorn homolog 1 (LRH-1/NR5A2) delar många av kromatinbindningsställena i en normal musäggstock. Detta resultat tyder på att dessa två transkriptionsfaktorer troligtvis interagerar med varandra fysiskt eller indirekt. ChIP-qPCR användes för att bekräfta ERβ-varianternas kromatinbindning i den mänskliga granulosatumörcellinjen COV434. Dubbel luciferasanalys användes för att undersöka om ERβ påverkar LRH-1s transaktivering aktivitet. Co-IP utfördes för att undersöka om ERβ och LRH-1 fysiskt interagerar med varandra. Vi kunde bekräfta att ERβ-varianterna ERβcx, ERβ5 och ERβ4 binder till LRP6 genen och att varianterna kan binda direkt till DNA. För att ytterligare bekräfta flera målgener för ERβ-varianterna måste DNA-proverna skickas för sekvensering. Resultaten från denna studie indikerar att ERβ undertrycker LRH-1s transaktiverings aktivitet med eller utan liganden östradiol, hur ERβ fungerar som repressor är fortfarande okänt. Vi kunde inte visa om ERβ fysiskt interagerar med LRH-1 i denna studie. / Invasive ovarian cancer is considered to be one of the most fatal gynecological malignancies. Granulosa cell tumor in the ovary is a rare subtype of ovarian tumor that makes up almost 1-5% of all ovarian tumors. It can be characterized by the slow growth rate and production of high estrogen levels. The recurrence rate after the first treatment is fairly low, but the mortality rate for the recurrence is as high as 80%. Therefore, it is interesting to investigate new therapeutic targets that can be used to treat granulosa cell tumors in the future. Granulosa cell tumors are thought to originate from the late preovulatory granulosa cells because they share similar features; they express follicle-stimulating hormone receptors and produce estrogen in response to follicle-stimulating hormone. Estrogen and its corresponding nuclear receptors, estrogen receptors α and β, play a crucial role in the development of the ovarian follicles during the ovarian cycle. The expression of the estrogen receptor α is relatively low in the nucleus of the granulosa cells; instead, estrogen receptor β (ERβ/ESR2) is thought to play the predominant role of activating intracellular signaling pathways that promote cell proliferation and survival in the ovary. There are also many splice variants of the estrogen receptor β, mainly ERβ1, ERβ2 or also sometimes called ERβcx, ERβ3, ERβ4, and ERβ5. Their role in the ovary is still unknown. Most of the splice variants lack the ligand-binding domain. However, the DNA-binding domain is still preserved, so they could be crucial transcriptional factors of different pathways in the ovary. Recent ChIP-sequencing results from a study showed that two nuclear receptors, ERβ and the liver receptor homolog 1 (LRH-1/NR5A2), share many chromatin binding sites in normal mouse ovary. This finding suggests that these two transcriptional factors may interact with each other physically or indirectly. ChIP-qPCR was used to confirm chromatin binding of ERβ’s splice variants in the human granulosa tumor cell line COV434. Dual luciferase assay was used to investigate if ERβ affects the transactivation activity of LRH-1. Co-IP was performed to investigate if ERβ and LRH-1 physically interact. We could confirm that LRP6 is a target gene of ERβ splice variants ERβcx, ERβ4 and ERβ5. We also demonstrated that these ERβ splice variants bind directly to DNA which has not been shown before. The DNA samples must be sent for further sequencing to confirm more target genes of the ERβ splice variants. The results from this study indicate that ERβ represses the transactivation activity of LRH-1, how ERβ acts as a repressor is still unknown. We could not show whether ERβ and LRH-1 physically interact in this study.

Under covid-19-pandemin har avloppsvattenbaserad epidemiologi (WBE) använts i stor utsträckning som ett komplement till kliniska tester över många delar av världen. Detta projekt syftade till att detektera och kvantifiera belastningen av Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i avloppsvattenprover med hjälp av Revers transkriptas kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR). De analyserade proverna kom från fyra olika avloppsreningsverk i Sverige, under perioden november 2022 till maj 2023. Studien omfattade en översikt över olika provtagnings- och analytiska tekniker och normaliseringsmetoder som används i WBE-studier, vilket betonade vikten av metodval. SARS-CoV-2-RNA upptäcktes i alla analyserade prover och infektionstrender kunde identifieras effektivt, inklusive COVID-19-vågen som observerades under semesterperioden. De dominerande varianterna som upptäcktes under denna övervakningsperiod var omikron variantens undergrupper, BA.2. och BA.2.75. Den veckovisa kvantifierade SARS-CoV-2-belastningen i avloppsvattenproverna visade en signifikant positiv korrelation till de kliniska fall som rapporterats i motsvarande avrinningsområden. Denna associering förstärktes ytterligare genom att normalisera SARS-CoV-2-innehållet med fekal biomarkör peppar milt fläckvirus (PMMoV). Dessutom har två metoder för tidig varning, nämligen medelvärdet plus två standardavvikelser (MSD) och positiv procentuell förändring (PPC), implementerats på avloppsvattendata, vilket pekar på vikten av att tillämpa sådana varningsmetoder för att ge förståeliga och tolkbara resultat. Denna studie ger värdefulla insikter om övervakning och analys av SARS-CoV-2 i avloppsvatten, vilket bidrar till utvecklingen av robusta system för tidig varning och folkhälsostrategier. / During the COVID-19 pandemic, wastewater-based epidemiology (WBE) has been applied extensively as a complementary tool to clinical testing across many parts of the globe. This project aimed to detect and measure the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) load in wastewater samples using Reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The analyzed samples were from four different wastewater treatment plants (WWTPs) in Sweden, covering the period from November 2022 through May 2023. The study encompassed an overview of various sampling and analytical techniques and normalization approaches employed in WBE studies, highlighting the importance of method selection. SARS-CoV-2 RNA was detected in all the samples analyzed, and infection trends could be identified effectively, including the COVID-19 peak observed during the holiday season. The dominant variants detected during this monitoring period were the omicron variants; omicron BA.2. and omicron BA.2.75. The weekly quantified SARS-CoV-2 load in the wastewater samples showed a significant positive correlation to the clinical cases reported in the corresponding catchment areas. This association was further enhanced by normalizing SARS-CoV-2 content with the fecal biomarker pepper mild mottle virus (PMMoV). Furthermore, two early warning methods, namely the mean plus two standard deviations (MSD) and positive percentage change (PPC), were implemented on the wastewater data pinpointing the importance of applying such warning methods to provide understandable and interpretable results. This study provides valuable insights into the monitoring and analysis of SARS-CoV-2 in wastewater, contributing to the development of robust early warning systems and public health strategies.

Les organismes unicellulaires sont très vulnérables aux changements rapides de leur environnement puisqu’ils sont en contact direct avec celui-ci. Les organismes unicellulaires utilisent plusieurs stratagèmes pour réguler l’expression génique et par conséquent, les diverses voies métaboliques nécessaires aux différentes conditions environnementales auxquelles ils sont confrontés. On sait maintenant que certains ARN, dont les riborégulateurs, ont également un grand rôle à jouer dans les processus de régulation de l’expression du génome. En général, les riborégulateurs sont des éléments génétiques situés dans les régions 5’ non traduites (5’ UTR) de l’ARN messager bactérien. Ces éléments possèdent une structure tertiaire bien définie qui est conservée à travers l'évolution. Les riborégulateurs subissent un changement de conformation en s’associant à un ligand spécifique et modulent l’expression des gènes qu’ils contrôlent en aval. Le rôle des riborégulateurs en relation avec le métabolisme des eubactéries peut être d’une grande importance. C’est le cas de Clostridium difficile qui voit son génome régulé par au moins une quarantaine de riborégulateurs. Étant un pathogène nosocomial, causant des infections contractées dans le milieu hospitalier, bien connu pour engendrer des complications au niveau de l’intestin, il est intéressant d’étudier la relation gène-riborégulateur-métabolisme chez C. difficile. De plus, les riborégulateurs ont montré un potentiel intéressant comme cible antibiotique pour combattre certaines infections. C. difficile possède quatre riborégulateurs guanine transcriptionnels qui contrôlent quatre gènes intervenant dans la voie de biosynthèse de la guanosine monophosphate (GMP). Deux de ces gènes interviennent directement dans la voie de synthèse du GMP soit une guanosine-monophosphate synthase (guaA) et une xanthine phosphoribosyltransférase (XPRTase) (xpt) ainsi que deux transporteurs de précurseur nommés CD630_21070 codant pour une perméase uracile/xanthine et CD630_ 27040 une perméase putative. Bien que quelques études ont démontré l’importance que pourrait avoir le gène guaA chez d’autres espèces bactériennes (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus suis et, Salmonella thyphimurium), aucune étude de C. difficile n'a élucidé la relation entre les quatre riborégulateurs guanine et les gènes qu’ils contrôlent, de même que leur rôle au sein du métabolisme du GMP dans un contexte in vivo. Le présent mémoire porte sur l’étude de ces quatre riborégulateurs guanine chez C. difficile, les gènes régulés par ces riborégulateurs et leurs effets sur la biologie de C. difficile. Une fois que les recherches bio-informatiques ont été entreprises, le projet s’est divisé en deux grandes parties soit l’efficacité de régulation des riborégulateurs guanine et l’importance des quatre gènes qui sont sous le contrôle de ces riborégulateurs chez C. difficile 630. Afin de vérifier si les riborégulateurs guanine avaient une affinité acceptable pour leur ligand (guanine), des essais de cartographies chimiques ont été faits et des Kd ont été déterminés. Ces Kd se retrouvent tous dans le bas nanomolaire (nM) de 2,61 ± 1,29 nM pour le riborégulateur guaA et des Kd de 1,78 ± 0,95 nM, de 3,06 ± 0,29 nM et de 4,44 ± 2,75 nM pour les riborégulateurs xpt, CD_21070 et CD_27040 respectivement. Pour la deuxième partie du projet, quatre mutants d’inactivation de gène par insertion ont été conçus grâce à l’utilisation du système ClosTron. Ces quatre mutants, correspondant aux gènes guaA, xpt, CD630_21070 et CD630_27040, ont ensuite été analysés lors d’essais de croissance afin de vérifier les phénotypes associés aux inactivations de gènes. À la suite des résultats d’essais de croissance des divers mutants d’inactivation, une emphase a été mise sur le gène guaA et son riborégulateur puisque ce dernier montrait un phénotype d’inhibition de croissance. L’efficacité avec laquelle le riborégulateur guaA pouvait réprimer l’expression génique a été déterminée lors des essais de gène rapporteur gusA et de PCR quantitative en temps réel. Une baisse de l’expression ligand-dépendante a été observée dans des conditions variant en concentration de guanine. Le mutant de délétion par inactivation du gène guaA a aussi démontré une baisse dans sa capacité d’infecter un modèle murin. En effet, lors d’une étude d’infection en compétition avec le type sauvage, les décomptes cellulaires du mutant guaA étaient diminués de 4 logs. Ces résultats indiquent un rôle fondamental du gène guaA sur le pouvoir infectieux de C. difficile 630 et mettent en évidence l’importance du riborégulateur qui contrôle l’expression de ce gène. Toutes les expériences faites dans le cadre du projet ont été entreprises chez C. difficile 630 afin de garder un contexte plus naturel au cours des analyses. Les résultats présentés ici mettent en évidence le potentiel des riborégulateurs comme cibles antibiotiques. Des travaux futurs devront être effectués afin de vérifier l’effet que pourraient avoir certains analogues de ligands qui ciblent les riborégulateurs guanine sur la viabilité de C. difficile.

Les oomycètes représentent un groupe d’organismes très diversifiés responsables de diverses maladies d’animaux et de plantes. En agriculture le mildiou de la pomme de terre, causé par un oomycète phytopathogène, occasionne à lui seul des pertes économiques mondiales annuelles de 3 à 5 milliards de dollars américains. La lutte contre le mildiou de la pomme de terre et de la laitue, causés respectivement par, Phytophthora infestans et Bremia lactucae, repose en grande partie sur l’utilisation de fongicides. Cependant, l’apparition de nouvelles souches résistantes au métalaxyl a réduit de manière substantielle l’efficacité des fongicides de synthèse. De plus, les fongicides doivent être appliqués au moment opportun pour être efficaces contre le mildiou. L’approche par modélisation constitue donc une option intéressante pour améliorer la lutte contre les mildious en offrant la possibilité de prédire les périodes à risque et d’améliorer la régie d’application des fongicides. Toutefois, l’évaluation de ces modèles a montré qu’ils manquent de précision et que leur efficacité varie d’une année à l’autre. Ce manque de précision peut s’expliquer en partie par l’absence de considération de la présence ou de l’abondance de l’inoculum aérien. P. infestans et B. lactucae produisent un inoculum adapté à la dispersion aérienne. Cependant, il existe un manque de connaissance notable dans la littérature sur l’aérobiologie de ces deux oomycètes phytopathogènes. Un modèle de simulation dynamique qui intègrerait l’information sur l’aérobiologie de l’agent pathogène permettrait de prédire plus efficacement les périodes de risque d’infection par le mildiou. Ainsi, l’objectif général de ce projet de doctorat était d’améliorer la connaissance sur l’aérobiologie de deux oomycètes (P. infestans et B. lactucae) dans l’optique de mieux comprendre et prédire les périodes d’infection du mildiou de la pomme de terre et de la laitue. Dans un premier temps, la distribution spatiotemporelle des spores à l’échelle d’une région de production de monoculture de pommes de terre a été déterminée. Les résultats ont montré que la distribution des spores est hétérogène et l’efficacité des mesures prophylactiques peut être évaluée à l’aide de l’aire sous la courbe de progression de l’inoculum aérien. De plus, l’information dérivée de l’implantation d’un réseau de capteur permet de pondérer le risque d’infection estimé par les modèles prévisionnels. Dans un deuxième temps, la relation entre la concentration aérienne de spores et l’intensité du mildiou a été établie. Cette relation a permis de définir des seuils d’intervention basés sur la concentration aérienne de spores. Dans le pathosystème de la pomme de terre, le seuil d’intervention varie en fonction des lignées clonales de P. infestans alors que dans celui de la laitue, ce seuil ne tient pas compte des lignées clonales de B. lactucae. Un outil moléculaire pour le comptage des spores a été développé pour pallier aux inconvénients liés à la quantification des spores au microscope. Les résultats de cette étude ont montré, entre autres, que sous conditions climatiques au Canada deux heures de mouillure sont suffisantes pour l’établissement d’une infection par B. lactucae, contrairement aux trois à quatre heures de mouillure proposées dans la littérature. Dans un troisième temps, un modèle de simulation de la concentration aérienne des spores a été développé. La relation entre le nombre de spores observées à l’heure et le nombre de spores prédit à l’heure est linéaire. Dans plus de 94% des cas, les coefficients de détermination de la régression entre le nombre de spores observées et celui prédit sont supérieurs à 0,7. Même si ce modèle est une première dans la littérature publiée et représente une avancée significative dans l’aérobiologie des oomycètes, il est à améliorer notamment dans l’optique de pouvoir développer un modèle générique comme outil de recherche pour l’étude de l’aérobiologie des oomycètes phytopathogènes. En effet, l’étape à venir sera d’incorporer ce modèle comme module dans un système de support décisionnel pour prédire efficacement l’apparition des symptômes de mildiou. Les auteurs espèrent que ce modèle constituera la base pour le développement d’un modèle générique pour tous les oomycètes phytopathogènes à dispersion aérienne.

Breast cancer is a disease that afflicts a significant proportion of women globally. 5-10% of breast cancer cases are linked to inherited polymorphisms in critical genes such as BRCA1, a tumour suppressor essential for genomic stability. A dysfunctional BRCA1 gene can increase breast cancer risk by 60-80%. Previous microarray analysis established that differential gene expression in unperturbed Epstein-Barr virus transformed lymphocyte cell lines (EBV-LCL) was able to distinguish BRCA1 mutation carriers from controls with a high degree of accuracy. A 43-gene radiation-independent classifier for BRCA1 status was constructed. We hypothesize that this differential gene expression can be observed in a subset of these genes using quantitative PCR (qPCR) in both EBV-LCL and B-lymphocytes isolated from patients with known BRCA1 mutation carrier status. The 43-gene classifier was analyzed using gene ontology analysis and 4 target genes selected based on predictive value, expression intensity and gene ontology similarity. Genes selected were CXCR3, TBX21, MX2, and IFIT1, with GusB as an endogenous reference gene. EBV-LCL established from known BRCA1 mutation carriers and from BRCA1 wildtype individuals were obtained and RT-qPCR (reverse transcriptase qPCR) performed on isolated RNA. Our results showed significant downregulation of CXCR3 and TBX21 in BRCA1 mutation carriers (p=0.018 and p=0.003, respectively), as expected from previous microarray results. IFIT1, while showing a non-significant upregulation (p=0.183), agreed with the expected trend. MX2 did not show significant differential expression. These results indicate that differential gene expression has the potential to accurately distinguish pathogenic variants, even if it may require EBV immortalization of B-lymphocytes. To determine whether the assay could be extended to fresh blood samples, B-lymphocytes were isolated from patients with known BRCA1 mutation carrier status from North York General Hospital in Toronto, ON. An optimized protocol to enrich the B-lymphocyte population using magnetic separation was developed for this purpose. RT-qPCR using RNA isolated from these lymphocytes showed no significant differential gene expression in CXCR3 and TBX21. However, a low sample size, use of non-sequenced controls and a need for further qPCR optimization may call these results into question. In addition, problems with blood sample transportation from off-site sources resulted in an unacceptable drop in RNA integrity. While this gene expression assay may be limited to screening a small number of blood samples, results indicate that may still have clinical relevance that can be explored. This would necessitate further optimization of the qPCR methodology and resolution of the issues surrounding RNA integrity and sample transport. / Thesis (Master, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2013-09-26 13:13:50.809

Technological and methodological advances in the fields of medical and life-sciences have, over the last 25 years, revolutionised the way in which cellular activity is measured at the molecular level. Three such advances have provided a means of accurately and rapidly quantifying mRNA, from the development of quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), to DNA microarrays, and second-generation RNA-sequencing (RNA-seq). Despite consistent improvements in measurement precision and sample throughput, the data generated continue to be a ffected by high levels of variability due to the use of biologically distinct experimental subjects, practical restrictions necessitating the use of small sample sizes, and technical noise introduced during frequently complex sample preparation and analysis procedures. A series of experiments were performed during this project to pro le sources of technical noise in each of these three techniques, with the aim of using the information to produce more accurate and more reliable results. The mechanisms for the introduction of confounding noise in these experiments are highly unpredictable. The variance structure of a qPCR experiment, for example, depends on the particular tissue-type and gene under assessment while expression data obtained by microarray can be greatly influenced by the day on which each array was processed and scanned. RNA-seq, on the other hand, produces data that appear very consistent in terms of differences between technical replicates, however there exist large differences when results are compared against those reported by microarray, which require careful interpretation. It is demonstrated in this thesis that by quantifying some of the major sources of noise in an experiment and utilising compensation mechanisms, either pre- or post-hoc, researchers are better equipped to perform experiments that are more robust, more accurate, and more consistent.

Il tratto gastro intestinale infantile al momento del parto è considerato virtualmente sterile e viene rapidamente colonizzato da microrganismi di origine materna e/o ambientale nei primi giorni di vita. Studi accoppiati di microbiologia classica e molecolare hanno dimostrato come la cavità amniotica sia popolata da microrganismi alcuni dei quali appartenenti a taxa non ancora coltivati e caratterizzati. Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare la composizione del microbiota infantile durante i primi due anni di vita, in particolare, di popolazioni parzialmente “trascurate”. La tesi è suddivisibile in tre tematiche principali: presenza di popolazioni idrogenotrofiche, la distribuzione della famiglia delle Lachnospiraceae in soggetti sani prima del secondo anno di vita, e la possibile correlazione tra gli archaea metanogeni e la dieta in modello animale. Le tecniche impiegate nel presente lavoro di tesi sono state la PCR-DGGE e la PCR quantitativa (qPCR) e il sequenziamento Illumina. Le principali conclusioni derivabili dai tre studi sono correlate alla necessità di sviluppare nuove coppie di primers che meglio possano descrivere la complessa ecologia delle comunità microbiche intestinali. L’ambizioso obiettivo potrà considerarsi raggiunto quando si potranno identificare e stimare in modo preciso e corretto anche le popolazioni batteriche poco abbondanti nel microbiota intestinale infantile. / At birth, the gastrointestinal tract is virtually sterile, but is rapidly colonized during the first days of life until a relatively stable state is reached. Several studies using both bacterial culture techniques and bio-molecular methods revealed that the amniotic cavity harbors microorganisms and, among them, uncultivated and uncharacterized taxa. The aim of the present PhD thesis was to evaluate the composition of some neglected populations inhabiting the infant gut microbiota until the second year of life. The PhD thesis is composed of three main chapters related to the presence of hydrogenotrophic populations, the occurrence of the Lachnospiraceae family in healthy subjects before the second year and the possible linkage between methanogens and diet in a piglet’s model. PCR-DGGE, the quantitative PCR (qPCR) and the Illumina deep sequencing have been the prevalent molecular techniques used in this work. Main conclusions obtained from these studies were mainly linked to the need of new primer sets that better describe the ecological complexity of the gut microbial community. This ambitious objective will be reached when it is possible to properly identify and quantify less represented bacterial populations within the infant gut ecosystem.

Our experimental organism Fascioloides magna is a digenetic liver fluke from Fasciolidae family which parasitizes in domestic and free-living ruminants of North America and Central Europe including Czech Republic. In Czech Republic this highly pathogenic worm causes a severe liver damage to cervids and bovids and the prevalence locally reaches up to 95%. The biology of F. magna including e.g. the characteristics of host-parasite molecular interaction and the functions of particular molecules produced by the parasite are not fully understood. According to results of our previous research the excretory-secretory products of F. magna adults contain number of molecules which play the crucial role in host tissue invasion, digestion and evasion of the host immune response. One of the most abundant is cysteine peptidase cathepsin L (FmCL). FmCL is supposed to play various key roles in biological processes of all stages during a life cycle and therefore we can suppose its different expression level in particular life stages. In order to define the expression level of FmCL we performed the pilot study with miracidia and adults where the qPCR method was applied. The results of this experiment revealed much higher expression level of FmCL1 in adults than in miracidia. The attempt to in situ localize the mRNA...

The diploma thesis is focussed on understanding relationships between soil chemical characteristics, actinobacterial communities of agricultural field soils and occurrence of potato common scab, a disease caused by members of the genus Streptomyces. The aim of monitoring study, on thirty-three sites covering main potato- growing regions in the Czech Republic, was to find relationships suitable for prediction of common scab severity. The second part of the thesis compared actinobacterial communities and incidence of Streptomyces harboring a pathogenic determinant, gene txtA (gene of biosynthetic pathway of phytotoxin thaxtomin A), in soils differing in occurrence of common scab. In the screening study, analysis of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) was employed to compare composition of soil actinobacterial communities. Real-time PCR was used to quantify total actinobacteria and streptomycetes harboring txtA gene in soils differing in scab incidence. The screening study revealed negative correlations between the scab severity and (i) available phosphorus in soil and (ii) diversity of actinobaterial community. The results were used to design a model for scab prediction. A qPCR analysis showed difference in numbers of total actinobacteria and the strains harboring txtA gene in...