L’objectif de ce travail était de caractériser la variabilité spécifique (Bos taurus vs Oryctolagus cuniculus), individuelle, spatiale (inter- et intra- fermenteurs digestifs) et temporelle (en conditions non perturbée ou perturbée) des écosystèmes digestifs des mammifères herbivores (communautés procaryotiques et biotope) en comparant deux modèles animaux, la vache et le lapin, et en utilisant des outils moléculaires (CE-SSCP et qPCR). D’un point de vue méthodologique, nous avons développé un programme informatique, StatFingerprints, pour améliorer le traitement et l’analyse statistique des profils CE-SSCP et ainsi mieux extraire l’information écologique qu’ils contiennent en termes de structure et de diversité des communautés. Nous avons également mis au point des systèmes de qPCR plus spécifiques (Firmicutes et Bacteroides Prevotella) que ceux précédemment décrits. D’un point de vue cognitif, nos travaux démontrent une forte influence de l’espèce hôte sur les caractéristiques de son écosystème : les communautés sont plus riches (+8 %, +12 % pour les bactéries et les Archaea, respectivement), plus diverse (+19 % pour les bactéries) mais moins abondantes (-4.9 % de bactéries) dans le rumen de la vache que dans le caecum du lapin. Le biotope ruminal est moins acide (+0.6 unité pH), plus réducteur (-30 mV), et contient moins d’acides gras volatils (-19%) et plus de NH3-N (+39%) que le biotope caecal. Cela suggère un rôle déterminant de la physiologie digestive de l’hôte et/ou des phénomènes de coévolution hôte/microbiote. Nos travaux n’ont pas permis de mettre en évidence un effet de « l’individu hôte » sur les caractéristiques de sa communauté microbienne suggérant que la proximité génétique entre les individus (race) et/ou la forte standardisation des conditions d’élevage (logement, alimentation etc.) tendent à uniformiser l’influence des individus sur le déterminisme de leurs communautés procaryotiques. Nous avons montré qu’il existe une évolution des communautés microbiennes le long du tractus digestif en relation avec la physiologie et les conditions environnementales des différents compartiments à laquelle s’additionne, dans le rumen, une variabilité liée à la fraction, liquide ou solide, considérée. Nos données suggèrent qu’à l’état basal et en situation de perturbation, les communautés procaryotiques des deux espèces hôtes n’évoluent pas de la même façon dans le temps. Ainsi, dans le rumen de la vache, la communauté bactérienne fluctue de façon sporadique suggérant un état d’équilibre dynamique alors qu’elle reste dans un état d’équilibre statique dans le caecum du lapin. Les deux communautés réagissent de façon rapide (< 2jours) et s’adaptent rapidement à une augmentation du ratio amidon/fibres pour atteindre un nouvel équilibre, dynamique dans le rumen et statique dans le caecum. En revanche, nos travaux n’ont pas mis en évidence de corrélations importantes entre les communautés bactériennes et les paramètres de leur environnement. D’un point de vue finalisé, ces données confirment que la nutrition est une voie d’action pertinente pour essayer de réorienter le fonctionnement des écosystèmes digestifs chez ces espèces d’intérêt zootechnique, vers une meilleure santé et/ou efficacité digestive. / The aim of this work was to characterize the specific (Bos taurus vs Oryctolagus cuniculus), individual, spatial (inter- and intra- digestive fermentors) and temporal (in undisturbed or disturbed conditions) variability of the digestive ecosystems (prokaryotic communities and biotope) in herbivorous mammals by comparing two animal models, cow and rabbit, and by using molecular methods (CE-SSCP and qPCR). Concerning methodology, we developed the StatFingerprints program to improve processing and statistical analysis of CE-SSCP profiles and better extract ecological information they contained about structure and diversity of communities. We also developed more specific (Firmicutes and Bacteroides Prevotella) primers than those available. From a cognitive point of view, our work demonstrated a strong effect of host species on ecosystem: communities presented a higher richness (+8 %, +12 % for bacteria and Archaea, respectively), a greater diversity (+19 % for bacteria) but are less abundant (-4.9 % bacteria) in cow rumen than in rabbit caecum. The rumen biotope is less acid (+0.6 pH unit), more reductive (-30 mV), and contains a lower concentration of fatty acids (-19%) and a higher concentration of NH3-N (+39%) than caecal biotope. Taken together, these results suggested a determining role of the digestive physiology of the host and of coevolution phenomena between the host and its microbiota. Our results did not permit to evidence an individual effect on the procaryotic communities suggesting that the genetic similarity between animals we used and/or the strong standardization of breeding conditions (housing, food etc) tended to reduce the influence of the individuals on their prokaryotic communities. We showed that the procaryotic communities evolved along the digestive tract in relation to the physiology and the environmental conditions of the various compartments in which they live. In addition, in the rumen, we evidenced a variability of the bacterial community related to the fraction considered, liquid or solid. Our data suggested that, both in basal and disturbed situations, the bacterial communities of the two host species did not evolve in the same way in time. Indeed, in the rumen of the cow and basal condition, the bacterial community fluctuated sporadically suggesting a dynamic balance whereas it remains in a stable state in the caecum of the rabbit. The two communities reacted quickly (< 2 days) and adapted quickly to an increased ratio starch/fibres to reach a new balance, dynamic in the rumen and stable in the caecum. On the other hand, our work did not highlight important correlations between the bacterial communities and the parameters of their environments. From a finalized point of view, these data confirmed that the nutrition is a relevant way to try to reorientate the functioning of digestive ecosystems in these two species, toward a better digestive health and/or efficiency.

La tuberculose bovine est une maladie infectieuse contagieuse causée par Mycobacterium bovis. Cette maladie touche les bovins et de nombreuses espèces de mammifères domestiques et sauvages, ainsi que l’homme. La circulation de la bactérie dans des systèmes multi-hôtes variés favorise l’entretien de la maladie et la contamination des bovins vivant à proximité des animaux sauvages infectés. En marge de la transmission directe de M. bovis par voie respiratoire, la transmission indirecte aux bovins, liée à l’inhalation ou à l’ingestion de matrices environnementales contaminées par un animal infecté excréteur, est suspectée dans plusieurs régions du monde. L’existence de réservoirs environnementaux où le bacille M. bovis est capable de persister, pourrait donc être un facteur important de la réémergence puis du maintien de la maladie dans les systèmes multi-hôtes.En Côte d’Or, département fortement touché par la tuberculose bovine depuis 2004, la transmission indirecte de la bactérie entre la faune sauvage infectée et les bovins est suspectée dans plusieurs élevages. Pour évaluer la présence et la survie de cette bactérie dans l’environnement, nous avons analysé un grand nombre d’échantillons prélevés dans des zones partagées par les bovins et/ou la faune sauvage infectés dans le but de déterminer la distribution environnementale de M. bovis. Pour ce faire, nous avons développé ou modifié des systèmes de détection moléculaire adaptés aux matrices environnementales complexes. Nous avons également évalué l’impact de la température et des propriétés physico-chimiques de deux sols sur la survie de M. bovis, ainsi que le rôle de la mésofaune du sol (lombrics en particulier) dans la dissémination de la bactérie à partir de matière organique contaminée. L’étude environnementale a mis plus particulièrement en évidence la contamination de deux biotopes: les zones humides des pâtures et les sols de terriers de blaireaux. De plus, les études expérimentales ont montré que M. bovis pouvait survivre plusieurs mois dans le sol à 4°C et que les lombrics pouvaient disséminer la bactérie dans le sol, voire jouer un rôle potentiel de vecteur pour les animaux qui les consomment. Ces résultats apportent de nouvelles connaissances sur la persistance et la circulation de M. bovis dans l’environnement en Côte d’Or et permettront de proposer des améliorations aux mesures de biosécurité déjà existantes dans les élevages bovins. / Bovine tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium bovis. This disease affects cattle, and many species of domestic and wild mammals, and humans. The circulation of the bacteria in various multi-host systems promotes the maintenance of the disease and the contamination of cattle in the vicinity. Beside direct transmission of the bacteria through the respiratory route, indirect transmission, through inhalation or ingestion of environmental matrices contaminated by an infected animal excretory, is suspected in several countries. Environmental contamination with M. bovis appears to be a crucial factor in the persistence of the infection in multi-host systems.In Côte d'Or, a French department affected by bovine tuberculosis since 2004, the indirect transmission of the bacteria from infected wildlife to cattle is suspected in several cases. To assess this type of transmission of the bacillus, we evaluated the environmental contamination with M. bovis on a large number of samples taken in areas shared by cattle and / or wildlife infected. For this purpose, we developed or modified molecular detection systems adapted for environmental complex matrices. We also assessed the impact of physicochemical properties of both soil and temperature on survival of M. bovis and the role of earthworms in the spread of the bacteria from contaminated organic material. The environmental study showed the contamination of two media in particular: wetlands pastures and soil badger setts. Moreover, experimental studies have shown that M. bovis can survive in soil for several months at 4 ° C and the worms could spread the bacteria in the soil, or even play a potential role for vector animals that consume them. These results will propose improvements to existing biosecurity measures on cattle farms and provide new knowledge about the persistence and circulation of M. bovis in the environment in Côte d'Or.

Sur la seule base de critères cliniques et anatomopathologiques, l’évolution des tumeurs superficielles de la vessie (TSV) est imprévisible. Aucun marqueur ne permet, à ce jour, l’identification des tumeurs à fort potentiel de récidive et d’évolution vers des formes agressives. Dans une première partie, nous avons étudié, chez 127 patients, le polymorphisme des microsatellites dans les cellules urinaires pour la mise en évidence de pertes d'hétérozygotie (LOH, Loss Of Heterozygosity) et 2- en tant que marqueur de suivi. Les résultats ont été comparés à la cytologie urinaire : la sensibilité des LOH est nettement supérieure à celle de la cytologie dans les TSV. La présence de LOH au niveau de TP53 et des marqueurs du chromosome 9p est associée à un risque accru de récidive. Parmi les patients ayant récidivé, l’étude des LOH était positive dans 78% des prélèvements urinaires. Dans 20% des cas, les LOH se sont positivées avant la récidive visible à la cystoscopie. Dans une deuxième partie, nous avons développé une technique urinaire quantitative rapide pour l’étude des profils de méthylation de promoteur de 5 gènes suppresseurs de tumeur. Les résultats prometteurs (sensibilité=62%) de la qPCR-HRM sont corrélés à la technique de référence et pourraient être améliorés en élargissant le panel de gènes étudiés. L’analyse des altérations génétiques et épigénétiques améliore la compréhension des mécanismes de la carcinogenèse dans les carcinomes urothéliaux. Ces altérations pourraient être utilisées comme marqueurs diagnostiques et pronostiques. La biologie moléculaire pourrait trouver toute sa place dans la prise en charge de cette pathologie. / On the basis of clinical and pathological criteria, the evolution of superficial bladder tumours (SBT) is unpredictable. Currently, no marker exists permitting the identification of tumours with high potential for recurrence and progression to more aggressive forms. Firstly, we looked for loss of heterozygosity (LOH) at microsatellite polymorphisms in the bladder cells of 127 patients, with the aim of identifying a marker potentially useful in 1) diagnosis and prognosis and 2) the monitoring of patients following trans-urethral resection. Compared to urine cytology, the sensitivity of LOH detection was significantly higher for SBT. The presence of LOH at TP53 and markers of chromosome 9p was associated with an increased risk of recurrence. Among the patients who relapsed, results of LOH analysis were positive in 78% of urine samples, 20% of which were positive before the relapse was detected by cystoscopy. Secondly, we developed a technique for the rapid and quantitative urinary analysis of patterns of promoter methylation of 5 tumour suppressor genes. The promising results (sensitivity of 62%) of the qPCR-HRM correlate well with the gold standard and could be improved by expanding the panel of genes studied. Analysis of genetic and epigenetic alterations improves the understanding of mechanisms of carcinogenesis in urothelial carcinomas. These alterations could be used as diagnostic and prognostic markers. Molecular biology could therefore prove useful in the management of this pathology.

La pourriture bleue causée par Penicillium expansum est l'une des maladies les plus dommageables des fruits pomaceae (pommes et poires). Outre des dégâts directs, cette maladie pose un problème de santé publique car l'agent pathogène produit des mycotoxines nocives pour l'homme et les animaux dont la plus sérieuse est la patuline. La croissance du champignon pathogène et la production de patuline requièrent des conditions physico-chimiques particulières. Les informations existantes à ce propos demeurent cependant modestes et insuffisantes pour envisager de développer des moyens de lutte contre l'apparition du champignon. Par ailleurs, la patuline reste avec l'ochratoxine A, les seules toxines dont la voie de biosynthèse n'a pas encore été complètement établie, tant sur le plan chimique que moléculaire. Cette étude apporte dans un premier temps des données complémentaires sur les facteurs physico-chimiques (température, pH….) qui conditionnent la croissance de P. expansum de même que sa capacité à produire la patuline. La connaissance de ces besoins et de ces conditions conduit en pratique à lutter et contrôler la contamination par la patuline tout le long de la chaine alimentaire. Dans un deuxième temps, cette thèse apporte des améliorations spectaculaires sur le plan fondamental, en termes d'élucidation de la voie de biosynthèse de la patuline. Le cluster des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette mycotoxine chez l'espèce la plus préoccupante P. expansum a été entièrement identifié et caractérisé. Pour lever encore plus le voile sur la biosynthèse de cette mycotoxine, la caractérisation du facteur de régulation spécifique de cette voie (patL) a été également établie. Une perturbation de ce gène a provoqué une incapacité de production de patuline et une sévère diminution de l'expression des gènes Pat. De même, grâce à ce mutant déficient, il a été montré que la patuline pourrait agir comme facteur de virulence lors du développement de la moisissure dans les pommes. La caractérisation de la dernière étape de la voie de biosynthèse de la patuline a ensuite été entreprise par mutagenèse dirigée du gène patE du cluster de la patuline, chez la même espèce. Ce dernier code pour une Glucose méthanol Choline (GMC) oxydoréductase responsable de la conversion de l'ascladiol en patuline. L'ascladiol est également une molécule clé de la dégradation de la patuline par diverses espèces bactériennes ou de levures et plus particulièrement lors de la fermentation alcoolique. La non-toxicité de l'ascladiol accumulé chez le mutant ∆patE a été démontrée sur une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2), suggérant que la patuline perd sa toxicité avec l'ouverture du deuxième cycle. Finalement, un système de détection et de quantification de P. expansum par PCR en temps réel a été développé en ciblant un gène hautement spécifique de la voie de biosynthèse de la patuline, patF. Cette approche préventive nous a ainsi permis d'avoir une estimation rapide de la contamination en patuline dans les pommes à partir de la quantification d'ADN de P. expansum. En conclusion, l'ensemble de ces travaux qui s'inscrivent dans le cadre de la gestion du risque « patuline » dans la filière fruit a permis d'amener des réponses tant sur le plan fondamental que sur le plan appliqué avec le séquençage du cluster, le développement d'un outil de diagnostic et la démonstration que l'ascladiol ne présentait aucune cytotoxicité. / Among diseases affecting apples, blue mold caused by Penicillium expansum is a major concern causing yield and quality losses due to the production of mycotoxins, of which patulin is the most alarming one. This mycotoxin was proven to be harmful for humans and animals. The pathogen growth and the patulin production occur under specific physico-chemical conditions (temperature, pH…). However, the description of these conditions in literature remains largely insufficient for the development of strategies to fight the development of the fungus. Furthermore, patulin remains, along with ochratoxin A, the only toxins for which the biosynthetic pathway is not fully established yet at both chemical and molecular levels. Firstly, this study provides supplementary data on the physico-chemical factors that modulate P. expansum growth and its ability to produce patulin. The acquaintance of these conditions leads, in practice, to the control of the patulin contamination along the food chain. Secondly, significant improvements were brought on the fundamental level, especially by elucidating the patulin biosynthetic pathway. The cluster of genes involved in the biosynthesis of this mycotoxin was fully identified and characterized in the species of greatest concern P. expansum. In order to reveal additional info on the biosynthesis of this mycotoxin, the specific factor of the pathway (patL) was characterized. The disruption of this gene has led to failure in patulin production and an important decrease in Pat genes expression. Furthermore, pathogenesis studies, using this same deficient strain showed that patulin potentially acts as a virulence factor during P. expansum development on apples. The last step of the patulin biosynthetic pathway was later characterized by site-directed mutagenesis of the patE gene in the same species. This gene encodes a Glucose Methanol Choline (GMC) oxidoreductase that is responsible for the conversion of ascladiol to patulin. Ascladiol is not only the last intermediate in the patulin pathway but also the main product of patulin degradation during the alcoholic fermentation of apple juice. The non-toxicity of ascladiol accumulated by the ΔpatE strain was proved against the human Caco-2 cell line. Finally a Real time PCR assay was developed to specifically detect and quantify P. expansum. This was done by targeting a highly specific gene from the patulin gene cluster in P. expansum, patF. This predictive approach allowed the quick estimation of the patulin content via the quantification of the P. expansum DNA in apples. To conclude, this thesis is part of the patulin's risk management study in the fruit sector; it provides significant improvements on both fundamental and practical levels. These advances are mainly characterized by the sequencing of the patulin gene cluster, the development of a molecular diagnostic tool and the demonstration of the non-cytotoxicity of ascladiol.

The aim of this work was to compare authenticity analysis in selected food products with fruit component by using, instrumental and molekular methods. Particularly, the presence of blueberries in fruit–based foodstuffs was verified. The theoretical part is focused on the characterization, chemical composition and botanical classification of blueberries (European blueberry and Canadian blueberry). It also contains an overview of instrumental and molecular diagnostic methods that can be used for the analysis of these fruits. The experimental part focuses on the selection of a suitable method of DNA isolation, and primers for the detection of blueberries in commercial products. DNA analysis was performed by qPCR and HRM analysis. In the experimental part, DNA was isolated in sufficient quality for PCR and the presence of blueberries in foodstuffs was verified by qPCR. Using HRM analysis, we were able to differentiate between bilberry (Vaccinium myrtillus) and blueberry (Vaccinium corymbosum) in control samples and in some commercial products. Certain phenolic acids and some flavonoids specific for blueberries were detected by HPLC. The total content of polyphenols and flavonoids was determined by UV / VIS spectrophotometry.

Circoviren sind kleine, unbehüllte Viren mit einem einzelsträngigen zirkulären DNA Genom mit eine Größe von 1,7 bis 2,4 kb. Das Porcine Circovirus Typ 2 (PCV2), welches zum Genus Circovirus gehört, ist mit einer Anzahl von Krankheitsmanifestationen verbunden worden, die heute als Porcine Circovirus Assoziierte Krankheiten (PCVAD) zusammengefasst sind. Die PCV2-Infektion bei Rindern ist bis zum jetzigen Zeitpunkt marginal erforscht worden. Serologische Untersuchungen auf Circovirus spezifische Antikörperführten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Im Jahr 2007 wurde von der Bovinen Neonatalen Panzytopenie (BNP) in Europa mit unklarer Genese berichtet. Das klinisch - pathologische Bild der Hämorrhagien ähnelte dem Krankheitsbild der Infektiösen Anämie, welche durch ein Circovirus bei Hühnern verursacht wird. Deshalb wurde in dieser Studie eine Breitspektrum PCR zum Nachweis von Cirocvirus-Genomen durchgeführt. In 5 von 25 BNP betroffenen Kälbern konnte circovirale DNA nachgewiesen werden. Das komplette Genom wurde nachfolgend amplifiziert, kloniert und sequenziert. Das nachgewiesene Genom (PCV2-Ha08) hat eine Länge von 1768 Nukleotiden und zeigte eine hohe Homologie (bis zu 99%) mit PCV2-Genotyp b (siehe Publikation 1). Als Ursache der BNP ist vor kurzen die Übertragung von Alloantikörpern über das Kolostrum beschrieben wurden, welche die Zerstörungen von Leukozyten und Thrombozyten sowie deren Vorläuferzellen bewirken. Ungeachtet dessen war es wichtig, die Empfänglichkeit und Immunantwort von Kälbern nach experimenteller Infektion mit PCV2 zu studieren. Für diesen Zweck wurden weitere 181 Proben von BNP-Kälbern aus Deutschland mit Hilfe einer Breitspektrum-PCR getestet. In zwei von 181 Proben wurde PCV2 DNA nachgewiesen. Die vollständigen Sequenzen konnten amplifiziert werden. Während das erste Genom aus einer Blutprobe eines Kalbs in Bayern stammte (PCV2-Ha09), stammte das zweite nachgewiesene Genom aus Lunge und Gehirn von einem Kalb in Sachsen (PCV2-Ha10). Das Genom (PCV2-Ha09) besteht aus 1768 nt, währenddessen das Genom (PCV2-Ha10) aus 1767 nt aufgebaut ist (siehe Publikation 2). Weiterhin wurden die PCV2 Empfänglichkeit und die Immunantwort von Kälbern durch experimentellen PCV2 Inokulation sowie die Möglichkeit, eine Serokonversion nach Impfung mit einer kommerziellen PCV2 Vakzin zu entwickeln, untersucht. PCV2-spezifische Antikörper wurden in den PCV2-infizierten Tieren und in den PCV2-immunisierten Tieren im Tag 11 und 7 nach Inokulation (p.i.) nachgewiesen. PCV2-Genome wurden durch quantitative Realtime-PCR zwischen Tag 4 und Tag 46 p.i. nur in den Blutproben sowie in verschiedenen Geweben (z.B. Milz, Lymphknoten, Thymus) der PCV2-infizierten Tiere nachgewiesen. Das Genom, welches von den Lymphknoten der PCV2-infizierten Kälber erneut isoliert wurde, zeigt eine Identität von 99,9% gegenüber dem Inokulum. Dies weist möglicherweise auf adaptierte Mutationen im PCV2 Genom hin. Die Mutationen C1708T und G365C sind während der Infektionen aufgetreten. Die Sequenzanalyse zeigt eine mögliche adaptierte Mutation an der Aminosäure Nr. 105 in Replikationsgen (Met zu Ile) (siehe Publikation 3). Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass der Nachweis der PCV2 Genomen und eine experimentell induzierte Serokonversion möglich war. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfänglichkeit von PCV2 nicht allein auf Schweine begrenzt ist und eine Übertragung von PCV2 auf Rinder möglich ist.

Einleitung: Monocarboxylattransporter (MCT) 1 & 4 sind in zahlreichen Geweben als Kotransporter für Monocarboxylate und Protonen beschrieben. Auch im Pansenepithel werden MCT benötigt, um kurzkettige Fettsäuren (SCFA) aus dem Pansenlumen in die Pansenepithelzelle aufzunehmen (MCT4) und um SCFA und deren Metabolite aus der Pansenepithelzelle in das Blut auszuschleusen (MCT1). Die transepitheliale Permeation von SCFA über die Pansenwand ist von enormer Bedeutung, da sie die wichtigste Energiequelle der Wiederkäuer darstellen. Die beteiligten Transportprozesse müssen dementsprechend einer Anpassung an variierende Mengen von SCFA unterliegen. Bisherige Studien bei anderen Spezies deuten auf eine Regulation des MCT1 auf mRNA Ebene über den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor α (PPARα) hin. Ziele der Untersuchung: Das Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob MCT1 in ovinen Pansenepithelzellen über PPARα reguliert wird und ob auch MCT4 dieser Regulation unterliegt. Eine gleichzeitige Regulation beider Transporter läge nahe, da sie gemeinsam an der transepithelialen Permeation beteiligt sind. Die Auswirkungen solch einer Regulation auf die Proteinexpression und die Transportleistung der MCT sollte charakterisiert werden. Ebenfalls war das Potenzial der bei erhöhter Kraftfutterfütterung vermehrt anfallenden SCFA Butyrat auf die MCT1 Expression zu untersuchen. Material & Methoden: Aus dem Vorhof von Schafen wurden Pansenepithelzellen gewonnen und entsprechend einer bereits etablierten Methode kultiviert. Nach einer Subkultivierung wurden die Zellen immunzytochemisch mit Antikörpern gegen MCT1, MCT4 und Na+/K+-ATPase untersucht, um deren Lokalisation in den kultivierten Pansenepithelzellen zu bestimmen. Weiterhin erfolgte eine Behandlung mit WY 14.643, einem spezifischen, synthetischen PPARα Agonisten, sowie mit GW 6471, einem Antagonisten des PPARα. Mittels qPCR wurden die relativen mRNA Mengen von MCT1, MCT4, ACO, CPT1A und CACT bestimmt und auf die Referenzgene GAPDH und Na+/K+-ATPase normalisiert. Die Proteinexpression von MCT1 und MCT4 wurde mittels Western Blot bestimmt. Zur funktionellen Quantifizierung wurde der intrazelluläre pH-Wert der Zellen mittels Spektrofluorometrie gemessen und der laktatabhängige Protonentransport als Vergleichswert zwischen den Behandlungen genutzt. Um den MCT-abhängigen Teil des Transportes zu bestimmen, wurde ein spezifischer MCT1 & 4 Inhibitor, die p-Hydroxymercuribenzensulfonsäure (pHMB) eingesetzt. Die Zellen wurden mit Butyrat über einen Zeitraum von 6 und 48 h induziert. Die Erfassung der MCT1 Expression erfolgte mittels semiquantitativer PCR. Ergebnisse: MCT1 & 4 sind sowohl in der Zellmembran als auch intrazellulär in den Pansenepithelzellen lokalisiert. Die mRNA Expressionsdaten konnten zeigen, dass MCT1 und die PPARα Zielgene durch WY 14.643 hochreguliert werden konnten, wohingegen die MCT4 Expression keine eindeutige Antwort auf die Stimulation zeigt. Die Behandlung mit den Antagonisten zeigt eine Abhängigkeit der MCT1 Expression von PPARα, die MCT4 Expression konnte dagegen nicht beeinflusst werden. Mittels pHMB gelang es, den laktatabhängigen Protonenexport fast vollständig zu blocken. Sowohl laktatabhängiger Protonenexport als auch die Proteinexpression zeigten keine Änderung durch WY 14.643 Stimulation. Die Butyratexposition veränderte die Morphologie der Pansenepithelzellen und schien nicht geeignet für Untersuchungen der mRNA Expression zu sein. Schlussfolgerungen: Es konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass MCT1 in Pansenepithelzellen über PPARα reguliert wird, nicht aber MCT4. PPARα scheint demnach einer der entscheidenden Angriffspunkte für die Regulation des SCFA Transportes zu sein, dessen natürliche Liganden im Pansen aber noch nicht bekannt sind. Damit legt diese Arbeit den Grundstein für regulative Studien am intakten Pansenepithel. / Introduction: Monocarboxylate transporters (MCT) 1 & 4 are cotransporters of monocarboxylates and protons in a variety of mammalian cell types. In the ruminal epithelium MCT are necessary to transport short-chain fatty acids (SCFA) from the lumen into the ruminal epithelial cell (MCT4) and to discharge SCFA and their metabolites from the cell into the blood (MCT1). Transepithelial permeation of SCFA is of great importance, because they are the main source of energy for ruminants. The regulation of appropriate transport proteins should thus be subject to the adaptation to varying SCFA amounts. Previous studies in other species suggested that gene expression of MCT1 is regulated by peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), a ligand-activated nuclear receptor. Aims: The aim of the study was to examine if MCT1 in ruminal epithelial cells is regulated by PPARα and furthermore if MCT4 can be regulated by PPARα, as well. A simultaneous regulation seems likely, because both are acting jointly in the transepithelial transporting of SCFA. The implications of such a regulation on protein expression and transport capacity of MCT should be characterized. The effect of butyrate, a SCFA which increases under concentrate feeding, on MCT1 expression was determined. Materials & Methods: Ruminal epithelial cells of sheep were cultivated according to methods previously established. After subcultivation, immunocytochemistry with antibodies against MCT1, MCT4 and Na+/K+-ATPase was performed to determine their localization in ruminal epithelial cells. For studying the influence of PPARα, WY 14.643, a synthetic and selective ligand of PPARα, and GW 6471, a synthetic antagonist of PPARα, were applied to the culture medium of the cells. After processing the specimens, the relative amount of mRNA of MCT1, MCT4 and the target genes ACO, CPT1A and CACT were analyzed by qPCR and normalized on the reference genes GAPDH and Na+/K+-ATPase. Protein abundance of MCT1 & 4 was measured by using the Western Blot method. Functional quantification was measured by the intracellular pH (pHi) of cells using spectrofluorometry as well as comparing the effect of WY 14.643 treatment on lactate-dependent proton export. To determine the MCT-dependent part of the pHi recovery, p-hydroxymercuribenzoic acid (pHMB), a specific inhibitor of MCT1 & 4, was applied. Cells were also treated with butyrate for 6 h and 48 h and the mRNA abundance of MCT1 was analyzed by semiquantitative PCR. Results: Both MCT1 and MCT4 were localized in the cell membrane as well as in the cytoplasm of ruminal epithelial cells. By qPCR it could be demonstrated that the mRNA abundance of MCT1 and PPARα target genes in the ruminal epithelial cells was increased by WY 14.643 in comparison to untreated cells, whereas the response of MCT4 did not yield distinct results. Treatment with the PPARα antagonist pointed out, that MCT1 is influenced by PPARα, but not MCT4. Lactate-dependent proton export was blocked almost completely by pHMB. Both lactate-dependent proton export and protein expression were not altered by WY 14.643 treatment. Butyrate exposure changed the morphology of ruminal epithelial cells and seemed unsuitable for the analysis of mRNA expression. Conclusion: For the first time, it could be demonstrated, that MCT1 in ruminal epithelial cells is regulated by PPARα, but not MCT4. PPARα seems to be a vital target in the rumen for SCFA transport regulation, whose natural triggers have yet to be identified. Furthermore, this study provides the basis for regulative studies on intact ruminal epithelium.

Das Projekt OEKO-ID hat zum Ziel. problematische Bauteilanschlüsse, insbesondere Balkenköpfe von Holzdecken, im Zusammenhang mit "ökologischen" Innendämmsystemen messtechnisch zu untersuchen. Des Weiteren sollen Möglichkeiten und Grenzen der hygrothermischen Simulation aufgezeigt werden. Ferner wurde eine neue Methode molekularbiologischer und baubiologischer Untersuchungen, hier zur Detektierung von Schimmelpilzen, entwickelt und optimiert.:Inhaltsverzeichnis 1 Technisch-wissenschaftliche Beschreibung der Arbeit 4 1.1 Projektabriss 4 2 Testhaus und energetische Sanierung 6 2.1 Literaturrecherche 6 2.2 Auswahl der Dämmsysteme 7 2.3 Planung Versuchsgebäude 8 2.4 Adaptierung Versuchsgebäude 8 2.5 Vorbereitende Arbeiten 2.7 Montage der Dämmsysteme 14 2.8 Baupraktische Erfahrungen im Spiegel des WTA-Merkblatts E-8-14 18 2.9 Beschreibung der verwendeten Dämmsysteme 20 2.10 Bewertung der verwendeten Dämmstoffe bezüglich der Verarbeitung 26 2.11 Vergleich der Dämmsysteme bezüglich OI3- Index 29 2.12 Erfahrungen beim Rückbau und der Entsorgung 31 2.13 Zusammenfassung der Eigenschaften der Dämmsysteme 39 2.14 Reduzierung der Transmissionswärmeverluste durch Innendämmmaßnahmen 41 3 Hygrothermische Materialkennwerte und -funktionen 43 3.1 Materialuntersuchungen 43 3.2 Beprobung . 44 3.3 Messverfahren 45 3.4 Verifizierungsexperimente: kontinuierliche Wasseraufnahme und Abtrocknung 52 3.5 Erstellung von Materialfunktionen 53 3.6 Zusammenfassung der Eigenschaften der Materialien und Innendämmsysteme 62 4 Mikrobiologische Untersuchungen und Methodenentwicklung 67 4.1 Vorgehen 67 4.2 Ergebnisse 75 5 Hygrothermische Vor-Ort-Messungen 81 5.1 Auswertung der Messdaten 81 5.2 Außen- und Raumklima 82 5.3 Temperatur und Luftfeuchte auf der Bestandsoberfläche 94 5.4 Temperatur und Luftfeuchte in der Mitte der Balkentasche 105 5.5 Temperatur und Luftfeuchte vor dem Stirnholz 109 5.6 Holzfeuchtemessungen 115 5.7 Oberflächentemperaturen 121 5.8 Temperatur- und Feuchteprofile an den Balken 125 5.9 Abdichtung der Balkenauflagertaschen 140 5.10 Mögliches Schimmelpilzwachstum in den Balkenauflagern 147 5.11 Konvertieren und Auswerten der Messungen 149 5.12 Resümee der hygrothermischen Messungen 149 6 Hygrothermische Simulationen 152 6 Hygrothermische Simulationen 152 6.1 Verwendete Simulationsprogramme 152 6.2 Temperatur-Korrektur der Holzfeuchtesensoren 154 6.3 Einfluss von Schlagregen 158 6.4 Berücksichtigung der Permeabilität der Baumaterialien 162 6.5 Simulation der Messergebnisse 166 6.6 Simulation der Grenzschicht Dämmsystem/ Bestandskonstruktion 168 6.7 Simulation eines Balkenkopfs 170 7 Dissemination - Darstellung der Verbreitungs- und Verwertungsmaßnahmen 174 7.1 Workshops 174 7.2 Zusammenarbeit mit anderen Projekten 175 7.3 Vorträge auf (Fach-)Tagungen und Konferenzen 175 7.4 Publikationen 178 8 Zusammenfassung 180 8.1 Technologische und ökologische Bewertung der Dämmsysteme 180 8.2 Bestimmung der Materialeigenschaften 181 8.3 Mikrobiologische Untersuchungen und Methodenentwicklung 181 8.4 Hygrothermische Vorortmessungen182 8.5 Hygrothermische Simulationen 183 8.6 Dissemination 184 9 Literaturverzeichnis 185 10 Unterschrift 192 A1 Anhang zum Abschnitt 2 Versuchsaufbau 193 A2 Anhang zum Abschnitt 4 - Mikrobiologische Untersuchungen 194 A3 Abdruck der Publikationen in internationalen wissenschaftlichen Zeitschriften 208 A4 Bauteilkatalog 230 A5 Monatliche Klima-Durchschnittswerte 247

Orientador: Maria Ines Tiraboschi Ferro / Resumo: Períodos prolongados de seca têm se tornado mais frequentes em algumas regiões do Brasil. Além disso, a expansão da cultura de cana-de-açúcar para regiões com deficiência hídrica prolongada torna a produção sucroenergética limitada nestes locais. A melhor forma de contornar esse problema é utilizar cultivares tolerantes a este estresse. Neste trabalho, o perfil de expressão gênica da cana-de-açúcar foi avaliado, a partir de duas cultivares com respostas contrastantes ao déficit hídrico: uma delas com comportamento considerado tolerante (SP81-3250), e a outra altamente exigente em água (RB855453), considerada sensível. Ambas foram submetidas a três potenciais hídricos do solo (controle (sem estresse hídrico), déficit hídrico moderado e déficit hídrico severo) a partir de 60 dias após o plantio. Essas plantas foram avaliadas molecular e fisiologicamente em três épocas distintas: 30, 60 e 90 dias após a aplicação dos tratamentos, sendo este um dos poucos estudos realizados até o momento sobre a resposta de plantas de cana-de-açúcar sob déficit hídrico prolongado, estresse esse que foi realizado no período conhecido como fase de formação da cana-de-açúcar, compreendendo o período mais crítico por demanda de água. A análise global da expressão gênica através da tecnologia de RNA-Seq mostrou alterações significativas em resposta ao déficit hídrico entre as duas cultivares. Os transcritos do genótipo tolerante apresentaram uma maior capacidade de reação das plantas frente ao déficit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Extended periods of drought have become more frequent in some regions of Brazil. In addition, the expansion of sugarcane cultivation to regions with prolonged water deficiency makes sugarcane production limited at these locations. The best way around this problem is to use stress-tolerant cultivars. In this work, the sugarcane gene expression profile was evaluated from two cultivars with contrasting responses to water deficit: one of them with tolerant behavior (SP81-3250), and the other highly demanding in water (RB855453 ), considered sensitive. Both were submitted to three soil water potentials (control (without water stress), moderate water deficit and severe water deficit) from 60 days after planting. These plants were evaluated molecularly and physiologically at three different times: 30, 60 and 90 days after the application of the treatments. This is one of the few studies carried out so far on the response of sugarcane plants under prolonged water deficit. This stress was realized during the period known as sugarcane formation phase, comprising the most critical period by water demand. The overall analysis of gene expression through RNA-Seq technology showed significant changes in response to water deficit between the two cultivars. The transcripts of the tolerant genotype showed a higher reaction capacity of the plants to prolonged water deficit, while in the sensitive genotype, several plant survival mechanisms were repressed. The tolerant cultivar presented inducti... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introduktion: Polymerase chain reaction (PCR) är en biokemisk och molekylärbiologisk laboratorieteknik som används för in vitro amplifiering av specifika gensekvenser. Det finns olika varianter av PCR, en mer utvecklad version är Realtids-PCR, även benämndkvantitativ PCR (qPCR). qPCR mäter fluorescensintensitet i varje qPCR cykel. Metoden delas in i fyra huvudfaser: linjär-, tidig exponentiell-, exponentiell- och platåfas.   Syfte: Syftet med projektet var att utvärdera prestanda hos Quantstudio 7 vid varierande reaktionsvolym och plattposition, samt vid singleplex och duplex, för att öka kvaliteten på resultat och göra metoden mer kostnadseffektiv.   Material & metod: Syntetisk DNA-sekvens (gBlock) späddes och sattes upp i en standardkurva med sju punkter och användes för 20 µl respektive 10 µl reaktionsvolymen, varje punkt bestod av 4 replikat. För att utvärdera Duplex vs Singelplex förbereddes standardkurva i kombination med en konstant koncentration av en annan assay. För att undersöka intra-plate variation sattes upp identiska reaktioner i samtliga brunnar i PCR-plattan.    Resultat: Samtliga experiment gav detekterbara ampliferingsprodukter.  Cq-värdet användes för att beräkna medelvärde och standardavvikelse, samt effektivitet och R2-värde   Slutsats: Resultatet som erhålls från QS instrumentet visade att reaktionsvolymerna 10 µl och 20 µl är jämförbara. Duplex experimentet visade att gener med låg genuttryck kan duplexas med gener som har 10 000x högre genuttryck. Resultatet från intra-plate variation visade att variationen i SD var högre i den högre sidan av PCR-plattan. / Introduction: Polymerase chain reaction (PCR) is a biochemical and molecular laboratory technique that is used for amplification of specific gene sequences. There are different variants of PCR. A more developed version is quantitative PCR (qPCR). In qPCR the fluorescence intensity is measured in realtime during each qPCR cycle.    Aim: The purpose of the project is to evaluate whether the reaction volume can be reduced by half, which leads to using less material and thus make the method more cost-effective.   Matherial & method: Synthetic DNA sequence (gBlock) was diluted and set up in a standard curve with seven standards and used for 20 μl and 10 μl reaction volume, respectively. Each standard consisted of 4 replicates. To evaluate Duplex vs Singelplex, standard curve was prepared in combination with a constant concentration of another assay. To investigate intra-plate variation, identical reactions were set up in all wells of the PCR-plate.   Results: All experiments yielded detectable amplification products. The Cq value was used to calculate the mean and standard deviation, as well as the efficiency and R2 value   Conclusion:  The obtained results showed that the reaction volumes 10 and 20 µl are comparable. In duplex assay, genes with low gene expression can be analyzed with genes that have 10,000x higher gene expression. In intraplate-assay variation, the variation in the standard deviation increased in the right side of PCR-plate.