Les traitements actuels des lésions osseuses maxillo-faciales ont été éprouvés. La greffe autogène présente les propriétés idéales, mais montre des inconvénients : douleurs chroniques, infection… Certains comblements proposés ne permettent pas une néoformation vasculaire, garante de la viabilité des tissus régénérés pour des lésions importantes. Il faut alors développer des implants avec les caractéristiques recherchées et trouver les moyens de lutter contre le risque infectieux. Ce travail présente les résultats de recherches menées sur la fabrication d’implants nanofibreux mimant la MEC du tissu osseux, dotés d’une porosité favorable à une formation vasculaire et pouvant être fonctionnalisés par des facteurs de croissance / des cellules. Une réflexion éthique est menée sur le développement de ces avancées et sur leurs applications afin de garantir qu’elles constituent un réel progrès pour les patients. Il est aussi montré que l’on peut améliorer la sécurité des soins dans le traitement des lésions osseuses maxillo-faciales en développant des équipements dans le champ de l’hygiène et par la mise en place de procédures visant à évaluer leur efficacité. / Current treatments of maxillofacial bone defects have now been proven. Only the autogenous graft presents the ideal properties but shows complications: chronic pain, infection... Some bone filling techniques that are currently available do not allow the formation of blood vessels, guaranteeing the sustainability of the regenerated tissue for large lesions. It is then necessary to develop implants in that way, and to find ways to fight effectively the risk of infection. This work presents the results of research conducted on the fabrication of nanofibrous implants mimicking the ECM of bone tissue, with a porosity that is favorable to a vascular formation. These implants can be functionalized with growth factors / cells. Ethical considerations are provided on the development of these advances, but also on their applications to ensure that these developments constitute a real progress in the interest of patients. Moreover, this work shows that it is possible to improve the safety of care in the treatment of maxillofacial bone defects, with the development of equipment in the field of hygiene and the establishment of procedures to assess their effectiveness.

L’objectif de cette thèse était de développer de nouveaux biomatériaux nanofibreux architecturés (2D ou 3D) grâce à la méthode d’électrospinning puis d’étudier l’influence de ces structures nanofibreuses sur le comportement des cellules osseuses. L’électrospinning est une technique qui permet d’obtenir des nanofibres en projetant sous l’action d’un champ électrique intense une solution de polymère sur un collecteur. Les nanofibres sont alors généralement disposées aléatoirement sous forme de mats (ou scaffolds). Ces scaffolds trouvent des applications en ingénierie tissulaire grâce à leur structure mimant la matrice extracellulaire des tissus vivants. Toutefois, il a été montré que lorsque le collecteur est micro-structuré, il est alors possible de contrôler l’organisation des fibres lors de leur dépôt grâce à la perturbation locale du champ électrique au voisinage de la surface du collecteur. Ces collecteurs architecturés jouent ainsi le rôle de « templates » électrostatiques. Dans un premier temps, nous avons développé des scaffolds 2D nanofibreux monocomposants en forme de nids d’abeilles grâce à l’utilisation d’un collecteur micro-structuré en nids d’abeilles lors du procédé d’électrospinning. Ces scaffolds ont été développés à partir de deux biopolyesters le poly(ε-caprolactone) (PCL) ou le poly(lactic acid) (PLA). Nous avons prouvé que la morphologie des nanofibres de PCL (distribution bimodale du diamètre des fibres) conduisait à un scaffold présentant un relief beaucoup plus marqué alors qu’avec les fibres de PLA, qui présentent une distribution monomodale du diamètre des fibres, les scaffolds obtenus sont beaucoup plus plats. Nous avons montré qu’il est possible de contrôler l’organisation spatiale de cellules osseuses de type MG-63, des ostéoblastes, en jouant sur le relief et l’architecture du scaffold. Puis, nous avons démontré qu’en couplant la micro-structuration des nanofibres de PCL (par l’utilisation d’un collecteur en nid d’abeilles lors du procédé d’électrospinning) avec les propriétés d’auto-assemblage du PCL, nous pouvions élaborer de nouveaux scaffolds nanofibreux 3D ayant la particularité de présenter des pores de tailles contrôlées ainsi qu’un gradient de porosité dans l’épaisseur du scaffold. Puis nous nous sommes intéressés à l’élaboration de membranes composites micro-structurées 2D et 3D. En couplant le procédé d’électrospinning avec le procédé d’électrospraying sur des collecteur micro-structurés, nous avons démontré que nous pouvions déposer de manière contrôlée les particules spécialement sur les murs des nids d’abeilles grâce notamment à la présence d’une très fine couche de fibres électrospinnées au préalable sur le collecteur. Cette fine couche de nanofibres joue le rôle de « template électrostatique » pour le dépôt des particules. Nous avons ensuite appliqué cette technique pour développer des membranes composites nanofibreuses bicouches à base de nanofibres de PCL et de microparticules d’hydroxyapatite (HA). Ces membranes composées de 21 microarchitectures différentes (barres, plots, hexagones, labyrinthe) ont ensuite été intégrées dans des mini plaques de culture cellulaire, formant ainsi un nouveau type de biopuce, appelés biochips, qui permettent pour le screening des microarchitectures nanofibreuses. Enfin, en combinant simultanément l’électrospinning de nanofibres et l’électrospraying de particules sur des collecteur micro-structurés en nid d’abeilles, des scaffolds composites 3D présentant des pores cylindriques de tailles contrôlées ont été élaborés. / The aim of this thesis was to develop new architectured nanofibrous biomaterials (2D or 3D) using the electrospinning method and to study the influence of these nanofibrous structures on bone cells behaviors. Electrospinning is a technique allowing the production of nanofibers by projecting, under the action of a strong electric field, a polymer solution on a collector. The nanofibers are generally randomly deposited and form mats or scaffolds. These scaffolds are interesting for tissue engineering applications because of their structure mimicking the extracellular matrix of living tissues. However, it has been shown that when the collector is microstructured, it is possible to control the organization of the fibers during their deposition through the local perturbation of the electric field at the vicinity of the surface of the collector. These micropatterned collectors act as "electrostatic templates". First, 2D honeycomb nanofibrous scaffolds were elaborated using micropatterned honeycomb collectors during the electrospinning process. These scaffolds were made either with poly(ε-caprolactone) (PCL) or poly(lactic acid) (PLA). We showed that the morphology of the PCL nanofibers (bimodal distribution of the fiber diameter) led to a scaffold with a strong relief. Despite, with PLA fibers which presented a monomodal distribution of the fiber diameter, the obtained scaffolds were much flatter. It was possible to control the spatial organization of bone-like cells MG-63 (osteoblasts), playing on the relief and the architecture of the scaffold. Subsequently, 3D materials were elaborated using micropatterned collectors in order to open new paths for the development of filling materials for bone regeneration. Microstructuration of PCL nanofibers (by the use of micropatterned honeycomb collector during the electrospinning process) coupled with the self-assembling properties of the PCL lead to the development of new 3D nanofibrous scaffolds, with controlled pore size and porosity gradient in the thickness of the scaffold. Afterwards, micropatterned composite 2D and 3D membranes were elaborated. By coupling the process of electrospinning with the process of electrospraying on micropatterned collector, we demonstrated that we can deposit the particles in a controlled way, especially on the walls of honeycomb patterns thanks to the presence of a thin fiber layer first deposited on the collector. This thin nanofiber layer plays the role of an "electrostatic template" for the particles deposition. Thereafter, this technique was applied to develop bilayers composite nanofibrous membranes containing PCL nanofibers and hydroxyapatite (HA) microparticles. These membranes consisted of 21 different microarchitectures (bars, blocks, hexagons, maze) were then incorporated into a small cell culture plate, thereby forming a new type of biochip for the screening of nanofibrous architectures. Indeed, these biochips allowed the screening of nanofibrous microarchitectures to identify the most relevant for bone regeneration. It turned out that the HA hexagonal structures (with an average diameter of 300 microns) and circular HA structures (with an average diameter of 150 microns) are the structures that enhance the most the mineralization process of bone cells. Finally, by combining simultaneously electrospinning nanofibers and electrospraying particles on micropatterned honeycomb collector, 3D composite scaffolds were elaborated. It was possible to control the size of cylindrical pores of these 3D composite from tens to hundreds of microns by changing the size of the honeycomb patterns of the collector.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação do ultra-som (US) de 1 MHz comparando as freqüências de repetição de pulso de 100 Hz e 16 Hz na recuperação da fratura de fíbula, por análise morfológica e bioquímica, entre animais tratados e não-tratados. Foram utilizados 60 ratos machos albinos Wistar divididos em 4 grupos experimentais: referência, controle, tratados com US com freqüência de repetição de pulso de 16 Hz ou 100 Hz. Os animais dos grupos tratado e controle foram submetidos a uma fratura com perda óssea da fíbula direita. O tratamento teve início 24 h após a fratura, durante 5 dias por semana, com intensidade de 0,5 W/'CM POT.2', modo pulsado 1/5, freqüência de repetição de pulso a 100 Hz ou 16 Hz, por 3 min/dia. No 7°, 14º e 21º dia após a indução da fratura foi realizada coleta do sangue através de punção cardíaca para quantificação dos níveis de fosfatase alcalina e cálcio sérico e em seguida os animais foram submetidos à eutanásia e a fíbula foi removida para análise histológica. Foram determinadas a densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos. Os níveis de fosfatase alcalina e cálcio foram significativamente (P < '10 POT.-7') diferentes nos grupos experimentais. A densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos também foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais. O tratamento com US acelerou a regeneração óssea e modulou os níveis sanguíneos de fosfatase alcalina e cálcio, sendo que, o US pulsado com freqüência de repetição de pulso a 100 Hz e freqüência de base da 1 MHz demonstrou ser mais eficaz / The aim of this work was to evaluate the effect of 1 MHz ultrasound application, comparing the 100 Hz and 16 Hz pulse repetition frequency in the recovering of fibula fracture, using morphological and biochemical analysis, between treated and non-treated animals. We used 60 male albino Wistar rats divided into 4 experimental groups: reference; control; treated with 100 Hz or 16 Hz pulse repetition frequency ultrasound. The treatment began 24 h after fracturing, lasted for 5 days per week, with 0.5 W/'CM POT. 2', pulsed mode 1/5, pulse repetition frequency of 100 Hz or 16 Hz, for 3 min a day. In the 7th, 14th and 21st after fracture induction, blood was collected through cardiac punction to alkaline phosphatase and calcium levels quantification and following that, the animals were euthanised and the fibula was removed to histological analysis. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densityes were determined. The levels of alkaline phosphatase and calcium were significantly (P < '10 POT.-7') different among the experimental group. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densities were significantly different among experimental groups. The US treatment accelerated the bone regeneration and modulated the alkaline phosphatase and calcium blood levels, being the pulsed US with 100 Hz pulse repetition frequency and base current 1 MHz the most efficient

O objetivo desse estudo foi descrever o padrão de reparação da ROG, após o uso de osso autógeno e membrana de colágeno suíno (BioGide). Foram utilizados 30 ratos machos Wistar, nos quais 30 mini-implantes fixaram enxerto ósseo autógeno do tipo onlay, originário de osso parietal, na região do ângulo da mandíbula. Os enxertos foram recobertos com membranas de colágeno e os animais sacrificados nos períodos de zero hora, 14, 21, 45 e 150 dias. As amostras foram descalcificadas e processadas pela técnica de fratura (Berglundh et al., 1991). Após 2 semanas, a interface entre o leito e o enxerto encontrava-se preenchida por tecido conjuntivo imaturo rico em vasos e fibroblastos. Aos 21 dias, observou-se osso neoformado sob a membrana e junto aos bordos do enxerto, integrando o enxerto ao leito. Este apresentava intensa remodelação, de modo que junto às fresas do implante observamos osso imaturo e vasos. Aos 45 dias, a estrutura colágena original da membrana apresentou avançado grau de reabsorção e diminuição da sua espessura. O tecido ósseo formado sob a membrana demonstrou início de organização lamelar. No período final, após 150 dias, o enxerto apresentou-se completamente integrado ao osso receptor e com adiantado grau de maturação. Conclui-se que após 21 dias, o osso neoformado estava em contato com o enxerto e o implante. No período de 45 dias, observou-se maturação inicial do tecido ósseo e avançada biodegradação da membrana. Apenas após 150 dias, pudemos assegurar a integração do enxerto ao osso neoformado na região do leito, com ganho adicional de tecido ósseo. / The aim of the present study was to evaluate the repair pattern after guided bone regeneration (GBR), using an autogenous bone graft covered with a porcine collagen membrane (BioGide). Thirty male Wistar rats received an onlay autogenous bone graft, harvested from parietal bone, laid on the external area near the angle of the mandible with titanium fixtures. The grafts were covered with a collagen membrane and the animals were sacrificed at 0 hour, 14, 21, 45 and 150 days. Decalcified sections were prepared according to the fracture technique (Berglundh et al., 1991). After two weeks, the bed-graft interface presented an immature connective tissue layer, containing fibroblasts-like cells and vessels. After 21 days, under the membrane, newly formed trabecular bone established bridges connecting the bed and the lateral borders of the graft. The receptor bed showed intense remodeling and adjacent to the implant threads, immature bone and vessels could be seen. After 45 days, the collagen structure of the membrane presented extensive resorption and a large decrease in thickness. The bone tissue, under the membrane, exhibited initial lamellar bone arrangement. After 150 days, a complete fusion of the graft with the receptor bed and an advanced level of bone maturity of the graft were observed. It was concluded that, after 21 days, the newly formed bone was in direct contact both with the graft and the implant. At 45 days the porcine collagen membrane showed advanced stage of resorption and an initial bone maturity could be observed. Only at 150 days, we could assure the graft integration to the newly formed bone at bed receptor area, with additional bone tissue gain.

La régénération osseuse guidée (ROG) est une technique couramment utilisée pour la régénération de perte de substance osseuse. Elle repose sur l’utilisation d’une membrane jouant un rôle de « barrière » en isolant le défaut osseux. Afin de pallier les limites des membranes actuellement utilisées, des recherches récentes tentent de développer de nouvelles membranes dites « bio-actives ». Du fait de ses propriétés biologiques, la membrane amniotique humaine (MAH) pourrait être une alternative aux membranes conventionnellement utilisées pour la ROG. L’objectif principal de ce travail était de déterminer les meilleures conditions d’utilisation de la MAH pour la régénération de pertes de substances osseuses. Dans une première partie expérimentale, l’influence des faces de la MAH appliquées au contact du défaut ainsi que l’effet de la cryopréservation ont été étudiés. Dans une seconde partie expérimentale, une nouvelle méthode de décellularisation de la MAH, simple et reproductible a été développée. Dans une troisième partie expérimentale, la réparation osseuse de défauts de taille non-critiques et critiques a été évaluée en présence de la MAH préservée selon différentes méthodes. Les résultats ont montré que ni les cellules souches contenues dans la MAH, ni la face appliquée au contact du défaut n’avaient d’influence sur la régénération osseuse. La MAH décellularisée/lyophilisée semblait être la méthode de préservation la plus prometteuse en vue de son utilisation en régénération osseuse. / Guided bone regeneration (GBR) is commonly used to repair damaged bone. GBR is based on the application of a membrane which will act as a physical barrier to isolate the intended bone-healing space. The development of bioactive membranes has been suggested to overcome some limitations of the currently used membrane. Due to its biological properties, the human amniotic membrane (HAM) is a new biological membrane option for GBR. This study aimed at investigating the most suitable conditions to use HAM for GBR. First, the influence of both HAM sides and the impact of cryopreservation were studied. Then, a new decellularization process of HAM, that is simple and reproducible, has been developed. In a third part, bone regeneration of non-critical and critical sized defects depending on the preservation method of HAM was assessed in rodents. Results showed that neither stem cells found in HAM, nor the HAM layer used to cover the defect had an influence on its potential for bone regeneration. The most promising results were achieved with the decellularized/lyophilized HAM for the field of bone regeneration.

Les phosphates de calcium sont les céramiques les plus utilisées dans la régénération osseuse grâce à leur biocompatibilité et leur bonne résorption. Pourtant, leur performance peut être améliorée s'ils sont associés à des facteurs de croissance. Afin de contrôler le relargage des facteurs de croissance, l'objectif de la thèse a été de synthétiser des phosphates de calcium avec une mésoporosité contrôlée. Ce travail représente la première association des phosphates de calcium mésoporeux avec les facteurs de croissance TGF et VEGF.Pour obtenir des phosphates de calcium mésoporeux, des nouvelles techniques de réplique ont été mises en place : L'hydroxyapatite est synthétisée dans la porosité des templates siliciques ou carbonés par infiltration de précurseurs en solution aqueuse. L'élimination de la matrice s'effectue par dissolution chimique par de la soude dans le cas du template silicique et par oxydation sélective sous air dans le cas du template carboné. Six céramiques ont été choisies pour une analyse de leurs capacités d'adsorption et de relargage de protéines. Dans un premier temps, un protocole est mis en place en utilisant des protéines modèles, la BSA et le Cytochrome Cavant d'utiliser les facteurs de croissance TGF et VEGF. Ces travaux ont permis de déterminer les poudres les plus efficaces en terme d'adsorption et de relargage contrôlé de ces facteurs de croissance. / Calcium phosphates are the most frequently used ceramics for bone regeneration due to their biocompatibility and favorable resorption properties. Their performance can however be improved if they are associated to growth factors. In order to control the release of growth factors, we have inted to synthesize calcium phosphates with controlled mesoporosity. This thesis represents the first work that combines mesoporous calcium phosphates with the growth factors TGF and VEGF. To obtain hydroxyapatite with controlled mesoporosity, we propose new synthesis pathways: the hydroxyapatite is synthesized inside the porosity of silica or carbon templates by infiltration of aqueous precursor solutions. The template is eliminated by chemical etching with NaOH (silica template) or by selective oxidation (carbon template). Six ceramics have been chosen for the analysis of their protein adsorption and release properties. First, the experimental protocol is defined using the model proteins BSA and Cytochrom C. Then, the growth factors TGF and VEGF have been used. By this study, we were able to determine which samples were the most efficient in terms of protein adsorption and release.

Orientador: Andréa Carvalho [Unesp] De Marco / Resumo: Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da terapia com laser de baixa intensidade (LLLT) associada ao Bio-Oss® em defeitos de tamanho crítico de ratos. Foram utilizados 72 ratos machos adultos (Rattus norvegicus, variação albinus, Wistar), com 90 dias de idade. Foram realizados defeitos ósseos na calvária com 5 mm de diâmetro. Os animais foram divididos em 4 grupos: C-Coágulo sanguíneo, B- Bio-Oss®, L- LLLT, B+L- Bio-Oss® + LLLT. Cada grupo foi subdividido de acordo com os períodos de observação de 07, 30 e 60 dias, com 6 ratos em cada subgrupo. Para LLLT uma baixa energia GaAlAs com comprimento de onda de 660 nm, foi aplicada em 5 pontos. Foram distribuídos 4 pontos de aplicação ao longo das bordas da ferida e um ponto de aplicação localizado na região central da ferida cirúrgica. A irradiação foi liberada por 12 segundos por ponto, com uma densidade total de energia de 45 J/cm2. A irradiação com laser ocorreu de forma transcirurgica em única aplicação imediatamente após o procedimento. Em 07, 30 e em 60 dias, 6 animais de cada grupo foram eutanasiados pela aplicação de anestesia geral em dose triplicada, e após os testes de sensibilidade os animais foram decapitados. Em seguida a calvária foi removida para análises histomorfométrica e imunohistoquímica. Todos os dados histomorfométricos foram submetidos a análise por ANOVA, complementado pelo teste de Tukey. O nível de significância foi de 5%. Os resultados da imunohistoquímica foram representados por scores e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to investigate the effects of low-level laser therapy (LLLT) associated with Bio-Oss® on critical size defects in rats. 72 adult male rats (Rattus norvegicus, variation albinus, Wistar), 90 days old, were used. Bone defects were made in the calvaria with a diameter of 5 mm. The animals were divided into 4 groups: C-blood clot, B-Bio-Oss®, L-LLLT, B + L- Bio-Oss® + LLLT. Each group was subdivided according to the observation periods of 07, 30 and 60 days, with 6 rats in each subgroup. For LLLT a low GaAlAs energy with a wavelength of 660 nm was applied at 5 points. 4 points of application were distributed along the edges of the wound and one point of application located in the central region of the surgical wound. The irradiation was released for 12 seconds per point, with a total energy density of 45 J/cm2. Laser irradiation occurred in a trans-surgical form in a single application immediately after the procedure. At 07, 30 and 60 days, 6 animals from each group were euthanized by applying triple dose of general anesthesia, after the sensitivity tests the animals were beheaded. Then the calvaria was removed for histomorphometric and immunohistochemistry analysis. All histomorphometric data were analyzed statistically by ANOVA, complemented by the Tukey test. The level of significance was 5%. The results of immunohistochemistry were represented by scores and percentage. The groups that showed the highest proportion of neoformation were groups L (0,39±0,13) and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Aus der Sicht von Klinikern – Orthopäden und Unfallchirurgen – besteht ein großer Bedarf an degra¬dierbaren Knochenersatzmaterialien für den osteoporotischen und den krebskranken Knochen. Fraktu¬ren am Oberschenkelhals oder auch der Wirbelsäule heilen bei diesen systemischen Erkrankungen gar nicht oder nur sehr langsam. Frakturen des gesunden Knochens heilen ins¬besondere bei älteren Patienten schwer, wenn große Defektbereiche vorhanden sind. Gilt bei einem ge¬sunden Patienten ein Defekt von etwa 1,5 – 2 cm als überkritisch und bedarf somit der Versorgung mit einem Knochen¬ersatz¬material, so kann bei einem älteren oder erkrankten Menschen bereits eine Spalt¬breite von mehr als 3 mm problematisch sein. Der Sonderforschungsbereich Transregio 79 mit dem Thema 'Werkstoffe für die Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen' hat sich dieses Problems angenommen und will es ätiologiebasiert durch die Verbindung von Erkenntnissen und Charakterisierungs-methoden aus Werkstoffwissenschaft, Biologie und Medizin lösen. Die vorliegende Dissertation wurde im Rahmen dieses Vorhabens und in der Gruppe Biomimetische Materialien und Biomaterialanalytik des Instituts für Werkstoffwissenschaft, Professur Biomaterialien, der Technischen Universität Dresden erarbeitet. Sie beschäftigt sich vorrangig mit der Entwicklung von Knochenersatz¬material für den gesunden sowie den osteoporotischen Knochen. Der Arbeitshypothese folgend, dass die Defekt-/Frakturheilung im osteoporotischen Knochen durch Knochenersatzmaterial bestehend aus Calcium-/Strontiumphosphaten verbessert werden kann, soll die Ionenfreisetzung durch geeignete Kristallstrukturen gezielt eingestellt werden, um den Knochenwiederaufbau direkt über die Osteo¬blastenaktivität oder indirekt über die Cytokinausschüttung der Osteoklasten zu stimulieren. Für die Materialentwicklung sind eine hinreichende Kenntnisse über die Struktur und den Aufbau des Knochens, über die Mineralisation und die Zellbiologie des Knochens einschließlich des Immunsystems notwendig. Zu Beginn der Arbeit war es deshalb notwendig, diesen Kenntnisstand zur Mineralbildung im Knochen zu vertiefen. Eine intensive Zusammenarbeit mit Projekten innerhalb des Transregio 79, die sich der Strukturaufklärung und der Zellbiologie des Knochens widmen beziehungsweise die Tierexperimente durchführen, war daher erforderlich. Diese Verknüpfung erfordert eine tiefgehende Auseinandersetzung mit der Frakturheilung, um interdisziplinär erfolgreich wirken zu können. Im Verlauf der Materialentwicklung erwies es sich als vorteilhaft, auch im eigenen Labor Zellkultur¬untersuchungen durchzuführen. Sie ermöglichten eine schnellere Umsetzung von Erkenntnissen der Zell¬reaktion in die Materialkonzeption. Aus werkstoffwissenschaftlicher Sicht ist der Knochen ein durch die Evolution geprägtes und hinsicht¬lich seiner mechanischen und biologischen Eigenschaften herausragend aufgebautes Verbundmaterial, das aus organischen und anorganisch nichtmetallischen Komponenten besteht und hierarchisch strukturiert ist. Kollagen I und Hydroxylapatit sind seine Hauptbestandteile. Daneben gibt es aber eine Reihe von Calciumphosphatstrukturen und Spuren von Fremdionen sowie nichtkollagenen Proteinen, deren Wirkung im Zuge der Mineralisation bisher kaum verstanden wird. Die zeitliche Abfolge, die Vielzahl an beteiligten Komponenten und die zelluläre Steuerung ergeben eine umfangreiche Parametervielfalt, die sich zum Teil durch Kompensationsmechanismen einer definitiven Ursachen-Wirkungs-Beschreibung entziehen. Eine Auseinandersetzung mit dem Knochenaufbau ist jedoch essen¬tiell für die Orientierung am natürlichen Vorbild. Zudem bedarf es der Kenntnis des zellulären Verhal¬tens auf extrazelluläre Einflüsse, um die Biomaterialcharakterisierung und eine geeignete Material¬modifizierung zu vollziehen. Deshalb wird im Stand des Wissens im nachfolgenden Kapitel zunächst auf die Struktur und den Aufbau des Knochens eingegangen, ehe auf die Besonderheiten der Mineralisation Bezug genommen wird. Letztere erfolgt nicht nach dem Prinzip der klassischen Mineralisation. Stattdessen liegen im Knochen Nanokristallite vor, die mithilfe organischer Moleküle zu sogenannten mesoskopischen Partikeln zusammengeführt werden. Die Kristallisation wird auf diesem Weg unabhängiger von Ionenprodukten und kann ohne Änderungen von pH-Werten stattfinden. Eine Schlüs¬sel¬position bei dieser Mineralisation nehmen strukturdirigierende Moleküle ein. Es ist bisher unklar geblieben, welche strukturdirigierenden Moleküle in welcher Reihenfolge oder auch gemeinsam im Knochen wirken und welches Molekül den Mineralisationsprozess einleitet und wie es mit den Haupt-komponenten des Knochens in Wechselwirkung steht. Das Materialkonzept sah daher von Beginn an vor, knochennahe Komponenten wie Kollagen Typ I und Calciumphosphatphasen als Grund¬bestandteile für den Knochenersatz zu verwenden, aber auch das nicht¬kollagene Protein Osteocalcin beziehungs¬weise Asparaginsäure als dessen Modellsubstanz werden als mögliche strukturdirigierende Moleküle mit einbezogen. Aufbauend auf dem gegenwärtigen Stand des Wissens wurde auch Strontium als Fremdion, wegen seiner bekannten positiven Wirkung auf den osteoporotischen Knochen, mit in das Konzept eingebunden. Weil bei einer Einführung in die medizinische Praxis auch ökonomische Gesichtspunkte eine wichtige Rolle spielen, war es naheliegend, statt Tropokollagen und Kollagen¬fibrillen auch Gela¬tine als organische Hauptkomponente zu verwenden. Die Forschung an einem temporären Knochenersatz für die Behandlung überkritischer Defekte und Frakturen durch ein degradierbares Biomaterial erfordert die Anregung der Knochenneubildung und gegebenenfalls die Einbindung in den Remodellierungsprozess, was einerseits von der biologisch medizinischen Seite, andererseits aber von der Seite der Handhabbarkeit im operativen Einsatz zu beur¬teilen ist. Beiderseits sind werkstoffwissenschaftliche Untersuchungen und Beschreibungen der Struktur sowie des Gefüges und die Herstellung einer Beziehung zu den daraus resultierenden Eigenschaften erforderlich. Auf dieser Basis wird aus der Materialforschung der technisch anwendbare Werkstoff. Im Anschluss an den Stand des Wissens werden die Ergebnisse zur Knochenuntersuchung, ebenso wie die der verschiedenen Mineralisationsmethoden aufgeführt und jeweils in den darauffolgenden Kapiteln diskutiert, um die Weiterentwicklung der Biomaterialsynthese zu erläutern. Das daraus resultierende Materialkonzept wird ausführlich in vitro charakterisiert und die Materialauswahl für den ersten in vivo Einsatz im Rahmen des Transregio 79 im osteoporotischen Rattenmodell erörtert. Die abschließende Zusammenfassung führt die Teilerkenntnisse zusammen und ermöglicht einen Ausblick für die weitere Materialentwicklung auf der Basis biomimetisch mineralisierter organischer Makromoleküle.:Danksagung Eigenständigkeitserklärung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Stand des Wissens 2.1 Biomineralisation und Selbstorganisation: Der Knochen 2.1.1 Organische Knochenbestandteile: Kollagen und Osteocalcin 2.1.2 Anorganik des Knochens 2.1.3 Hierarchischer Aufbau des Knochens 2.1.4 Knochenzellen und die Knochenremodellierung 2.1.5 Physiologische Bedeutung von Calcium und Strontium 2.2 Materialien und Werkstoffe für den Knochenersatz 2.2.1 Synthetische Calciumphosphate 2.2.2 In vitro Mineralisation von organischen Makromolekülen 2.2.3 Bioaktivität von Knochenersatzmaterialien 2.2.4 Natürliche Knochenersatzmaterialien 2.2.5 Artifizielle Knochenersatzmaterialien 2.3 Zusammenfassung 3 Materialien und Methoden 3.1 Dual-Membran-Migrationsmethode und Doppelmigrationsmethode 3.1.1 Kollagenaufreinigung 3.1.2 Resuspendierung und Fibrillogenese des Tropokollagens 3.1.3 Dual-Membran-Migrationsmethode 3.1.4 Doppelmigrationsmethode 3.2 Fällungsreaktion im Batch-Prozess 3.2.1 Mineralpräzipitation – Mineralisation und Reifung 3.2.2 Mineralverarbeitung zur Probekörperherstellung 3.3 Charakterisierung und Analysemethoden 3.3.1 Strukturanalytik 3.3.2 Morphologische Untersuchungen 3.3.3 Mechanische Charakterisierung 3.3.4 Glühverlust 3.3.5 Optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP OES) 3.3.6 Dichte und Porosität 3.3.7 Degradation in physiologische Lösungen: Bioaktivität, pH Wertmessung und Masseänderung 3.3.8 Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen Monozyten 3.3.9 Biochemische Untersuchungsmethoden 3.4 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Analytik humanen Knochens 4.1.1 Transmissionselektronenmikroskopische Analyse 4.1.2 Hypothese der Kollagenmineralisation 4.2 Dual-Membran-Migrationsmethode: (Tropo-)Kollagen mit poly Asparaginsäure und Osteocalcin 4.2.1 Mineralisation von Kollagenscaffolds, suspendiertem fibrillärem Kollagen und Tropokollagen 4.2.2 Erkenntnisse aus der in vitro Mineralisation mittels DM3 4.3 Zusammenfassung zur Hypothese der in vivo Kollagenmineralisation mit in vitro Vergleich 4.4 Doppelmigrationsmethode: Mineralisation von Gelatine 4.4.1 Struktur der gebildeten Calciumphosphatphasen 4.4.2 Degradation der mineralisierten Gelatine 4.4.3 Untersuchung des Zellverhaltens in der Osteoblasten/Osteoklasten-Co-Kultivierung 4.4.4 Diskussion des ormoHAp-Aufbaus und der Einflussnahme auf die hMSC/Monozyten-Co-Kultur 4.5 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine durch Calciumphosphate 4.5.1 Kristallstruktur und Materialcharakterisierung 4.5.2 Analyse der mechanischen Eigenschaften, des Degradationsverhaltens und der Bioaktivität 4.5.3 In vitro Biokompatibilität von verpresstem gelatinemodifizierten Calciumphosphat 4.5.4 Zusammenfassung der Analytik des gelatinemodifizierten Calciumphosphats 4.6 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine in Gegenwart von Calcium- und Strontiumionen 4.6.1 Charakterisierung der gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphate 4.6.2 Probekörperherstellung 4.6.3 Eigenschaften des Biomaterials: Degradation und in vitro Biokompatibilität 4.6.4 Untersuchung der in vitro Biokompatibilität von gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphaten 4.6.5 Erste Resultate der in vivo Implantation im Femurdefekt osteoporotischer Ratten 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Quellenverzeichnis Anhang A1 Aufbereitungs- und Testchemikalien A2 Zellkulturmaterialien A3 Puffer und Lösungen A4 Technische Geräte, Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Eigene Publikationen und Mitautorschaften / From the point of view of clinicians - orthopedists and trauma surgeons - there is a great need for degradable bone substitutes for osteoporotic and cancerous bone. Fractures of the femoral neck or even the spine do not heal at all or only very slowly in these systemic diseases. Fractures of healthy bone heal with difficulty, especially in older patients, if large defect areas are present. While a defect of about 1.5 - 2 cm in a healthy patient is considered supercritical and thus requires the use of bone substitute material, a gap width of more than 3 mm in an elderly or affected person can be problematic. The Collaborative Research Center Transregio 79 with the topic 'Materials for Tissue Regeneration within Systemically Altered Bone' has taken up this problem and aims to solve it in an etiology-based manner by combining findings and characterization methods from materials science, biology and medicine. This dissertation was written within the framework of this project and in the Biomimetic Materials and Biomaterial Analysis Group of the Institute of Materials Science, Chair of Biomaterials, at the Technical University of Dresden. It is primarily concerned with the development of bone substitute materials for healthy and osteoporotic bone. Following the working hypothesis that defect/fracture healing in osteoporotic bone can be improved by bone substitute material consisting of calcium/strontium phosphates, the ion release is to be specifically adjusted by suitable crystal structures in order to stimulate bone reconstruction directly via osteoblast activity or indirectly via cytokine release by osteoclasts. Sufficient knowledge of the structure and composition of bone, of mineralization and of the cell biology of bone, including the immune system, is necessary for material development. At the beginning of the work, it was therefore necessary to deepen this knowledge of mineral formation in bone. An intensive cooperation with projects within the Transregio 79, which are dedicated to the structural elucidation and the cell biology of bone or which perform animal experiments, was therefore necessary. This linkage requires an in-depth examination of fracture healing in order to be able to work successfully on an interdisciplinary basis. In the course of material development, it proved advantageous to also carry out cell culture investigations in our own laboratory. They enabled faster implementation of cell reaction findings in the material concept. From the point of view of materials science, bone is an evolutionary composite material with outstanding mechanical and biological properties, consisting of organic and inorganic non-metallic components with a hierarchical structure. Collagen I and hydroxyapatite are its main components. In addition, however, there are a number of calcium phosphate structures and traces of foreign ions as well as non-collagenous proteins, whose action in the course of mineralization is poorly understood so far. The temporal sequence, the multitude of components involved and the cellular control result in an extensive variety of parameters, some of which elude a definitive cause-effect description by compensatory mechanisms. However, a discussion of bone structure is essential for orientation to the natural model. In addition, knowledge of the cellular response to extracellular influences is required for biomaterial characterization and suitable material modification. The researched material concept is characterized in detail in vitro and the material selection for the first in vivo application within the Transregio 79 in the osteoporotic rat model is discussed. The final summary brings together the partial findings and provides an outlook for further material development based on biomimetically mineralized organic macromolecules.:Danksagung Eigenständigkeitserklärung Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Stand des Wissens 2.1 Biomineralisation und Selbstorganisation: Der Knochen 2.1.1 Organische Knochenbestandteile: Kollagen und Osteocalcin 2.1.2 Anorganik des Knochens 2.1.3 Hierarchischer Aufbau des Knochens 2.1.4 Knochenzellen und die Knochenremodellierung 2.1.5 Physiologische Bedeutung von Calcium und Strontium 2.2 Materialien und Werkstoffe für den Knochenersatz 2.2.1 Synthetische Calciumphosphate 2.2.2 In vitro Mineralisation von organischen Makromolekülen 2.2.3 Bioaktivität von Knochenersatzmaterialien 2.2.4 Natürliche Knochenersatzmaterialien 2.2.5 Artifizielle Knochenersatzmaterialien 2.3 Zusammenfassung 3 Materialien und Methoden 3.1 Dual-Membran-Migrationsmethode und Doppelmigrationsmethode 3.1.1 Kollagenaufreinigung 3.1.2 Resuspendierung und Fibrillogenese des Tropokollagens 3.1.3 Dual-Membran-Migrationsmethode 3.1.4 Doppelmigrationsmethode 3.2 Fällungsreaktion im Batch-Prozess 3.2.1 Mineralpräzipitation – Mineralisation und Reifung 3.2.2 Mineralverarbeitung zur Probekörperherstellung 3.3 Charakterisierung und Analysemethoden 3.3.1 Strukturanalytik 3.3.2 Morphologische Untersuchungen 3.3.3 Mechanische Charakterisierung 3.3.4 Glühverlust 3.3.5 Optische Emissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP OES) 3.3.6 Dichte und Porosität 3.3.7 Degradation in physiologische Lösungen: Bioaktivität, pH Wertmessung und Masseänderung 3.3.8 Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen Monozyten 3.3.9 Biochemische Untersuchungsmethoden 3.4 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Analytik humanen Knochens 4.1.1 Transmissionselektronenmikroskopische Analyse 4.1.2 Hypothese der Kollagenmineralisation 4.2 Dual-Membran-Migrationsmethode: (Tropo-)Kollagen mit poly Asparaginsäure und Osteocalcin 4.2.1 Mineralisation von Kollagenscaffolds, suspendiertem fibrillärem Kollagen und Tropokollagen 4.2.2 Erkenntnisse aus der in vitro Mineralisation mittels DM3 4.3 Zusammenfassung zur Hypothese der in vivo Kollagenmineralisation mit in vitro Vergleich 4.4 Doppelmigrationsmethode: Mineralisation von Gelatine 4.4.1 Struktur der gebildeten Calciumphosphatphasen 4.4.2 Degradation der mineralisierten Gelatine 4.4.3 Untersuchung des Zellverhaltens in der Osteoblasten/Osteoklasten-Co-Kultivierung 4.4.4 Diskussion des ormoHAp-Aufbaus und der Einflussnahme auf die hMSC/Monozyten-Co-Kultur 4.5 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine durch Calciumphosphate 4.5.1 Kristallstruktur und Materialcharakterisierung 4.5.2 Analyse der mechanischen Eigenschaften, des Degradationsverhaltens und der Bioaktivität 4.5.3 In vitro Biokompatibilität von verpresstem gelatinemodifizierten Calciumphosphat 4.5.4 Zusammenfassung der Analytik des gelatinemodifizierten Calciumphosphats 4.6 Fällungsmethode: Mineralisierung von phosphatvorstrukturierter Gelatine in Gegenwart von Calcium- und Strontiumionen 4.6.1 Charakterisierung der gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphate 4.6.2 Probekörperherstellung 4.6.3 Eigenschaften des Biomaterials: Degradation und in vitro Biokompatibilität 4.6.4 Untersuchung der in vitro Biokompatibilität von gelatinemodifizierten Calcium-/Strontiumphosphaten 4.6.5 Erste Resultate der in vivo Implantation im Femurdefekt osteoporotischer Ratten 5 Zusammenfassung 6 Ausblick Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Quellenverzeichnis Anhang A1 Aufbereitungs- und Testchemikalien A2 Zellkulturmaterialien A3 Puffer und Lösungen A4 Technische Geräte, Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Eigene Publikationen und Mitautorschaften

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