Les cytochromes P450 (CYP450) sont des hémoprotéines intervenant généralement dans la détoxication de l’organisme sous forme de biodégradation de molécules xénobiotiques et participent à la décomposition de certains médicaments. Cependant, les gènes codant pour les protéines CYP450 sont souvent sous-analysés dans les études génomiques à grande échelle en raison de leur difficulté d’analyse due à un haut taux de polymorphisme. Deux sous-familles seront étudiées plus en profondeur: les sous-familles CYP3A et CYP4F. La sous-famille CYP3A métabolise environ 50% des médicaments alors que les enzymes CYP4F, quant à eux, sont impliquées dans le métabolisme de composés endogènes, de nutriments et de médicaments. Les gènes de ces sous-familles sont fortement polymorphes et ce, à travers les populations humaines. Ainsi, la variabilité entre les différentes populations peut affecter la réponse aux médicaments et autres fonctions métaboliques. Dans ce projet, deux grands jeux de données, l’un en génétique des populations (le Projet des 1000 Génomes) et l’autre en transcriptomique (GTEx) seront utilisés afin d’identifier des signatures de sélection naturelle dans les gènes CYP3A et CYP4F, ainsi que leur impact sur l’expression génique de ces gènes. Nous avons détecté différentes forces de sélection (positive et balancée) dans les deux sous-familles. Certains polymorphismes identifiés comme étant sous pression sélective sont associés à une expression différentielle des gènes des deux sous-familles. Ce projet permet de mieux comprendre l’impact des mutations sous pression sélective se situant dans les gènes des sous-familles CYP3A et CYP4F. Cette caractérisation génétique permettra d’obtenir des prédictions plus fiables en pharmacogénomique et en génomique humaine, en raison de l’influence de ces gènes sur la réponse aux médicaments. / Cytochromes P450 (CYP450) are hemoproteins generally involved in the detoxification of the body of xenobiotic molecules and participate in the metabolism of many drugs. Genetic polymorphisms have been found to impact drugs responses and metabolic functions. However, genes encoding CYP450 proteins are often under-analyzed in large-scale genomic studies because the difficulty of analysis due to of their high rate of polymorphism. In this study, we investigate the genetic diversity for CYP450 genes. We found that two clusters, CYP3A and CYP4F, are notably differentiated across human populations with evidence for selective pressures acting on both clusters. The CYP3A subfamily metabolizes approximately 50\% of drugs while CYP4F enzymes are involved in the metabolism of endogenous compounds, nutrients and drugs. Indeed, we found signals of recent positive selection in CYP3A and CYP4F genes and signals of balancing selection in CYP4F genes. Futhermore, unusual linkage disequilibrium is detected in both cluster, suggesting co-evolution. eQTLs were also found in both clusters which indicate co-regulation and epistasis.

Une résistance aux agents anticancéreux utilisés dans le traitement du cancer du sein est souvent associée à un échec de traitement. Des variations dans le devenir des agents anticancéreux dans l’organisme, sont des facteurs pouvant expliquer des phénomènes de résistance. Notre but était d’évaluer l’impact des isoenzymes du CYP450s, dans le métabolisme local des agents anticancéreux. Notre premier objectif était de valider un gène rapporteur pour nos analyses de PCR en temps réel. Pour ce faire, nous avons criblé l’expression de 6 gènes rapporteurs dans 23 lignées cellulaires. NUP-214 a été démontré comme étant le gène rapporteur le plus stable avec un écart-type de seulement 0.55 Ct. Notre deuxième objectif était de déterminer le niveau d’expression des ARNm de 19 isoformes du CYP450 dans plusieurs lignées cellulaires du cancer du sein. Les ARNm des CYP450s ont démontré une très grande variabilité entre les lignées cellulaires. Les isoformes CYP1B1 et CYP2J2 démontrent l’expression la plus importante pour la majorité des lignées. Notre troisième objectif était d’évaluer la corrélation entre l’expression des isoformes des CYP450s et leur activité métabolique en utilisant les substrats spécifiques du CYP1B1 et 2J2, 7-éthoxyrésorufine et ébastine, respectivement. Une forte corrélation (r2=0.99) fut observée entre l’activité métabolique vis-à-vis l’ébastine et l’expression du CYP2J2. De même, le métabolisme du 7-éthoxyrésorufine était fortement corrélé (r2=0.98) avec l’expression du CYP1B1. En résumé, ces résultats suggèrent que le métabolisme local des agents anticancéreux pourrait significativement moduler le devenir des agents anticancéreux dans l’organisme, et pourrait être ainsi, une source de résistance. / Several types of cancer cells have shown an innate or accute resistance to anti-cancer agents which in turn causes a failure in treatment. This resistance has been suggested to be caused by the expression of membrane transporters in cancer cells, as well as inter-individual variability in metabolism. Our interest was to evaluate the implication of CYP450 enzymes in the local metabolism of cancer cells. Our first objective was to screen the expression level of six housekeeping genes (HKG) using 23 different cell lines to determine which gene was the most stable. We found that NUP-214 was the most stable HKG across the panel of cell lines tested, with a standard deviation of only 0.55 Ct. Our second objective was to determine the expression level of 19 CYP450 mRNA isoforms in various breast cancer cell lines by RT-PCR. The CYP450 mRNAs showed a large variability between the different cell lines analyzed, where CYP1B1 and 2J2 were strongly expressed in most cell lines. Our third objective was to determine if measurable metabolic activity was present and correlates with mRNA expression in these same breast cancer cell lines using the specific substrates 7-ethoxyresorufin and ebastine for CYP1B1 and 2J2 activities, respectively. The metabolism of 7-ethoxyresorufin showed an excellent correlation of 0.98 with CYP1B1 expression while ebastine demonstrates a strong correlation (r2=0.99) with 2J2 expression. Overall, these results suggest that local metabolism of anti-cancer agents could significantly affect drug disposition and be a source of chemoresistance.

Aristolochic acids (AA) are human carcinogens which have also very strong nephrotoxic properties. A mixture of AA is present in Aristolochiacae plant species. These plants were and still are used in traditional medicine in some countries, particularly in Asia. Aristolochic acids participate in development of two types of nephropathies. The first disease is designated as Aristolochic Acid Nephropathy (AAN), the second one is Balkan Endemic Nephropathy (BEN). Both nephropathies are associated with urothelial malignancies, which are caused by AA. One of the common features of ANN and BEN is that not all individuals exposed to AA suffer from nephropathy and tumour development. One cause for these different responses may be individual differences in the activities and expression levels of the enzymes catalyzing the biotransformation of AAI, the major toxic component of AA contained in Aristolochia species. Detailed knowledge of enzymes which participate in metabolism of AAI may contribute to elucidation of inter-individual susceptibility to AAN, BEN and later urothelial malignancies. Aristolochic acid I is either oxidative detoxicated or reductive activated by biotransformation enzymes. Reductive bioactiovation of AAI leads to formation of covalent AA-DNA adducts in organism which result in producing of...

Une résistance aux agents anticancéreux utilisés dans le traitement du cancer du sein est souvent associée à un échec de traitement. Des variations dans le devenir des agents anticancéreux dans l’organisme, sont des facteurs pouvant expliquer des phénomènes de résistance. Notre but était d’évaluer l’impact des isoenzymes du CYP450s, dans le métabolisme local des agents anticancéreux. Notre premier objectif était de valider un gène rapporteur pour nos analyses de PCR en temps réel. Pour ce faire, nous avons criblé l’expression de 6 gènes rapporteurs dans 23 lignées cellulaires. NUP-214 a été démontré comme étant le gène rapporteur le plus stable avec un écart-type de seulement 0.55 Ct. Notre deuxième objectif était de déterminer le niveau d’expression des ARNm de 19 isoformes du CYP450 dans plusieurs lignées cellulaires du cancer du sein. Les ARNm des CYP450s ont démontré une très grande variabilité entre les lignées cellulaires. Les isoformes CYP1B1 et CYP2J2 démontrent l’expression la plus importante pour la majorité des lignées. Notre troisième objectif était d’évaluer la corrélation entre l’expression des isoformes des CYP450s et leur activité métabolique en utilisant les substrats spécifiques du CYP1B1 et 2J2, 7-éthoxyrésorufine et ébastine, respectivement. Une forte corrélation (r2=0.99) fut observée entre l’activité métabolique vis-à-vis l’ébastine et l’expression du CYP2J2. De même, le métabolisme du 7-éthoxyrésorufine était fortement corrélé (r2=0.98) avec l’expression du CYP1B1. En résumé, ces résultats suggèrent que le métabolisme local des agents anticancéreux pourrait significativement moduler le devenir des agents anticancéreux dans l’organisme, et pourrait être ainsi, une source de résistance. / Several types of cancer cells have shown an innate or accute resistance to anti-cancer agents which in turn causes a failure in treatment. This resistance has been suggested to be caused by the expression of membrane transporters in cancer cells, as well as inter-individual variability in metabolism. Our interest was to evaluate the implication of CYP450 enzymes in the local metabolism of cancer cells. Our first objective was to screen the expression level of six housekeeping genes (HKG) using 23 different cell lines to determine which gene was the most stable. We found that NUP-214 was the most stable HKG across the panel of cell lines tested, with a standard deviation of only 0.55 Ct. Our second objective was to determine the expression level of 19 CYP450 mRNA isoforms in various breast cancer cell lines by RT-PCR. The CYP450 mRNAs showed a large variability between the different cell lines analyzed, where CYP1B1 and 2J2 were strongly expressed in most cell lines. Our third objective was to determine if measurable metabolic activity was present and correlates with mRNA expression in these same breast cancer cell lines using the specific substrates 7-ethoxyresorufin and ebastine for CYP1B1 and 2J2 activities, respectively. The metabolism of 7-ethoxyresorufin showed an excellent correlation of 0.98 with CYP1B1 expression while ebastine demonstrates a strong correlation (r2=0.99) with 2J2 expression. Overall, these results suggest that local metabolism of anti-cancer agents could significantly affect drug disposition and be a source of chemoresistance.

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Les plantes produisent une remarquable diversité de métabolites pour faire face aux contraintes d’un environnement en constante fluctuation. Cependant la manière dont les plantes ont atteint un tel degré de complexité métabolique et les forces responsables de cette diversité chimique reste largement incomprise. On considère généralement que le mécanisme de duplication des gènes contribue pour une grande part à l’évolution naturelle. En absence de transfert horizontal, les gènes d’évolution récente se cantonnent généralement chez quelques espèces et sont soumis à une évolution rapide, alors que les gènes conservés et plus anciens ont une distribution beaucoup plus large et sont porteurs de fonctions essentielles. Il est donc intéressant d’étudier l’adaptation des plantes en analysant parallèlement les gènes qui présentent soit une large distribution taxonomique, soit une distribution plus restreinte, de type lignée-spécifique. Les cytochromes P450 (CYP) constituent l’une des plus vastes familles de protéines chez les plantes, présentant des phylogénies très conservées ou très branchées qui illustrent la plasticité métabolique et la diversité chimique. Pour illustrer l’évolution des fonctions des cytochromes P450 dans le métabolisme végétal, nous avons sélectionné trois gènes, l’un très conservé au cours de l’évolution, CYP715A1 et les deux autres, CYP98A8 et CYP98A9, très récemment spécialisés de manière lignée spécifique chez les Brassicaceae. Les gènes appartenant à la famille CYP715 ont évolué avant la divergence entre gymnospermes et angiospermes, et sont le plus souvent présent en copie unique dans les génomes végétaux. Ceci suggère que leur fonction est essentielle et très conservée chez les plantes à graines (spermaphytes). Sur la base d’une analyse transcriptionnelle et de l’expression du gène GUS sous le contrôle du promoteur de CYP715A1, il est apparu que ce gène est spécifiquement exprimé au cours du développement floral, dans les cellules tapétales des jeunes boutons floraux ainsi que dans les filaments lors de l’anthèse. CYP715A1 est également fortement induit dans les cellules du péricycle de la zone d’élongation racinaire en réponse au stress salin. L’induction par le sel nécessite une région promotrice située entre 2 et 3 kb en amont de la région codante (i.e ; codon START), ce qui suggère la présence d’un facteur cis à cet endroit. Afin de déterminer la fonction de CYP715A1 chez Arabidopsis thaliana, j’ai identifié deux mutants d’insertion de T-DNA par génotypage et complémenté ces mutants avec le gène natif. La perte de fonction de CYP715A1 n’a pas d’impact sur la croissance et la fertilité de la plante en conditions de laboratoire. Cependant, une analyse par microscopie électronique en transmission montre un phénotype d’intine ondulée. La perte de fonction du gène CYP715A1 a également entraîné une réduction de la taille des pétales et un défaut d’anthèse. [...] / Plants produce a remarkable diversity of secondary metabolites to face continually challenging and fluctuating environmental constraints. However, how plants have reached such a high degree of metabolic complexity and what are the evolutionary forces responsible for this chemodiversity still remain largely unclarified. Gene evolution based on gene birth and extinction has been reported to nicely reflect the natural evolution. Without horizontal gene transfer, young genes are often restricted to a few species and have undergone rapid evolution, whereas old genes can be broadly distributed and are always indicative of essential housekeeping functions. It is thus of interest to study plant adaptation with parallel focus on both taxonomically widespread and lineage-specific genes. P450s are one of the largest protein families in plants, featuring both conserved and branched phylogenies. Examples of P450 properties reflecting metabolic versatility, chemodiversity and thus plant adaptation have been reported. To illustrate evolution of P450 functions in plant metabolism, we selected two P450 genes, one evolutionary conserved CYP715A1 and the second a recently specialized lineage-specific gene CYP98A9 in Arabidopsis thaliana.CYP715s evolved before the divergence between gymnosperms and angiosperms and are present in single copy in most sequenced plant genomes, suggesting an essential housekeeping function highly conserved across seed plants. Based on transcriptome analysis and promoter-driven GUS expression, CYP715A1 is selectively expressed in tapetal cells of young buds and filaments of open flowers during flower development. In addition, CYP715A1 is highly induced in the pericycle cells of the root elongation zone upon salt stress. The salt induction relies on the 2-3kb region of CYP715A1 promoter, suggesting some salt-response elements may exist in this area. To characterize the function of CYP715A1 in Arabidopsis, I identified two T-DNA insertion mutants by genotyping and confirmed by complementation with native CYP715A1 gene. Loss of function of CYP715A1 has no impact on plant growth and fertility in laboratory conditions. However, transmission electron microscopy (TEM) analysis has shown constant undulated intine phenotype in two knockout mutants and also the petal growth is significantly inhibited. These two phenotypes nicely match the native expression pattern of CYP715A1. Gene co-expression analysis suggests involvement of CYP715A1 in gibberellin (GA) metabolism under salt treatment. GAs profiling on mutant flowers also indicates reduced accumulation specific GAs. Unfortunately, no significant phenotype either related to root growth or root architecture under salt treatment can be observed. Recombinant expression of the CYP715A1 enzyme in yeast so far does not allow confirming GAmetabolism. However, metabolic profiling of inflorescences in mutants and over-expression lines, together with transcriptome analysis of the loss of function cyp715a1 mutants strongly support a CYP715A1 role in signaling, hormone homeostasis and volatile emission in agreement with the purifying selection leading to gene conservation observed in spermatophytes.[...]

Les infections par les nématodes gastro-intestinaux entrainent des baisses en productions animales et des pertes économiques majeures pour les éleveurs. Les lactones macrocycliques (LMs) sont parmi les antiparasitaires les plus utilisés dans la lutte contre les nématodes gastro-intestinaux en médecine vétérinaire. De part une utilisation intensive, des résistances aux LMs chez les parasites gastro-intestinaux se sont développées au sein des élevages du monde entier mettant en péril l'efficacité thérapeutique de ces molécules. Par ailleurs, le développement de nouveaux antiparasitaires est limité. Ainsi, un des enjeux pour assurer le contrôle de ces parasites est de ralentir les phénomènes de résistance aux LMs afin de prolonger leur efficacité. Le succès d'une telle stratégie repose sur les connaissances précises des mécanismes impliqués dans la résistance. Parmi eux, la modulation des systèmes de détoxification est décrite lors de phénomènes de résistance aux LMs. Au cours de ces travaux, nous avons étudiés la régulation des systèmes de détoxification, en réponse à l'ivermectine chez l'hôte. Nous avons montré, en comparaison à une administration unique, qu'une administration répétée d'ivermectine par voie orale chez la souris est responsable de l'induction de l'expression de certains gènes transporteurs ABC et cytochromes impliqués dans son métabolisme. Ceci entraîne, à la fois, une diminution de la concentration de la molécule parentale et une augmentation de la teneur de son métabolite principal dans le plasma et l'intestin. Ensuite, nous avons étudié l'implication des mécanismes de régulation des systèmes de détoxification, et notamment les récepteurs nucléaires, dans la tolérance à l'ivermectine chez le nématode C.elegans. Nous avons montré que le récepteur nucléaire nhr-a est important pour la tolérance et le développement de la résistance à l'ivermectine. Enfin, nous avons étudié l'impact d'inhibiteurs des transporteurs ABC sur l'efficacité de l'ivermectine. Nous avons mis en évidence la capacité de certains flavonoïdes et de l'ivermectine aglycone à potentialiser l'efficacité de l'ivermectine chez le nématode. Une exposition d'ivermectine induit la surexpression des systèmes de détoxification chez l'hôte. Ceci pourrait être la base des mécanismes moléculaires de la résistance chez le nématode. Cibler les systèmes de détoxification ou les mécanismes de résistance, par des inhibiteurs adaptés, représente une stratégie pertinente pour potentialiser l'efficacité de l'ivermectine. / Infections with gastrointestinal nematodes (GINs) in livestock leads to major losses in production and consequently impact economically farmers. Their intensive use has led to widespread anthelmintic resistance which is nowadays the main threat on the sustainable control of GINs in livestock. The development of new anthelmintic is limited due to the cost of such process. Then, the challenge remains in optimizing the use of existing molecules. Therefore, it is urgent to limit and control MLs resistance in order to extend their efficacy and to avoid therapeutic failure. Resistance mechanisms remain to be elucidated. In that context, we investigated regulatory mechanism of detoxification systems of ivermectin implicated in therapeutic efficacy in host and resistance development in nematode. Therapeutic combinations of ivermectin with flavonoïds have been evaluated to potentiate its efficacy in nematode. We showed that repeated oral administration of ivermectin induced gene expression encoding some ABC efflux transporters and cytochromes involved in its metabolism. Compared with single administration, repeated ivermectin administration lowered plasma, liver and intestine drug concentration, while increasing main metabolite content in plasma and intestine. We have also shown that nuclear receptor nhr-a was important for ivermectin tolerance and ivermectin development of resistance in C. elegans. Finally, we demonstrated the ability of the flavonoïd phloretin to potentiate ivermectin efficacy in the nematode C. elegans. Taken together, these data suggest that induction of detoxification systems impact on ivermectin distribution and targeting their regulation could be an appropriate strategy to potentiate ivermectin efficacy in host and to reverse resistance in nematode.

Present doctoral thesis contributed to understanding of mechanistic principles of two enzymes participating in the process of carcinogenesis; DNA polymerase  (pol ) and cytochromes P450 (CYP). Pol  is part of the DNA base-excision repair mechanism (BER). The primary role of pol  in, the BER mechanism, is inserting a new nucleotide into a DNA strand according to Watson-Crick base pairing rules. Pol  plays an important role in the process of carcinogenesis, approximately 30 % of human tumors express pol  mutants. The ability of pol  to discriminate between "right" and "wrong" nucleotide during the insertion process is called fidelity. We employed computational methods to elucidate molecular basis of the fidelity of pol . First, the relative free energy calculation method LRA was employed to compare differences in free energies between the "right" and "wrong" nucleotide during its insertion into DNA. The results indicated a better stabilization of transition-state of the nucleophilic substitution catalyzed by pol  in the case of the "right" versus "wrong" nucleotide. This difference resulted in an 80-fold contribution to its fidelity. Further, computational methods FEP and LIE were used to examine how mutations effect fidelity of pol . Results were than correlated with experimental data...

Despite advances in cancer diagnosis and therapy, cancer is the second leading cause of death globally. The improvements of cancer treatment are the major challenge in this research. The aim of the thesis was studying of effects of two anticancer drugs ellipticine (Elli) and doxorubicin (DOX) on some cancer and healthy cell lines. Specific consideration was given to expand current knowledge about the metabolism and cytostatic effects of Elli in neuroblastoma cell lines. Another part of this study was focused on mechanisms contributing to the development of ellipticine-resistance in cancer cells and influence of histone deacetylase inhibitors on anticancer therapy was investigated. Moreover, the aim was to develop apoferritin (Apo) nanocarrier suitable for the active transport of cytostatics to cancer cells. Several essential data were found in this doctoral thesis. Anticancer efficiency of Elli depends on the CYP3A4-mediated metabolism in cancer. The CYP3A4 enzyme encapsulated into two nanoparticle forms, liposomes and SupersomesTM , was tested to activate ellipticine to its reactive species forming covalent DNA adducts. The formation of adducts seems to be dependent on concentrations of CYP3A4 in nanoparticle systems. A higher effectiveness of CYP3A4 in SupersomesTM than in liposomes to form...