Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2006. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Neurology and Neurosurgery. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/09). Includes bibliographical references.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Göteborgs universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Univ., 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Licentiatavhandling (sammanfattning) Linköping : Linköpings universitet, 2009. / Härtill 2 uppsatser.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação Nanociência e Nanobiotecnologia, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-25T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2016_AliciaSimalieOmbredane.pdf: 2064852 bytes, checksum: b44036cc1dea0669306297b2c133343e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-25T20:43:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AliciaSimalieOmbredane.pdf: 2064852 bytes, checksum: b44036cc1dea0669306297b2c133343e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T20:43:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AliciaSimalieOmbredane.pdf: 2064852 bytes, checksum: b44036cc1dea0669306297b2c133343e (MD5) / O câncer de pele não melanoma (CPNM) é o tipo de tumor de maior incidência no Brasil, e o subtipo maligno denominado de carcinoma epidermoide representa 70% das mortes por CPNM. Os tratamentos convencionais apresentam grande chance de cura, entretanto, são geralmente associados a vários efeitos colaterais adversos localizados e/ou sistêmicos. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é de grande interesse. O uso de compostos naturais e de nanopartículas de prata (AgNPs) demonstram uma grande relevância para o tratamento de vários tipos de câncer. Adicionalmente, a síntese verde de AgNPs consiste em utilizar organismos biológicos e/ou biomoléculas isoladas como agentes redutores e estabilizantes. Portanto, o método de síntese se torna mais eco-amigável, de menor custo e biocompatível. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho é de sintetizar AgNPs utilizando extrato aquoso (EA) do tubérculo de açafrão (Curcuma longa) e nitrato de prata (AgNO3), associá-las com polímeros de quitosana, caracterizá-las, avaliar a citotoxicidade em células tumorais de CPNM (A431) e não tumorais (queratinócitos - HaCAT) e investigar seus possíveis mecanismos de ação em linhagem de CPNM (A431), in vitro. O rendimento da síntese de AgNPs foi dependente da variação de temperatura de armazenamento da C. longa, do método de extração, da temperatura de síntese e da concentração de EA e de AgNO3. Após a otimização da síntese (C. longa armazenada a temperatura ambiente, extração por fervura, síntese a 75°C por 24 horas com 2 mg/mL de EA e 1 mM de AgNO3) a quitosana foi utilizada para recobrir as AgNPs devido às suas propriedades de biocompatibilidade, biodegradabilidade e bioadesividade. As AgNPs obtidas apresentaram uma homogeneidade e estabilidade coloidal moderadas (PdI de 0,319 ± 0,043 e potencial Zeta de -24,8 ± 2,2 mV) com diâmetro hidrodinâmico (DH) de 210,3 ± 57,1 nm. Em paralelo, as AgNPs recobertas por quitosana (CH-AgNPs) apresentaram DH de 328,0 ± 61,6 nm, moderada homogeneidade (PdI de 0,372 ± 0,059) e estabilidade coloidal (potencial Zeta de +53,9 ± 3,1 mV). A forma das nanopartículas foi avaliada por técnicas de microscopia. As amostras demonstraram ser estáveis por 30 dias a 4°C. Além disso, ambas demonstraram atividade citotóxica dose-dependente em células A431 e HaCAT. A investigação dos possíveis mecanismos de ação das AgNPs expostas às células A431 por 24 horas a 50μM demonstrou a indução de lesão de membrana plasmática (50%), diminuição da proliferação celular (50%), aumento da taxa de fragmentação de DNA (40%) e do potencial de membrana mitocondrial. Além disso, as CH-AgNPs bloquearam as células em fase G1 do ciclo celular e apresentaram maior marcação por Anexina-V, sugerindo morte celular por apoptose. Em suma, pode-se concluir que a síntese verde demonstrou ser uma boa alternativa para a obtenção de AgNPs com grande potencial citotóxico. A associação com a quitosana pode representar um potencial promissor para o tratamento de CPMN. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nonmelanoma skin cancers (NMSC) represents the most incident tumor in Brazil, and the malignant subtype squamous cell carcinoma accounts for 70% of deaths from NMSC. Conventional treatments have great chance of cure, however, they are usually associated with several localized and/or systemic adverse side effects. Therefore, the development of new therapeutic strategies is of great interest. The use of natural compounds and silver nanoparticles (AgNPs) showed a great importance for the treatment of various cancers. Additionally, the green synthesis of AgNPs consists of using biological organisms and/or biomolecules isolated as reducing agents and stabilizers. Therefore, this method of synthesis becomes more eco-friendly, less costly and biocompatible. Given the above, the objective of this study is to synthesize AgNPs using aqueous extract (EA) of turmeric tuber (Curcuma longa) and silver nitrate (AgNO3), associate them with chitosan polymers, characterize them, analyze the cytotoxicity NMSC tumor (A431) and non-tumor cells (keratinocytes - HaCaT) and investigate the possible mechanisms of action in NMSC cells line (A431) in vitro. The yield of synthesis was dependent on the variation of the storage temperature of C. longa, the method of extraction, the temperature of synthesis and the concentration of EA and AgNO3. After optimization of the synthesis parameters (C. longa stored at room temperature, extraction by boiling, and synthesis at 75°C for 24 hours with 2 mg/ml EA and 1 mM AgNO3) chitosan was used to coat AgNPs due to its properties of biocompatibility, biodegradability and bioadhesiveness. The obtained AgNPs showed a moderate homogeneity and colloidal stability (0.319 ± 0.043 PDI and Zeta potential of - 24.8 ± 2.2 mV) with hydrodynamic diameter (HD) of 210.3 ± 57.1 nm. In parallel, covered with chitosan (CH-AgNPs) exhibited HD of 328.0 ± 61.6 nm, moderate homogeneity (PDI 0.372 ± 0.059), and colloidal stability (Zeta potential of +53.9 ± 3.1 mV). The shape of the nanoparticles was analyzed by microscopy techniques. The samples proved to be stable for 30 days at 4°C. In addition, both showed dosedependent cytotoxic activity in HaCaT and A431 cells. The investigation of possible mechanisms of action of AgNPs exposed to A431 cells for 24 hours at 50 μM demonstrated the induction of plasma membrane injury (50%), reduction of cell proliferation (50%), increased of DNA fragmentation rate (40%) and mitochondrial membrane potential and induction of cell death by apoptosis. Furthermore, CH-AgNPs blocked cells in G1 phase of the cell cycle and presented anexin-V dialing suggesting cell death by apoptosis. In short, it can be concluded that the green synthesis proved to be a good alternative for obtaining AgNPs with high cytotoxic potential. The association with chitosan may represent a promising potential for the treatment of CPMN.

O número total de nevos melanocíticos (NM) é um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma cutâneo (MC); além disso, em uma significativa fração dos casos os NM podem ser também precursores desta neoplasia. CDKN2A é o gene supressor tumoral mais implicado na gênese do melanoma. As mutações desse gene ocorrem em aproximadamente 40% dos casos de melanoma familiar, enquanto o silenciamento não mutacional ocorre em até 75% dos melanomas esporádicos. Ele codifica a proteína p16, que tem sua expressão progressivamente diminuída com a evolução do melanoma, sendo bem expressa nos NM e pouco expressa nos melanomas avançados. O presente estudo avaliou as alterações na expressão imunoistoquímica (IHQ) da proteína p16 nos melanócitos dos NM expostos a duas doses eritematosas mínimas (DEM) de radiação ultravioleta B (RUVB), ou a trauma mecânico controlado. Trinta e sete NM tiveram metade de sua superfície exposta à RUVB enquanto 44 NM foram parcialmente dermoabradidos. A expressão IHQ da p16 estava significativamente diminuída no lado irradiado dos NM, comparada com o lado controle. Não houve diferença estatisticamente significativa na expressão IHQ da proteína p16 nos NM dermoabradidos.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: O melanoma é decorrente de um crescimento celular descontrolado, com perda de inibição por contato e alterações no núcleo, afetando a manutenção dos telômeros. A telomerase, responsável pela síntese do telômero, protege o final da molécula de DNA. Sua atividade está ausente na maioria das células somáticas humanas e presente em quase todas linhagens de células tronco, germinativas e em mais de 90% dos tumores humanos. Estudos sugerem que a progressão de doenças malignas depende da reativação da telomerase, e que um agente inibidor dessa enzima poderia ser uma droga antitumoral efetiva, entre elas, o azidotimidinatrifosfato (AZT), sendo provado que o uso dessa droga em algumas neoplasias inibe in vitro sua ação. Objetivo: Avaliação da atividade da telomerase e da proliferação de células imortalizadas de melanoma Hs839T catalogo CRL-7572 submetidas à ação do AZT. Métodos: Foram utilizadas, linhagens de células de melanoma Hs839T catalogo CRL-7572, adquiridas via American Type Culture Collection, derivada da pele de um indivíduo caucasiano do sexo feminino de 42 anos. As células foram cultivadas em meio de cultura, suplementadas com diferentes concentrações de AZT em triplicata com 50, 100 e 200µM por 24h e 48h e comparados seus efeitos ao grupo controle. A avaliação da proliferação celular foi realizada pela técnica de MTT. A detecção da atividade da telomerase por KIT TRAPEZE® RT s7710 e PCR ELISA. Resultados: No tempo de 24 horas, quando comparado ao grupo controle, não houve inibição da proliferação celular e da atividade da telomerase da linhagem de melanoma Hs839T catalogo CRL-7572, embora sugira tendência à diminuição, quando comparados os grupos controle e 200µM. No tempo de 48 horas, houve uma diminuição momentânea, seguida de rápida recuperação, sugerindo que as células de linhagem utilizadas neste estudo são sensíveis ao AZT, mas que recuperam a atividade enzimática e proliferativa. Conclusão: A ação do AZT em células de melanoma HS839.T catalogo CRL-7572 estudadas nas concentrações e tempos propostos, não inibiu a atividade da telomerase e não afetou a proliferação celular. / Introduction: Melanoma is caused by an uncontrolled cell growth, with lossof inhibition contact and changes in the nucleus, affecting the maintenance of telomeres. Telomerase, responsible for telomere synthesis, protects the end of the DNA molecule. Its activity is absent in most human somatic cells and present in almost all lines of stem cells, germinatives, and in more than 90% of human tumors. Studies suggest that the malignancy progression depends on the telomerase reactivation, and that an inhibitor of this enzyme could be an effective antitumor drug, including the Azidothymidine-triphosphate (AZT) and proved that the use of this drug in some neoplasms inhibits their action “in vitro”. Objective: Evaluation of telomerase activity and proliferation of melanoma cells immortalized Hs839T catalog CRL-7572 subjected to the AZT action. Methods: We used melanoma cell lines of Hs839T catalog CRL-7572, acquired through American Type Culture Collection, derived from the skin of a 42-year-old Caucasian female person. The cells were grown in culture environment supplemented with different AZT concentrations in triplicate 50, 100 and 200µM) withim 24 and 48 hours and its effects compared to the control group. The cell proliferation evaluation was performed by MTT. Detection of telomerase activity by KIT S7710 TRAPEZE ® RT and PCR ELISA. Results: In 24 hours time, when compared to the control group, there was no inhibition of proliferation cell and telomerase activity, although there was tendency to decrease when compared to the control group and 200µM. In 48 hours time, there was a momentary decrease, followed by rapid recovery, suggesting that the cell lines used in this study are sensitive to AZT, but they recover the enzyme activity and proliferation. Conclusion: The action of AZT in melanoma cells HS839.T studied in the proposed concentrations and times did not inhibit telomerase activity and did not affect cell proliferation. / FAPESP: 07/59225-0 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citocinas do tipo 2 estão presentes em fases mais avançadas do desenvolvimento de diversos tumores humanos, funcionando em alguns casos como fatores prognósticos de neoplasias. O desenvolvimento do melanoma murino B16F10 está relacionado a um aumento na produção de IL-10 por células NK e linfócitos T CD4+ e uma diminuição acentuada na produção de IFN- por essas células, nas fases mais avançadas da progressão tumoral. Embora o modelo singeneico do melanoma murino B16F10-Nex2 apresente baixa imunogenicidade in vivo, uma pequena porcentagem de camundongos C57Bl/6 são naturalmente resistentes ao desenvolvimento subcutâneo desse tumor, mesmo após mais de uma inoculação das células tumorais. Animais naturalmente resistentes produziram maiores concentrações de IFN- e animais susceptíveis ao tumor produziram maiores concentrações de interleucinas anti-inflamatórias, IL-10 e IL-6. Confirmando o papel imunoregulador negativo da IL-10 na resposta imune protetora natural desse modelo, camundongos geneticamente deficientes em IL-10 (IL-10KO) foram mais resistentes à implantação subcutânea de células B16F10-Nex2. Animais que resistiram à progressão tumoral produziram uma resposta protetora com perfil de citocinas do tipo 1 (IFN- e IL-12), e a proteção foi dependente de IFN- . Macrófagos e células dendríticas de animais IL-10KO após estímulo in vitro com antígenos do melanoma B16F10-Nex2 apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN- , TNF- e IL-12) e uma maior expressão de marcadores de ativação celular (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Com a transferência adotiva de células dendríticas IL-10KO, mas não IL-10 competentes, associadas a um lisado de células B16F10-Nex2, animais C57Bl/6 foram protegidos contra o desenvolvimento tumoral, sugerindo que células dendríticas que não expressam IL-10 sejam responsáveis pela indução da resposta protetora natural mais eficiente observada em animais IL-10KO. Tendo em vista o papel imunossupressor da IL-10 na resposta protetora induzida pelo melanoma B16F10-Nex2, foi construído um vetor plasmidial eucariótico contendo o mini-gene referente à porção extracelular do receptor da IL-10 murina, a ser utilizado em protocolos de terapia gênica para neutralização da IL-10 in vivo pela expressão de um receptor decoy da interleucina. Animais tratados com o plasmídeo recombinante apresentaram aumento na sobrevida, em um efeito dependente de IFN- e potencializado pela associação de uma terapia gênica adjuvante para produção de IL-12. Células dendríticas de animais C57Bl/6 foram transfectadas com esse plasmídeo recombinante, associadas a antígenos tumorais e transferidas adotivamente à animais C57Bl/6, que foram subsequentemente desafiados com células tumorais subcutaneamente. Essas células, que tiveram o IL-10 neutralizado pelo receptor decoy, induziram resposta protetora significativamente mais eficiente que as células controle transfectadas com o plasmídeo vazio, sugerindo que essas células estejam envolvidas in vivo na indução da resposta protetora observada após a imunização com o plasmídeo recombinante e neutralização da IL-10 sistêmica. Concluímos que a terapia gênica desenvolvida foi eficaz na neutralização da IL-10 sistêmica, podendo ser aplicada como uma nova alternativa imunoterapêutica antitumoral. / Type 2 cytokines are increased in late phases of several human tumors, and in some cases are considered prognostic factors for these neoplasias. Late development phases of murine melanoma B16F10 correlate with an increased production of IL-10 by NK cells and CD4+ T lymphocytes, and also with a decreased production of IFN- by these cells. Syngeneic murine melanoma B16F10-Nex2 shows low immunogenicity in vivo, however, a small percentage of C57Bl/6 mice are naturally resistant to subcutaneous tumor development, even after several tumor cell inoculations. Naturally resistant animals produced higher concentrations of IFN- and tumor susceptible animals produced higher concentrations of anti-inflammatory cytokines, IL-10 and IL-6. The immunoregulatory role of IL-10 on the natural protective immune response induced in this model was confirmed by the increased resistance to tumor development observed in IL-10 genetically-deficient mice (IL- 10KO) subcutaneously inoculated with B16F10-Nex2 cells. A type 1 immune reponse (IFN- and IL-12) was induced in resistant IL-10KO animals, and the protection was IFN- -dependent. IL-10KO macrophages and dendritic cells stimulated in vitro with B16F10-Nex2 melanoma antigens secreted higher concentrations of proinflammatory cytokines (IFN- , TNF- e IL-12), and expressed an increased amount of surface activation markers (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Adoptive transfer of IL-10KO dendritic cells, but not IL-10-competent cells, in association with tumor antigens, induced a protective response in C57Bl/6 mice, suggesting that IL-10-negative dendritic cells induce the efficient protective response observed in IL-10KO animals. As IL-10 showed a clear immunosuppressive role on the natural protective response induced by B16F10-Nex2 cells, we constructed an eukaryotic plasmidial vector carrying the murine IL-10 receptor extracellular portion gene, to be used in gene therapy protocols for IL-10 neutralization in vivo by the expression of a decoy receptor. Recombinant plasmid-treated animals showed an IFN- -dependent increased survival, and this protective effect was augmented by the association with an adjuvant IL-12 gene therapy Dendritic cells from C57Bl/6 animals were transfected with recombinant plasmid, adoptively transferred to C57Bl/6 mice, and treated animals were challenged subcutaneously with B16F10-Nex2 tumor cells. Interleukin-10-neutralized dendritic cells induced a significantly increased survival, as compared to IL-10-containing dendritic cells, suggesting that dendritic cells induce the protective response observed in vivo after recombinant plasmid immunization and systemic IL-10 neutralization. We concluded that gene therapy using a plasmid expressing the IL-10 receptor extracellular region was effective on systemic IL-10 neutralization, and this tool could be used as a novel antitumor immunotherapeutic alternative. / BV UNIFESP: Teses e dissertações