Melanoma is a skin cancer that relies on angiogenesis for growth and progression. Angiogenesis is the growth of new vessels from existing vessels and follows a number of steps that include endothelial cell growth, migration and tubulogenesis. Current anti-angiogenic drugs are not effective in the treatment of melanomas due to serious side effects such as hypertension and the development of resistance. On the other hand, gold nanoparticles (AuNPs) have been reported to be biocompatible in preclinical models. Furthermore, AuNPs were shown to be cytotoxic to prostate cancer cells. In human umbilical vein endothelial cells, AuNPs inhibited the angiogenic protein, vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A). Therefore, the study aimed to investigate the possible cytotoxic effects of AuNPs (1.2–3.2 nM) on melanoma cells and angiogenesis parameters (endothelial cell growth and migration) as well as on the levels of angiogenesis promoting proteins, VEGF-A and placental growth factor (PIGF). Melanoma (B16-F10) cells and tumour-derived endothelial (sEnd.2) cells were maintained in an incubator in a humidified atmosphere containing 5% CO2 at a temperature of 37°C. To investigate whether AuNPs were cytotoxic to melanoma cells, the effect of the particles on B16-F10 cell survival was measured using the crystal violet assay. To determine the effects of AuNPs on angiogenesis parameters, endothelial cell (EC) growth and migration were investigated using crystal violet assay and the scratch assay respectively. Also, EC morphology was studied using polarisation-optical interference contrast light microscopy. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the effects of AuNPs on the levels of VEGF-A and PIGF. The results showed that AuNPs decreased the viability of melanoma and endothelial cells. The scratch assay showed that more ECs migrated in cultured treated with AuNPs (P < 0.05). The concentration of VEGF-A and PIGF was reduced significantly following treatment with AuNPs, meaning that the particles exhibited anti-angiogenic properties. This outcome provides a basis for further testing of AuNPs as a potential treatment for melanoma. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2020. / National Research Foundation / Mintek / Physiology / MSc / Unrestricted

Skin cancer rates continue to rise affecting millions of individuals annually. While cutaneous malignant melanoma comprises a fraction of total skin cancers diagnosed, melanoma is associated with a poor prognosis and higher mortality rate when compared to other forms of skin cancer. The greatest risk factor for skin cancer is the amount of ultraviolet light exposure making skin cancer the most common preventable form of cancer. In conjunction with primary prevention, part of secondary prevention measures involves performing routine skin examinations. According to data from the National Health Interview Survey, only 8% of individuals who had seen a primary care provider in the previous 12 months had a skin examination performed (Johnson et al., 2017). A low rate of skin examination can largely be attributed to current professional guidelines from the United States Preventative Services Task Force (2016) not supporting routine skin screening of all patients. Despite the recommendation, primary care providers are consistently faced with the need to evaluate skin lesions. Other barriers identified include lack of training and practical screening methods. Dermoscopy is a noninvasive technique for identifying skin lesions. Based on the need for improved screening practices and identified barriers, a brief educational session and resource on skin cancer and dermoscopy was presented to primary care providers at an urban family practice clinic in eastern North Dakota. Following the educational session, a three-month implementation period provided time for providers to implement their knowledge and dermoscopy skills in practice. The purpose of the project was to increase knowledge, improve accuracy of identifying skin lesions, and increase provider confidence using dermoscopy. Evaluation using a pre-implementation survey of providers in the clinic found the primary care providers felt comfortable with their baseline knowledge of skin cancer but did not feel confident in their ability to use a dermoscope. Most of the participating providers deemed their level of knowledge regarding dermoscopy to be at a novice level. Results of the post-implementation found providers felt more comfortable using dermoscopy and knowledge in dermoscopy overall improved from novice to advanced beginner or competent.

Doctorado en Ciencias, mención Microbiología / El melanoma maligno es un tipo de cáncer a la piel de baja incidencia, pero elevada tasa de mortalidad, por ello continúa la búsqueda de terapias complementarias para su tratamiento. La viroterapia antitumoral aprovecha la destrucción celular que producen algunos virus durante su ciclo infectivo, para eliminar las células tumorales. Sin embargo, a pesar de los promisorios resultados, esta terapia produce efectos adversos debido a la utilización de virus activos. El uso de proteínas virales, como las proteínas de fusión viral, han sido evaluadas como una alternativa en diversas estrategias antitumorales, ya que inducen la formación de sincicios altamente inestables que llevan a una muerte celular capaz de activar a células el sistema inmune in vitro. Sin embargo, la expresión intratumoral de este tipo de proteínas y su efecto modulador en una respuesta inmune antitumoral in vivo, aún no se ha estudiado en detalle. En este estudio, se evaluó y caracterizó el efecto de la expresión de la proteína de fusión del virus respiratorio sincicial humano (hRSV), del reovirus aviar (ARV) y del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) en células de melanoma murino. Se sintetizaron nanopartículas homogéneas utilizando quitosano y vectores de expresión para las proteínas ARV-p10 (NP-ARV) e ISAV-F (NP-ISAV). La expresión de ambas proteínas mediante la transfección con nanopartículas in vitro produjo la formación de sincicios a las 48 horas post-transfección, y un efecto citotóxico a las 120 horas en el caso de NP-ARV y a partir de las 48 horas post-transfección para NP-ISAV. El tratamiento intratumoral de tumores de melanoma con NP-ARV y NP-ISAV indujo un retraso en el crecimiento tumoral e incluso casos de regresión completa del tumor, además de un aumento de linfocitos Th1 sistémicos para NP-ARV. Resultados similares fueron obtenidos tras el tratamiento intratumoral con una suspensión de quitosano (CH), sugiriendo un papel inmunomodulador antitumoral. Por lo tanto, en melanoma murino 1)- la expresión de ARV-p10 e ISAV-F utilizando nanopartículas de quitosano como método de transfección produce la muerte celular mediada por la formación de sincicios in vitro y 2)- el tratamiento intratumoral con CH, NP-ARV y NP-ISAV produce un control del desarrollo del tumor, posiblemente mediado por una respuesta inmune antitumoral de tipo Th1. / Malignant melanoma is a type of skin cancer with low incidence, but a high mortality rate. Therefore, the search for complementary therapies for its treatment continues. The antitumor virotherapy takes advantage of the cellular destruction that some viruses produce during their infective cycle, to eliminate the tumor cells. However, despite the promising results, this therapy produces adverse effects due to the use of active viruses. The use of viral proteins, such as viral fusion proteins, have been evaluated as an alternative in various antitumor strategies, since they induce the formation of highly unstable syncytia that lead to cell death capable of activating the immune system cells in vitro. However, intratumoral expression of this type of proteins and its modulating effect on an antitumor immune response in vivo has not yet been studied in detail. In this study, the effect of expression of fusion protein of human respiratory syncytial virus (hRSV), avian reovirus (ARV) and infectious salmon anemia virus (ISAV) on murine melanoma cells was evaluated and characterized. Homogeneous nanoparticles were synthesized using chitosan and expression vectors for the ARV-p10 (NP-ARV) and ISAV-F (NP-ISAV) proteins. The expression of both proteins by transfection with nanoparticles in vitro produced the formation of syncytia at 48 hours post-transfection, and a cytotoxic effect at 120 hours in the case of NP-ARV and after 48 hours post-transfection for NP-ISAV. Intratumoral treatment of melanoma tumors with NP-ARV and NP-ISAV induced a delay in tumor growth and even cases of complete regression of the tumor, in addition to an increase in systemic Th1 lymphocytes for the case of NP-ARV. Comparable results were obtained after intratumoral treatment with a suspension of chitosan (CH), suggesting an antitumor immunomodulatory role. Therefore, in murine melanoma 1)- the expression of ARV-p10 and ISAV-F using chitosan nanoparticles as transfection method produces cell death mediated by the formation of syncytia in vitro and 2)- the intratumoral treatment with CH, NP-ARV and NP-ISAV produce a control of tumor development, possibly mediated by a Th1 type antitumor immune response. / beca de Doctorado Nacional año 2012 y la beca de Apoyo de Tesis año 2015 otorgada por la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT), cuyo financiamiento me permitió cursar el programa de Doctorado en ciencias, mención Microbiología y financió la realización de esta tesis. / diciembre 2018

Les protéines et les voies impliquées dans la réponse aux dommages de l'ADN (DDR), permettant de maintenir la stabilité génétique et de préserver la fidélité de la réplication, agissent non seulement comme l'initiation de la cancérogenèse mais peuvent également jouer un rôle majeur dans la progression tumorale et dans la résistance aux thérapies. La voie FANC joue un rôle central dans la stabilité génétique lors d'un stress réplicatif. La perte de fonction de cette voie est la cause d'un syndrome de fragilité chromosomique et de prédisposition au cancer appelé Anémie de Fanconi (FA).Nous avons démontré que les protéines FANC était surexprimées et suractivées dans les mélanome métastatiques exprimant le facteur de transcription MITF, un oncogène exprimé dans 80% des cas de mélanome. Nous avons identifié MITF comme un régulateur majeur de l'expression des transcrits codant les protéines de la voie FANC dans les cellules de mélanomes et montré que les cellules déplétées pour MITF présentaient les caractéristiques des cellules FA, i.e., une hypersensibilité aux agents pontants l'ADN. De plus, la voie FANC module également la migration des cellules de mélanome. Nos observations montrent le rôle central de cette voie de réparation dans la résistance des cellules de mélanomes aux dommages de l'ADN. Cette voie serait donc une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du mélanome.Nous avons également observé que la perte de fonction de la voie FANC augmente l'expression de MiTF dans des cellules FA et des cellules déplétées pour les protéines FANC. Nous avons montré que la voie FANC régule négativement l'expression de MITF au niveau transcriptionnel. Des résultats préliminaires montre que FANCD2 pourrait être associés au promoteur de MiTF au niveau d'un site de fixation de NF-kB, où il pourrait empêcher son action. La déplétion de MiTF conduit à une sensibilité aux agents pontants l'ADN dans des cellules contrôles mais pas dans des cellules FA, suggérant que MITF jouerait un rôle dans la DDR en régulant l'expression des protéines FANC. Enfin, nous avons montré que l'expression de MiTF est induite en réponse aux stimuli pro-inflammatoire. Enfin, l'expression altérée de MITF pourrait expliquer des défauts de pigmentation et la microphthalmie rapportés chez les patients FA. L'ensemble de ces données, à la fois validée et préliminaire, supporte l'existence d'une relation épistatique entre MiTF et la voie FANC. Cet voie aurait un rôle important à la fois dans la résistance au mélanome métastatique et dans certaines caractéristiques pathologiques de l'anémie de Fanconi. / Proteins and pathways involved in DNA damage response (DDR), maintaining genetic stability and safeguarding DNA replication, act not only as caretakers against cancer initiation but also play a major role in sustaining cancer progression and resistance to pharmacological-based therapies. The FANC pathway is central in maintaining genetic stability under conditions of replication stress and its loss-of-function is causative of the cancer predisposition and chromosome fragility syndrome Fanconi Anemia (FA).We demonstrate here that FANC proteins are over-expressed and over-activated in metastatic melanoma cells expressing the oncogenic microphthalmia-associated transcription factor (MiTF), which high expression is maintained in 80% of melanoma cases. We identified MiTF as a critical regulator of the expression of the mRNAs coding key proteins of the FANC pathway in melanoma cells and demonstrated that MiTF-silenced cells display the primary characteristics of FA cells, i.e., the cellular and chromosomal hypersensitivity to DNA interstrand crosslink- inducing agents. Moreover, FANC pathway also modulates melanoma cell migration. Our observations point to a central role of the FANC pathway in cellular and chromosomal resistance to DNA damage in melanoma cells. Thus, the FANC pathway appears as a promising new therapeutic target for melanoma treatment.Inversely, we observed that FANC pathway loss-of-function is associated to increased expression of MiTF in both FA patient-derived and siRNA-downregulated cells. We demonstrated that the FANC pathway negatively regulates MiTF expression at the mRNA level and have obtained preliminary data suggesting that FANCD2 associates to the MiTF promoter, impeding the action of the NF-kB transcription factor. MiTF depletion increases MMC sensitivity in FANC pathway proficient cells, but does not modify the sensitivity of FA cells, supporting the hypothesis that MiTF acts on the DDR by regulating the expression of FANC proteins. Finally, we demonstrated that MiTF expression is induced in response to inflammatory stimuli, like TNF-a. Thus, altered MiTF expression in FA could be involved in the pigmentation defects and microphthalmia reported in patients.In conclusion, we will present a corpus of both validated and yet preliminary data that strongly supports the existence of an epistatic relationship between MiTF and the FANC pathway. This circuitry appears to have an important role in melanoma resistance to chemotherapies and in some FA pathological traits.

Il est fréquent d’avoir recours à la radiothérapie dans le traitement des mélanomes, en adjuvant ou en métastatique, mais les résultats cliniques sont suboptimaux, car ces tumeurs présentent souvent des mutations de RAF/RAS, activant alors la voie MAPK de façon constitutive. Nous avons donc étudier si le Trametinib, un inhibiteur allostérique puissant et sélectif de MEK1/2, est en mesure d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie. Des tests clonogéniques ont été effectués sur des lignées de mélanomes humaines mutées pour BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) ainsi que sur une lignée sauvage (PMWK). Les effets du Tramétinib avec ou sans irradiation (IR) sur les protéines effectrices de MEK ont été quantifiés par western-blot. Les effets de l’addition du Trametinib sur le cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, la catastrophe mitotique et la senescence ont respectivement été analysés par cytométrie de flux, étude des foyers γH2Ax, et marquage de l’activité de la β-galactosidase. Enfin, des souris immunodéficientes xenogreffées avec des cellules D04 ont été traitées par IR fractionnée après gavage de Trametinib, et la croissance tumorale a été monitorée.Une augmentation de la cytocoxité en présence de l’ajout de Trametinib à l’ IR a été observée pour toutes les lignées, exceptée PMWK. Le taux de radiosensibilisation des cellules étaient respectivement de 1.70, 1.32, 1.22, et 1.70 pour A375, D04, WM1361 et WM1791c. Le Trametinib bloquait de façon efficace la phosphrylation de ERK à des doses de l’ordre du nanomolaire. Ceci corrélait avec un arrêt prolongé des cellules en phase G1, et une réduction de la phase S, connue pour être radiosésistante, ceci jusqu’à 48 heures après IR. Dans les groupes cellulaires prétraités par Trametinib, une population plus importante de cellules étaient positives pour la β-galactosidase, et deux médiateurs majeurs de la sénescence, p53 et pRb se trouvaient être activés. Les souris recevant le traitement combiné (Trametinib 1mg/kg et IR sur 3 jours) avaient un volume tumoral réduit en comparaison du groupe recevant du Trametinib seul (p=0.016), ou une IR seule (p=0.047). Il n’y avait pas de toxicité notable dans le groupe recevant le traitement combiné.Le Trametinib radiosensibilise les lignées cellulaires de mélanomes mutées pour RAF/RAS en induisant un arrêt prolongé en phase G1 du cycle cellulaire, provoquant ainsi une sénescence prématurée. Associer Trametinib et IR semble être parfaitement toléré, mais ne ralentit la croissance tumorale que modestement in vivo. / Radiotherapy is used frequently in patients with melanoma, but results are suboptimal as these tumours frequently exhibit constitutive activation of the MAPK pathway through mutations involving RAS/RAF. Thus, we studied whether Trametinib, a potent and selective allosteric inhibitor of the MEK1/2 enzymes could improve efficacy of radiotherapy.Clonogenic survival assays were carried out in human BRAF (A375), NRAS (D04,WM1631), KRAS (WM1791c) mutant and wild type (PMWK) melanoma. The effects of Trametinib with and without irradiation (IR) on protein levels of MEK effectors were quantitated by immunoblot analyses. Cell cycle effects, DNA damage repair, mitotic catastrophe and senescence were measured using flow cytometry, γH2Ax, nuclear fragmentation and β-galactosidase staining, respectively. Additionally, nude mice with D04 flank tumours were treated with fractionated RT after gavage with Trametinib and monitored for tumours’ growth. All cell lines but PMWK exhibited enhanced cytotoxicity with IR and Trametinib compared to either agent alone. The sensitizer enhancement ratios were 1.70, 1.32, 1.22, and 1.70 for A375, D04, WM1361 and WM1791c, respectively. Trametinib efficiently blocked IR-induced phosphorylation of ERK at doses in the nanomolar range. This increased susceptibility correlated with a prolonged G1 arrest and reduction in the radioresistant S phase up to 48 hours following IR. A larger population of senescence activated β-galactosidase-positive cells was seen in the Trametinib pretreated group, and this correlated with an activation of two of the major mediator of induced senescence, p53 and pRb. Mice receiving the combination treatment (Trametinib 1mg/kg and IR ober 3 days) showed a reduced mean tumour volume compared with mice receiving Trametinib alone (p=0.016), or IR alone (p=0.047). No overt signs of drug toxicity were observed.Trametinib radiosensitized RAF/RAS mutated melanoma cells to radiation by inducing a prolonged G1 arrest and premature senescence. Combining Trametinib and IR is well tolerated but only moderately induces tumour growth inhibition in vivo.

Le mélanome métastatique est un des cancers les plus agressifs avec une croissance constante du nombre de nouveaux cas par an dans le monde.Deux mutations sont principalement à l’origine de ce cancer : BRAF(V600) et NRAS(Q61). Les principaux traitements sont des thérapies ciblant BRAF lui-même ou MEK, prescrites en monothérapie ou en combinaison. La moitié des patients répondent à ce traitement mais malheureusement rechutent dans les 6 mois à 1 an après le début du traitement. Les mécanismes de résistance décrits passent par une réactivation de la voie des MAPK, de la voie PI3K/Akt/mTOR ou par une dérégulation de l’apoptose.Les deux premières voies de signalisation permettent la régulation d’un complexe : le complexe d’initiation de la traduction eIF4F. Ce complexe est composé de 3 protéines : eIF4E, une protéine qui s’associe à la coiffe 7-methyl-guanosine, eIF4A une hélicase et eIF4G une protéine échafaudage dont un des rôles est de maintenir la cohésion de ce complexe.Le complexe eIF4F étant en aval de deux voies dérégulées dans le mélanome, le but de ma thèse a été de mettre en évidence une potentielle implication de ce complexe dans la résistance aux thérapies ciblant BRAF et MEK.Pour cela, dans un premier temps, nous avons traiter des lignées cellulaires de mélanome BRAF(V600) sensibles et résistantes aux anti-BRAF et anti-MEK. Nous avons ensuite quantifié les interactions eIF4E-eIF4G, synonymes d’activation du complexe eIF4F, et les interactions eIF4E-4EBP1, synonymes d’inhibition de la traduction par une technique de Proximity Ligation Assay (PLA). Ces expériences ont permis de conclure que les inhibiteurs de BRAF et de MEK induisaient une dissociation du complexe dans les lignées sensibles, alors qu’il reste maintenu dans les lignées résistantes. Ces résultats ont été confirmés sur des tumeurs de patients répondeurs et non répondeurs à ces mêmes traitements. Par la suite, nous avons reproduits ces expériences avec un panel de lignées cellulaires mutées en NRAS(Q61) et avons observé les mêmes résultats.Nous avons donc pu mettre en évidence l’implication du complexe eIF4F dans la résistance aux thérapies ciblant la voie des MAPK dans les mélanomes mutés en BRAF et en NRAS, mais également découvert une nouvelle cible thérapeutique potentielle.La seconde partie de cette thèse a consisté au test de plusieurs inhibiteurs connus et spécifiques d’eIF4A (silvestrol, flavaglines, hippuristanol, patéamine A) ou de l’interaction eIF4E-eIF4G (4EGI1). Tous ces inhibiteurs ont sensibilisé les lignées résistantes aux thérapies ciblées mais aucun ne pouvait être potentiellement utilisable en clinique.L’utilisation d’un vecteur bicistronique dans le cadre d’un criblage de drogue a permis d’identifier 4 flavaglines qui inhibent significativement le complexe d’initiation de la traduction. L’une d’entre elles (FL3) a été testé in vivo dans un modèle de xénogreffes issues de lignées cellulaires de mélanomes résistantes. Les résultats ont montré un effet synergique de cette drogue en combinaison avec le vemurafenib (anti-BRAF) ainsi qu’une inhibition de la croissance tumorale. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle cible thérapeutique et un nouveau biomarqueur de résistance aux thérapies ciblées dans deux contextes mutationnels de mélanome différents : BRAF et NRAS. / In BRAF(V600) or NRAS(Q61)-mutant tumours, most mechanisms of resistance to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases rely on reactivation of the RAS–RAF–MEK–ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathway or on activation of the alternative PI(3)K–AKT–mTOR pathway (which is ERK independent). These two pathways converge to regulate the formation of the eIF4F eukaryotic translation initiation complex. By using an in situ method to detect the eIF4E-eIF4G and eIF4E-4EBP1 interactions, we recently showed that the persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap-binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF and/or anti-MEK in BRAF(V600)-mutant cancer cell lines. We next focused on NRAS-mutant cancer cell lines and found that this complex is also involved in the resistance to anti-MEK compounds. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex in BRAF or NRAS-mutated cell lines is able to overcome resistance and to synergize with drugs targeting BRAF or MEK kinases. As a result, eIF4F appears to be a promising therapeutic target in a BRAF or NRAS-mutation context.

Le but de ce travail de thèse a été d’identifier par séquençage d’exomes, de nouveaux gènes de prédisposition dans 2 pathologies rares dont l’étiologie est peu connue. Le 1er projet a porté sur une famille à 3 cas de sarcomes, sans mutation du gène TP53. Nous avons identifié une mutation pathogénique du gène CDKN2A, dans les 3 cas. Le gène CDKN2A étant le gène majeur de prédisposition au mélanome, nous avons recherché parmi 3 collections différentes des cas de sarcomes associés à une mutation du gène CDKN2A. Nous avons identifié 8 cas de sarcomes indépendants, porteurs d’une mutation du gène CDKN2A et montré une perte d’hétérozygotie au niveau du site de la mutation constitutionnelle CDKN2A dans 5/7 cas, montrant ainsi une perte de fonction complète. Les sarcomes étant rares chez les porteurs de mutations CDKN2A, nous avons recherché des variants rares modificateurs potentiels, par séquençages d’exomes constitutionnels des 8 cas index, et identifié 3 variants du gène PDGFRA. Des études de modélisation ont montré que 2 de ces variants, pourraient avoir un impact sur la structure du domaine extracellulaire de la protéine PDGFRA. Nous avons ainsi démontré que le gène CDKN2A peut prédisposer aux sarcomes et identifié PDGFRA comme gène modificateur potentiel.Dans le second projet nous avons travaillé sur les mélanomes de l’enfant, d’apparence sporadique. Notre hypothèse de travail était que ces mélanomes surviennent suite à un accident génétique de novo. Nous avons analysé des exomes constitutionnels de 41 trios (enfant atteint et ses 2 parents sains). Nos analyses bio-informatiques ont montré l’existence de mutations de novo post-zygotiques de gènes impliqués dans le développement de la crête neurale ou le cancer, dans 5 cas. Les analyses plus complètes des exomes tumoraux sont en cours, ainsi que des études fonctionnelles des gènes et de leurs mutations, dans un modèle d’embryon de poulet. Ce travail permettra d’accroitre la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires dérégulés dans ces maladies, ouvrant ainsi, de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The aim of this thesis was to identify by sequencing of exomes new predisposing genes in 2 rare pathologies whose etiology is not well known.The first project involved a family with 3 cases of sarcomas, without mutation of TP53 gene. We identified a pathogenic mutation of the CDKN2A gene, in the 3 cases. Since CDKN2A gene is the major melanoma predisposing gene, we have searched in 3 different collections, sarcoma cases link to CDKN2A mutations. In total, we have identified 8 independent sarcomas cases, carrying a germline mutation of the CDKN2A gene and showed a loss of heterozygosity at the site of the constitutional mutation of CDKN2A in 5/7 cases, thus proving a complete loss of function. Since sarcomas are rare in carriers of CDKN2A mutations, we looked for potential modifying rare variants, by sequencing constitutional exomes of the 8 index cases, and identified 3 variants of the PDGFRA gene. Modeling studies have shown that 2 of these variants could have an impact on the structure of the extracellular domain of the PDGFRA protein. We have thus demonstrated that the CDKN2A gene can predispose to sarcomas and identified PDGFRA as a potential modifier gene. In the second project, we worked on childhood melanomas, of sporadic appearance. Our working hypothesis was that these melanomas occur as a result of a de novo genetic accident. We analyzed constitutional exomes of 41 trios (affected child and his 2 healthy parents). Our bioinformatics analyzes identified the existence of de novo post-zygotic mutations of genes involved in neural crest development or cancer, in 5 cases. More complete analyzes of tumor exomes are underway, as well as functional studies of genes and their mutations, in a chick embryo model.This work improves the understanding of molecular and cellular mechanisms that are deregulated in these diseases, thus opening up new therapeutic perspectives.

La sénescence cellulaire est un mécanisme suppresseur de tumeur. En effet, elle se caractérise par l’inhibition irréversible de la prolifération cellulaire, en réponse par exemple à l’expression de certains oncogènes activés. In vivo, les névi, dont 80% expriment l’oncogène B-RAF-V600E, sont des exemples visibles d’un tissu composé de cellules exprimant un oncogène et sénescentes, protégeant ainsi de la transformation vers le mélanome. On retrouve cependant B-RAF-V600E dans 50% des mélanomes malin, ce qui implique la possibilité d’un échappement à la sénescence. Lors de ma thèse, j’ai étudié les mécanismes d’induction de sénescence par B-RAF-V600E, et un possible mécanisme d’échappement induit par les glucocorticoïdes (GC). Les GC sont fréquemment utilisés en traitement topique pour leurs propritétés anti-inflammatoire mais aussi comme immunosuppresseurs. Nous avons constaté qu’ils interfèrent avec l’induction de la sénescence in vitro. En étudiant leurs effets sur les modifications du programme transcriptionnel induites par l’expression de B-RAF-V600E, j’ai mis en évidence le rôle d’une de leurs cibles, le facteur de transcription EGR1, dans l’induction de la senescence. Les GC réduisent l’expression de EGR1 et EGR1 contrôle positivement l’expression des inhibiteurs de kinases dépendantes de cycline CDKN2B et CDKN1A. EGR1 se comporte comme un senseur du niveau d’activation de la voie MAPK/ERK pour induire un arrêt rapide de la prolifération. J’ai aussi constaté que les GC, mais pas la perte de EGR1, permettent un échappement total à la sénescence induite par B-RAF-V600E, impliquant l’existence d’autres cibles. Mes résultats montrent le rôle de EGR1 dans l’induction de la sénescence et incitent à évaluer l’effet des glucocorticoïdes sur la tumorigénèse liée à l’expression de B-RAF-V600E et dans l’augmentation de la prévalence des cancers de la peau chez les patients greffés. / Cellular senescence is a tumor suppressor mechanism. Indeed, it corresponds to an irreversible cell cycle arrest, in response for instance to the expression of an activated oncogene. In vivo, nevi, 80% of which express the B-RAF-V600E oncogene, are composed of cells that expressed an oncogene and became senescent, protecting against progression to melanoma. Nevertheless, B-RAF-V600E is found in 50% of malignant melanoma, which implies mechanisms of senescence escape. During my PhD, I studied the mechanisms of senescence induction by B-RAF-V600E, and a possible escape mechanism by glucocorticoids (GC). GC are often used in topical treatment of skin diseases for their anti-inflammatory properties, and are also used as immunosuppressant. We observed that they interfere with senescence induction in vitro. While studying the effects of GC, I identifiedone of their targets, transcription factor EGR1, and showed that GC repress EGR1 which positively controls the expression of cell cycle inhibitors CDKN2B and CDKN1A. EGR1 acts as a sensor of the level of MAPK/ERK pathway activation to induce a rapid cell-cycle arrest. I also showed that GC, but not the loss of EGR1, allow full escape to senescence induced by BRAF-V600E, implying the existence of other targets. My results demonstrate the role of EGR1 in senescence induction, and highlight the need to evaluate GC action on tumorigenesis linked to B-RAF-V600E, as well as in the higher prevalence of skin cancers in transplanted patients.

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2022

Melanoma is a heterogeneous neoplasm at the histomorphologic, immunophenotypic, and molecular levels. Melanoma with extreme histomorphologic heterogeneity can pose a diagnostic challenge in which the diagnosis may predominantly rely on its immunophenotypic profile. However, tumor survival and response to therapy are linked to tumor genetic heterogeneity rather than tumor morphology. Therefore, understating the molecular characteristics of such melanomas become indispensable. In this study, DNA was extracted from 11 morphologically distinct regions in eight formalin-fixed, paraffin-embedded melanomas. In each region, mutations in 50 cancer-related genes were tested using next-generation sequencing (NGS). A tumor was considered genetically heterogeneous if at least one non-overlapping mutation was identified either between the histologically distinct regions of the same tumor (intratumor heterogeneity) or among the histologically distinct regions of the paired primary and metastatic tumors within the same patient (intertumor heterogeneity). Our results revealed that genetic heterogeneity existed in all tumors as non-overlapping mutations were detected in every tested tumor (n = 5, 100%; intratumor: n = 2, 40%; intertumor: n = 3, 60%). Conversely, overlapping mutations were also detected in all the tested regions (n = 11, 100%). Melanomas exhibiting histomorphologic heterogeneity are often associated with genetic heterogeneity, which might contribute to tumor survival and poor response to therapy.