Hemisynthèse stéréosélective d’acides aminés hétérosubstitués sur la chaîne latérale.Applications au radio-fluoromarquage pour l’imagerie de peptides.Ce travail de thèse, qui a été réalisé à l’Institut de Chimie Moléculaire de l’Université de Bourgogne et en collaboration avec l’Institut de Neuroscience Cognitives et Intégrative d’Aquitaine, porte sur la mise au point de nouvelles méthodes de synthèse d’acides aminés hétérosubstitués sur la chaine latérale par des groupements phosphorés ou silylés, ainsi que sur leurs applications. Dans une première partie, la synthèse d’acides aminés silylés sur la chaine latérale est réalisée sans racémisation par réaction de Wittig entre un sel de phosphonium, dérivé d’acide L-aspartique, avec un aldéhyde aromatique porteur du groupement silylé. Ces acides aminés ont été utilisés en synthèse peptidique pour donner des di- et tripeptides silylés par réaction avec des dérivés d’alanine et de phénylalanine. Il a été montré que les acides aminés et peptides silylés pouvaient être fluorés par réaction avec des fluorures, et que dans le cas de dérivés di-t-butylsilylés, les composés fluorés obtenus se révèlent d’une très grande stabilité à pH physiologique. L’étude de la fluoration des peptides di-t-butylsilylés par K18F/K222 a permis d’obtenir les dérivés radiomarqués avec des rendements radiochimiques et des activités molaires atteignant respectivement 39% et 410 GBq.mmol-1. Dans la seconde partie, la synthèse d’acides aminés et peptides hétérosubstitués ou fonctionnalisés sur la chaine latérale, a été mise au point. Le principe de cette synthèse repose sur une cycloaddition [3+2] entre un acide aminé porteur d’un groupement azido avec un alcyne disubstitué. Alors que la réaction par catalyse avec un sel de cuivre ou un complexe de ruthénium ne conduit pas aux produits recherchés, la cycloaddition a été mise au point sous microondes en utilisant le glycérol comme solvant. Dans ces conditions, 13 nouveaux acides aminés porteurs d’un noyau triazole en position γ, et des substituants silylés, phosphorés, amines, amides …ont été préparés sans racémisation et ce avec des rendements atteignant 89%. Les méthodologies mises au point dans ce travail de thèse offrent de nouvelles voies pour la synthèse de dérivés acides aminés silylés ou phosphorés utiles pour la chimie de coordination, la catalyse asymétrique et pour le radiomarquage par les ions fluorure 18F-.Mots clés : Phosphoniums, acides aminés, silanes ; [18F]-radiofluoration, triazoles. / Stereoselective hemisynthesis of lateral chain heterosubstituted aminoacids.Applications on radiofluorolabeling for peptide imaging.This thesis work, which was carried out at the Institute of Molecular Chemistry of the University of Burgundy and in collaboration with the Institute of Cognitive and Integrative Neurosciences of Aquitaine, focuses on the development of new methods for the synthesis of side chain heterosubstituted amino acids including phosphine containing or silyl groups, as well as on their applications. In a first part, the synthesis of side chain silylated amino acids is achieved without racemization using a key Wittig reaction between a phosphonium salt, derived from L-aspartic acid, and an aromatic aldehyde bearing the silyl group. These aminoacids have been used in peptide synthesis to give silylated di- and tripeptides by reaction with alanine and phenylalanine derivatives. It has been shown that the silylated aminoacids and peptides can be fluorinated by reaction with fluorides, and that in the case of di-t-butylsilyl derivatives, the fluorinated compounds obtained are found to be very stable at physiological pH. The study of the fluorination of di-t-butylsilyl peptides by K18F / K222 allowed to obtain radiolabelled derivatives with radiochemical yields and molar activities reaching 39% and 410 GBq.mol-1, respectively. In the second part, the synthesis of aminoacids and peptides heterosubstituted or functionalized on the side chain, was developed. The principle of this synthesis is based on a [3 + 2] cycloaddition between an aminoacid bearing an azido group with disubstituted alkyne. While the reaction catalyzed using a copper salt or a ruthenium complex does not lead to the desired products, the cycloaddition was developed under microwave irradiation using glycerol as a solvent. Under these conditions, 13 new amino acids carrying a triazole ring at the γ position, and bearing silyles, phosphines, amines, amides.. substituents were prepared without racemization and with yields up to 89%. The methodologies developed in this thesis offer new efficient ways for the synthesis of silyl or phosphorus amino acid derivatives, useful for coordination chemistry, asymmetric catalysis and radiolabeling by the fluoride ion18F-.Key words: Phosphoniums, aminoacids, silanes, [18F]-radiofluorination, triazoles

En milieu marin, toute surface immergée est soumise à une colonisation par de nombreux organismes (biofouling). Le développement de biofilms est une étape clé du phénomène. Les systèmes de communication y sont contrôlés par le biais de signaux chimiques. Dans ce travail, l’étude de la signature métabolique de biofilms naturels formé in situ a été réalisée selon un gradient de pollution en contaminants métalliques dans la rade de Toulon et selon la nature du revêtement de la surface immergée. De nettes variations chimiques des biofilms prélevés sont observées et sont corrélées avec des variations en termes de communauté microbiennes. L’étude in vitro de 4 souches bactériennes issues de biofilms naturels a permis, après optimisation des méthodologies d’analyse, une discrimination selon leur profil métabolique. Des biomarqueurs ont été mis en évidence, avec notamment la production de lipides ornithine par la souche Pseudoalteromonas lipolytica. La réponse biologique de cette souche en fonction de son phénotype et face à un stress cuprique a été étudiée par métabolomique et protéomique révélant d’importantes modulations de certaines voies biosynthétiques. / In the marine environment, any immersed surface is subjected to colonization by many organisms (biofouling). The biofilms development is a key stage of this phenomenon. Communication systems are controlled in these structures by chemical signals. In this work, the study of the chemical signature of natural biofilms formed in situ was carried out among a gradient of contamination of metal contaminants in the bay of Toulon and according to the nature of the coating on the immersed surface. Clear chemical variations of the biofilms collected were observed and were correlated with variations in microbial community. The in vitro study of 4 bacterial strains harvested from natural biofilms allowed, after optimization of the analysis methodologies, their discrimination according to their metabolic profile. Biomarkers were highlited, particularly ornithine lipids production by the Pseudoalteromonas lipolytica strain. The biological response of this strain depending on its phenotype and face to copper stres was studied by metabolomics and proteomics revealing important modulations of certain biosynthetic patways.

Au cours de ce travail, la génération de second harmonique optique des molécules biologiques a été étudiée. Cette technique optique non linéaire possède un caractère cohérent qui permet d'accéder aux propriétés de symétrie des molécules dont la taille est très inférieure aux longueurs d'onde optiques visibles utilisées et l'hyperpolarisabilité quadratique des acides aminés aromatiques a été mesurée en solution par diffusion non linéaire. L'hyperpolarisabilité des acides aminés non aromatiques a été obtenue de manière indirecte grâce à des mesures effectuées sur le collagène, une protéine ne contenant pas d'acide aminé aromatique. Le collagène possède en fait une très forte réponse non linéaire et fait l'objet d'études intenses en microscopie optique non linéaire. Par un modèle de sommation cohérente des champs harmoniques réémis, l'origine de la très forte efficacité non linéaire de cette protéine, liée à sa grande rigidité et à son organisation spatiale en triple hélice, a pu être obtenue. En parallèle, l'étude de plusieurs petits peptides synthétiques possédant de un à quatre tryptophanes a permis de comprendre la construction de la réponse optique non linéaire de ces objets à partir de motifs répétés. Par ailleurs, pour apporter des informations supplémentaires sur les nano systèmes, un nouveau montage expérimental a été développé. La grande sensibilité du montage a permis notamment d'atteindre la sensibilité d'une seule particule dans le volume sondé et de mettre en place un système de cartographie en trois dimensions par diffusion Hyper Rayleigh. La démonstration a été réalisée pour des nanoparticules métalliques uniques d'argent piégées dans une matrice de gélatine.

La qualité nutritionnelle des protéines alimentaires dépend de deux paramètres clés : la digestibilité iléale vraie et l'utilisation métabolique des acides aminés (AA) absorbés. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l'influence de deux facteurs alimentaires (facteurs antinutritionnels et peptides) sur les flux iléaux de protéines endogènes; de valider la technique d'intubation utilisée chez l'homme pour prélever des effluents iléaux; de comparer le métabolisme postprandial d'AA alimentaires suivant leur forme d'ingestion; d'évaluer la validité du modèle porc pour prédire la digestibilité protéique chez l'homme. Les investigations se sont déroulées chez le rat, le porc et l'homme. Les effluents iléaux étaient collectés chez le rat après euthanasie, chez le porc vivant équipé d'une canule en aval de la valve iléo-caecal et chez l'homme conscient équipé d'une sonde naso-iléale. L'azote (N) et les AA endogènes iléaux étaient déterminés suite à un repas protéiprive (PP), un repas contenant de la caséine, intacte (C) ou hydrolysée (HC), marquée avec l'isotope stable 15N ou un repas à base d'AA libres (A) mimant la composition de la caséine et privé de certains AA non essentiels afin de mesurer directement leur flux endogènes. De plus, la centrifugation et ultrafiltration des effluents HC permettaient de déterminer les protéines endogènes iléales et le recyclage d'N alimentaire (15N). Les facteurs antinutritionnels issus d'un extrait brut de haricots (Phaseolus vulgaris), ingérés au niveau habituel de consommation chez l'homme, augmentaient les flux iléaux de protéines endogènes (rat, repas PP). Après adaptation au repas, le bilan azoté corporel per se n'avait pas d'influence sur les flux iléaux de protéines endogènes (rat, repas PF et A) mais les peptides alimentaires (repas HC) augmentaient les flux iléaux d'AA et N endogènes par rapport au repas PP. Les peptides alimentaires (HC), comparés aux peptides libérés naturellement dans l'intestin au cours de la digestion (C), n'augmentaient pas les flux iléaux de protéines endogènes (rat, porc, homme). Le recyclage d'N alimentaire dans les protéines endogènes était maximal chez le rat nourri en continu, plus faible chez le porc nourri en aigu et minimum chez l'homme nourri en aigu (respectivement : 65, 21 et 11%). Par ailleurs, ces recherches ont montré que l'intubation naso-iléale utilisée pour prélever des effluents iléaux chez l'homme était une méthode juste et que le porc était un modèle valide pour prédire la digestibilité iléale vraie chez l'homme. Enfin, la forme d'ingestion des AA alimentaires (HC ou C) influençaient le devenir métabolique des AA alimentaires, en particulier par rapport aux cinétiques de catabolisme des AA. Cependant, la valeur nutritionnelle était, au final, similaire pour HC et C.

Le virus de l'immunodéficience bovine (VIB) est un rétrovirus qui partage des propriétés similaires avec les autres lentivirus, dont le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). L'expression des gènes lentiviraux dépend des protéines régulatrices virales Tat et Rev qui interviennent, dans le cycle de réplication virale, aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel, respectivement. Les longues répétitions terminales (LTR) du génome viral fournissent, quant à elles, les signaux d'initiation, d'amplification et de terminaison de la transcription. La protéine Tat, pour exercer son activité transactivatrice, interagit avec une séquence d'ARN appelée TAR ("transactivaton response element") présente sur tous les transcrits viraux. Tat recrute le facteur positif de l'élongation de la transcription b (pTEFb) au niveau du promoteur viral des LTR pour augmenter l'efficacité de transcription de l'ARN polymérase II. La protéine nucléaire Rev est impliquée dans le transport nucléo-cytoplasmique des ARN viraux mono- et non épissés. Récemment, une protéine hybride Tat/Rev constituée de 236 acides aminés (Tat 236) a été découverte à partir de virions isolés de la rate de lapins qui avaient été infectés trois ans auparavant, suggérant une évolution temporelle du virus in vivo. L'objectif de ce travail était de déterminer si des variations génétiques et/ou fonctionnelles pouvaient se retrouver dans d'autres parties du génome du variant du VIB impliquées dans la régulation de l'expression génique virale, notamment au niveau du LTR et du gène accessoire rev du VIB. Ainsi, en utilisant la technique d'amplification en chaîne des gènes (PCR), une séquence LTR mutante (LTRm) fut mise en évidence, démontrant la présence de trois mutations aux positions 191, 250 et 271 lorsque comparée à celle du LTR pré-infection obtenue du génome des virus ayant servi à l'infection des lapins. La séquence du LTR pré-infection était 100% identique à celle du LTR sauvage (LTRs) retrouvée dans la littérature. En utilisant un test de transactivation CAT in vitro avec la protéine Tat103 comme agent transactivateur, le LTRm démontra une activité promotrice d'au moins deux fois supérieure à celle obtenue avec le LTRs. Pour tenter d'associer ces mutations au nouveau caractère phénotypique de LTRm, des mutants de restauration furent développés par PCR-mutagenèse pour revenir au phénotype LTRs. L'ensemble des résultats obtenus suggère que les mutations en positions 250 et 271 seraient impliquées dans l'activité promotrice augmentée de LTRm. Finalement, l'analyse de séquences du gène rev pré- et post- infection a montré deux mutations aux positions 48 (Val → Ile) et 76 (Pro → Leu), la dernière étant localisée dans un domaine riche en arginine. Fait intéressant, la mutation à la position 76 avait aussi été rapportée auparavant dans la portion Rev de Tat236. Les résultats obtenus suggèrent une évolution temporelle du VIB dans le cours d'infections in vivo au niveau du LTR et du gène rev, similaire à celle antérieurement décrite pour le gène tat. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lentivirus, région du LTR, gène rev, diversité génétique

Les mécanismes de complexation et d'accumulation des radionucléides au niveau cellulaire et moléculaire sont complexes et mal connus car les études sur ces sujets sont peu nombreuses. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié les interactions de l'europium (analogue des actinides trivalents) et d'un actinide : l'uranium (VI), avec des molécules biologiques d'intérêt : les phytochélatines. Leur rôle est de protéger les cellules contre les intrusions de métaux lourds non essentiels (donc toxiques). Ces protéines sont donc susceptibles d'être impliquées dans les mécanismes de séquestration des radionucléides chez le vivant. Elles ont toutefois une structure complexe, c'est pourquoi, afin de mieux comprendre leur réactivité, nous avons étendu nos études aux sous entités qui les constituent (acides aminés et glutathion). <br />Nous avons en particulier déterminé la spéciation en solution (stoechiométrie, structure) ainsi que les constantes d'équilibre associées à la formation de ces espèces. Ces études ont été menées par Spectrofluorimétrie Laser à Résolution Temporelle (SLRT), ElectroSpray-Spectrométrie de Masse (ES-SM), Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourier (IRTF) et Spectroscopie d'Absorption X (EXAFS). La détermination des constantes d'équilibre nous a permis de conclure que le pouvoir complexant de ces molécules vis-à-vis des radionucléides était modéré (log10K1 < 3, à pH 3 ou 6), les espèces formées sont mononucléaires avec une seule molécule de ligand (1:1). L'interaction se fait via les groupements durs (oxygénés). La complexation directe de l'europium par des molécules de phytochélatines à pH acide a été étudiée conjointement par SLRT et ES-SM. Le pouvoir complexant de ces molécules est bien supérieur à celui du GSH dont elles sont pourtant issues. Outre les travaux menés sur des solutions synthétiques reproduisant les conditions « biologiques » (pH proche de la neutralité, force ionique 0,1 mol/L, etc.), des tests de contamination cellulaire ont été réalisés. La quantification de l'europium intégré a montré que celles-ci sont capables d'incorporer significativement l'europium.

L'intérêt des composés organiques fluorés est de nos jours de plus en plus important en raison de leur large domaine d'application (agrochimie, nucléaire, matériaux, chimie médicinale...). Par exemple, en chimie médicinale, la présence d'un ou plusieurs atomes de fluor au sein de biomolécules conduit très souvent à une amélioration de leur profil thérapeutique. Par ailleurs, le cyclopropane, le plus petit et le plus tendu des cycloalcanes, permet également de modifier les caractéristiques pharmacologiques de composés biologiques de par sa géométrie inhabituelle. En effet, la rigidification structurale apportée par ce motif influe sur la biodisponibilité d'une biomolécule en améliorant sa sélectivité et son affinité pour un récepteur biologique. Dans ce contexte, nous avons choisi d'associer les propriétés remarquables de l'atome de fluor à la contrainte structurale du cyclopropane dans le but d'élaborer deux nouvelles classes de fluoropeptidomimétiques.Tout d'abord, nous nous sommes intéressés à la modification de la chaîne latérale d'acides aminés naturels en développant la synthèse des analogues cyclopropaniques fluorés de la méthionine, de la leucine, de la lysine et de l'arginine. Nous avons ensuite appliqué l'un de nos acides aminés cyclopropaniques fluorés à la synthèse totale de l'analogue fluoré d'un inhibiteur de la sérineprotéase NS3/4A, le TMC 435.Enfin, dans le but de proposer une voie de synthèse générale permettant l'accès aux pseudopeptides fluorés comportant un monofluorocyclopropane à la place du lien peptidique, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur une étape d'addition nucléophile de réactifs organométalliques sur des N-(tert-butanesulfinyl)-α-fluoroimines chirales.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

L’intercalation de molécules organiques dans les Hydroxydes Doubles Lamellaires conduit à la formation d’hybrides organo-minéraux lamellaires aux propriétés originales. La valorisation de ces matériaux pour des applications diverses nécessite d’une part, le développement d’une méthode de synthèse simple et efficace pour garantir la pureté des hybrides, et d’autre part, d’établir les relations composition-structure (feuillet cationique, anion et eau interfoliaire). C’est pour atteindre ces deux objectifs, que nous avons menés les travaux présentés dans ce mémoire. La stratégie de synthèse adoptée dans ce travail de thèse nous a permis d’obtenir des taux d’intercalation meilleurs que ceux obtenus par les autres méthodes (coprécipitation, reconstruction, etc.) pour des molécules organiques simples (acides dicarboxyliques) ainsi que pour des molécules plus complexes (acides aminés et oligopeptides). Les acides aminés sont classés en trois groupes selon leur taux d’intercalation, qui est influencé par la chaîne latérale des acides aminés. Ainsi, la distance interfoliaire et les défauts d’empilements augmentent avec la longueur de la chaîne, alors que la diminution de la charge du feuillet contribue à la contraction du domaine interfoliaire et à une meilleure structuration du matériau, en lien avec l’orientation des anions. On peut noter que l’effet de la charge du feuillet sur la distance interfoliaire pour les hybrides est l’inverse de celui observé pour les anions inorganiques. L’hydratation du matériau joue également un rôle clé sur l’orientation des anions interfoliaires et la structuration du matériau. Ainsi, la déshydratation du matériau favorise les orientations couchées des anions en augmentant les interactions anion-feuillet, ce qui augmente la stabilité de l’hybride et favorise sa structuration. Nous avons également montré que la présence des groupements amine favorise les interactions anion-feuillet. Aussi, le changement d’orientation des acides aminés intercalés nécessite une exposition des matériaux à des humidités relatives plus élevées que pour les anions dicarboxylates. En outre, nous avons vérifié l’intercalation préférentielle des anions avec des densités de charge élevées. En conséquence, les acides aminés se retrouvent intercalés sous forme totalement déprotonée quelle que soit la charge du feuillet. Enfin, ce mémoire propose une ouverture sur la réactivité des hybrides synthétisés. Celle-ci est abordée au travers d’exemples portant sur la décomposition d’espèces en milieu confiné et sur l’interaction avec le CO2 atmosphérique / The intercalation of organic molecules within the interlayer domain of Layered Double Hydroxides leads to the formation of organo-mineral hybrids with original properties. The industrial applications of these materials requires on one hand to develop a simple and efficient method of synthesis to ensure a high purity of these hybrids, and on the other hand to establish their structure-composition relationships (cationic layer, anion, and interlayer water). These are the objectives that motivated the work presented in this manuscript. The strategy of synthesis adopted in this work, allowed us to obtain higher rates of intercalation than those obtained by other methods (coprecipitation, reconstruction, etc.), for simple organic molecules (dicarboxylic acids) as well as for more complex molecules (amino acids and oligopeptides). The amino acids are classified into three groups according to their rate of intercalation, which is influenced by the nature of their side chain. Additionally, the interlayer distance and stacking faults are influenced by the length of the molecular chain and by the anion orientation which in turn depends on the density charge of the layer. Interestingly, the effect of the density charge on the interlayer distance for the hybrids is the opposite of what is observed for the inorganic anions. The hydration state of the system plays also a key role in the reorientation of the interlayer anions and on the material structuring. In particular, the dehydration of the material promotes lying orientations of the interlayer anions in the order to maximize the anion-layer interactions. This enhances the stability of the material and reduces the number of stacking faults. We have also showed that the presence of amino groups strengthens the anion-layer interactions and the reorientation of the anions occurs at higher humidity compared to dicarboxylate anions. Furthermore, we have verified the preferential intercalation of anion species with high charge densities. Therefore, the intercalated amino acids are found totally deprotonated in the interlayer domain regardless of the layer charge density. Finally, the reactivity of the hybrids is probed through two examples, one dealing with the thermal decomposition of the intercalated anions in confined medium, and the other dealing with their interaction with atmospheric CO2

Ce travail décrit la synthèse, l’étude structurale et une première évaluation des propriétés biologiques d’une nouvelle famille de mimes de l’arginine issus de motifs pyridine et pyrazine. Pour cela, nous avons mis au point la synthèse de nouveaux peptidomimétiques dans lequels la fonction amidine est remplacée par une amidoxime mime potentiel du résidu arginine. La fonctionnalisation chimique de ces motifs a permis à partir de la pyridine (ou pyrazine) 2,3-disubstituée l’obtention de nouveaux coudes non-peptidiques possédant des motifs amidoximes estérifiés par des acides aminés ou modifiés par des hydrazides d'acides aminés, des N-acylamidrazones et des résidus de 1,2,4-oxadiazole et de 1,2,4-triazole. L’analyse structurale réalisée par RMN, IR, modélisation moléculaire et par XRD a confirmé les propriétés des hétérocycles pyridine et pyrazine, en particulier dans la stabilisation des conformations et le noyau pyrazine qui semble jouer un rôle essentiel sur la stabilisation de la conformation. L’étude d'un nouveau pseudotripeptide à base de pyrazine-ProlylPhenylalanine a révélé la formation d'une liaison hydrogène entre le proton du groupe OH et l'oxygène du carbonyle de la phénylalanine C-terminale. La liaison hydrogène, ferme un pseudocycle à 7 atomes (C7). De plus, une augmentation considérable du rotamère trans (jusqu'à 98%) dans un solvant faiblement polaire (CHCl3) a été observée. Enfin, les premières amidoximes testées ont permis de révéler la libération de NO en concentration suffisante pour produire un effet pharmacologique / This work describes the synthesis, structural study and preliminary biological evaluation of new variety of pyridine and pyrazine-based arginine mimics. Initially, we have developed a convenient synthesis of new peptidomimetics with amidoxime function as a replacement of amidine one. The latter can imitate arginine residue in biological structures. Chemical functionalization of these scaffolds led to novel 2,3-disubstituted pyridine(pyrazine) turn structures bearing amidoximes esterified with amino acid or modified with amino acid hydrazides, N-acylamidrazones, 1,2,4-oxadiazole and 1,2,4-triazole residues. Additionally, all structures were analyzed by NMR, IR, molecular modelling and XRD. Conformational studies confirmed that pyridine and pyrazine heterocycles can be used to increase rigidity and the pyrazine core has stronger effect on conformation stabilization. Examination of a new ProPhe pyrazine-based pseudotripeptide revealed the hydrogen bond formation between the proton of the OH and the carbonyl oxygen of the C-terminal phenylalanine. This hydrogen bond adopts a seven-membered ?-turn conformation. Therefore, a dramatic increase of the trans rotamer up to 98% was observed in weakly polar solvent, which is CHCl3. Finally, preliminary results of the NO release assay on amidoximes demonstrated sufficient values for pharmacological effect