Les travaux présentés dans ce manuscrit s’inscrivent dans le contexte général de l’essor de la biocatalyse et de son utilisation en synthèse organique. Le thème principal porte sur l’étude et le développement de différentes voies d’accès stéréosélectives à des acides alpha-aminés bêta-hydroxylés substitués. L’utilisation d’un biocatalyseur permettant d’accéder à des acides alpha-aminés bêta-hydroxylés par une aldolisation entre la glycine et divers aldéhydes, en présence de phosphate de pyridoxal, a été étudiée. Des aldéhydes aliphatiques, aromatiques et hétéroaromatiques ont pu être impliqués avec succès comme partenaires électrophiles dans ces réactions qui permettent un excellent contrôle de la configuration du carbone asymétrique créé en alpha du groupe carbonyle mais s’effectuent généralement avec des diastéréosélectivités plus modestes. Par ailleurs, un dédoublement cinétique enzymatique d’esters alpha,bêta-dihydroxylés, précurseurs d’acides alpha-aminés bêta-hydroxylés substitués en alpha, a été étudié. La méthode développée repose sur la monoacylation d’esters alpha,bêta-dihydroxylés, acycliques ou cycliques, en présence d’une lipase et d’un donneur d’acyle. De façon indépendante, la mise au point de séquences réactionnelles monotopes faisant intervenir une étape d’oxydation biocatalytique a été étudiée pour accéder à des composés aminés hautement fonctionnalisés. / The research work presented in this manuscript pertains to the field of biocatalysis and some applications in organic synthesis. The main subject is the development of stereoselective synthetic methods allowing access to substituted alpha-amino beta-hydroxy acids. The use of a biocatalyst enabling the preparation of optically enriched alpha-amino beta-hydroxy acids in a single step from glycine by an aldol reaction, in the presence of pyridoxal phosphate, was investigated. Aliphatic, aromatic and heteroaromatic aldehydes could be successfully used as electrophilic partners in such reactions that allow an excellent control of the stereocenter created at the alpha position of the carbonyl group whereas moderate levels of diastereoselectivity were generally observed. The enzymatic kinetic resolution of acyclic or cyclic alpha,beta-dihydroxy esters, which are precursors of alpha-substituted alpha-amino beta-hydroxy acids, was also achieved by monoacylation in the presence of a lipase and an acyl donor. Independently, a one-pot sequence involving a biocatalytic oxidation was developed to access highly functionalized nitrogen containing compounds.

Le développement anarchique de tumeurs peut conduire à la formation de régions hypoxiques carencées en nutriments. A cause de l’instabilité génétique des cellules cancéreuses, certaines peuvent développer des résistances à ces conditions proapoptotiques. Parmi ces mécanismes de résistance, ceux impliqués dans la survie des cellules face à la carence prolongée en acides aminés n’ont pas été élucidés. La carence en acides aminés est particulièrement délétère pour les cellules de par leur importance dans le métabolisme cellulaire et l’impossibilité pour 9 d’entre eux d’être synthétisée de novo. L’objectif de ce travail était de déterminer les mécanismes permettant aux cellules cancéreuses de survivre face à la carence prolongée en acides aminés. Pour cela, nous avons développé un outil cellulaire par génétique fonctionnelle. Des fibroblastes embryonnaires de souris ont été soumis à une pression de sélection en les cultivant dans un milieu fortement carencé en acides aminés pendant plusieurs mois. Des clones capables de survivre et de proliférer dans ce milieu ont été générés. Le travail de thèse a d’abord consisté à caractériser la résistance de plusieurs clones à la carence en acides aminés et notamment, les voies de signalisation régulées par cette situation. Parmi ces dernières, nous avons pu observer que les clones par rapport aux cellules parentales présentaient une altération de la voie GCN2, et plus précisément, une sous-expression d’un des acteurs majeurs de cette voie, la protéine ATF4. Par des expériences de shRNA, nous avons pu mettre en évidence que cette sous-expression favorisait la survie des clones en milieu carencé en acides aminés. L’association entre survie et sous-expression d’ATF4 a également pu être faite dans une lignée de cancer du pancréas, BxPC-3. En rétablissant l’expression d’ATF4, les cellules résistantes redevenaient sensibles aux effets apoptotiques de la carence en acides aminés, confirmant le rôle apoptotique d’ATF4 lors de carence en acides aminés prolongée. Nous nous sommes également intéressés aux mécanismes que les cellules utilisaient pour se fournir en acides aminés à partir des protéines du milieu extracellulaire. Nous avons pu identifier qu’une des lignées de clones présentait un fort niveau de macropinocytose et que son inhibition lors de carence en acides aminés diminuait ses capacités de survie lors de carences en acides aminés. Notre approche a ainsi pu mettre en évidence des mécanismes de résistances des cellules à la carence en acides aminés. Ces mécanismes ont ensuite pu être observés dans des lignées cancéreuses, confirmant la pertinence de notre modèle pour l’identification de tels mécanismes. / Tumor development can be characterized by the formation of hypoxic area deprived in nutrients. Due to their genetic instability, tumor cells can become resistant to this apoptotic condition. Among the resistance mechanisms, those involved in cell survival against amino acids restriction is poorly known. Amino acids deprivation is particularly deleterious as nine of them cannot be synthetized de novo. The aim of this work was to identify the mechanisms by which tumor cells can survive to long-term amino acids deprivation. For that purpose, we exerted a selective pressure on mouse embryonic fibroblast by exposing them to amino acids deprivation for several months. We generated clones able to survive and proliferate in deprived amino acids medium. Firstly, we characterized the capacity of proliferation and survival of several resistant clones in amino acid deprivation condition. Secondly, we studied several signaling pathways which are regulated during this condition. We have found that every clones present an alteration of the GCN2 pathway, and notably, a low expression of its major actor, the protein ATF4, when compared to the parental cells. We have shown with shRNA experiment that this underexpression promotes cell survival during amino acid deprivation. The association between decreased expression of ATF4 and better survival in amino acid deprivation condition was also found in a pancreatic cancer cell line, BxPC-3. ATF4 overexpression in this resistant cell line restores the apoptotic effect of ATF4 during amino acid deprivation. We have also studied how cells can provide themselves in amino acids from the extracellular environment. We have observed that one of the clone cell line presents a high level of macropinocytosis and that, the inhibition of this mechanism decreases its survival during amino acid deprivation. Thanks to our approach, we were able to highlight mechanisms which confers to cell resistance to amino acid deprivation. By observing those mechanisms in cancer cell lines, we confirmed the relevance of our approach to identify such mechanisms.

La détection des nutriments extracellulaires est cruciale pour une croissance cellulaire optimale. Certaines protéines de la catégorie des transporteurs membranaires sont dépourvues d’activité de transport et agissent plutôt comme senseurs des nutriments externes. Les senseurs de glucose Snf3 et Rgt2 ainsi que le senseur des acides aminés Ssy1 de la levure sont les représentants les mieux connus de cette classe de senseurs. Au cours de ce travail, nous nous sommes concentrés sur la voie de signalisation activée par Ssy1, le senseur d’acides aminés extracellulaires. L’activation de cette voie conduit à l’induction transcriptionnelle de plusieurs gènes codant pour des perméases d’acides aminés. La protéine Ssy1 insérée dans la membrane plasmique est associée à une protéine membranaire périphérique, Ptr3, elle-même associée à une endoprotéase, la protéine Ssy5. La protéine Ssy1 détecte la présence d’acides aminés dans le milieu, ce qui conduit à l’activation Ptr3-dépendante de l’endoprotéase Ssy5 selon un processus nécessitant également la présence du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1. Une fois activée, l’endoprotéase Ssy5 catalyse le clivage endoprotéolytique des facteurs de transcription Stp1 et Stp2. Les facteurs Stp1 et Stp2 ainsi libérés de leur extrémité N-terminale inhibitrice migrent alors du cytoplasme vers le noyau où ils activent, avec l’aide du facteur de transcription Uga35, la transcription du gène AGP1 et d’autres gènes de perméases d’acides aminés. Au début de ce travail, le rôle précis du facteur Ptr3 ainsi que le mécanisme d’activation de l’endoprotéase Ssy5 par les acides aminés n’étaient pas encore connus. Il en était de même du mode d’action du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1 au niveau du complexe Ssy1-Ptr3-Ssy5. <p>Dans ce travail de thèse, nous avons pu montrer par des analyses bioinformatiques que la protéine Ptr3 possède deux régions très conservées. La partie N-terminale contient un domaine présentant les caractéristiques à la fois du domaine RING et du domaine U-Box. La partie C-terminale contient quant à elle sept répétitions WD40 qui confèrent généralement une structure en tonneau créant une zone d’interaction avec d’autres protéines. Nous proposons que cette région constitue probablement la plate forme d’interaction avec Ssy1, Ssy5 et elle-même. Notre étude a montré que la région formée des sept répétitions WD40 est essentielle et suffisante pour la fonction de Ptr3 dans la transmission du signal. Nous avons ensuite mis en évidence que la protéine Ptr3 est instable. Ce résultat suggérait un rôle éventuel du complexe ubiquitine ligase SCFGrr1 dans l’ubiquitination de Ptr3. Cependant, nos travaux ne nous ont pas permis d’établir clairement que la protéine Ptr3 est ubiquitinée par le complexe SCFGrr1. Nous nous sommes alors tournés vers l’endoprotéase Ssy5 comme cible potentielle de ce complexe. Au moment d’entamer nos expériences, le mécanisme d’activation de l’endoprotéase Ssy5 suite à la détection des acides aminés par Ssy1 demeurait encore inconnu. Nos résultats ont permis de montrer que le pro-domaine N-terminal de l’endoprotéase Ssy5 subit une ubiquitination catalysée par le complexe SCFGrr1 en réponse aux acides aminés. Nous proposons que cette modification permet la levée de l’inhibition exercée par ce pro-domaine sur le domaine catalytique C-terminal de l’endoprotéase et par conséquent permet le clivage endoprotéolytique des facteurs Stp1 et Stp2. <p>La perméase générale des acides aminés, Gap1, est la principale voie d’entrée des acides aminés quand les cellules sont cultivées sur un milieu pauvre en azote. Si la concentration en acides aminés du milieu devient plus élevée, la perméase Gap1 est ubiquitinée et emportée dans des vésicules d’endocytose pour être dégradée. En parallèle, l’expression des gènes d’autres perméases d’acides aminés, tel que AGP1, est induite via la voie de signalisation Ssy1. Les perméases ainsi synthétisées rejoignent la membrane plasmique pour assurer l’entrée des acides aminés dans la cellule. Des études antérieures de notre laboratoire avaient révélé que la stabilisation de la perméase Gap1 à la membrane plasmique a pour effet d’empêcher l’induction du gène AGP1 via la voie Ssy1. Pour étudier ce phénomène, nous avons commencé par mieux caractériser les facteurs de transcription Stp1 et Stp2 ce qui nous a permis de montrer que ces deux protéines – considérées jusqu’ici comme étant de fonction redondante – sont activées dans des conditions différentes de disponibilité en acides aminés externes. Nous avons ensuite pu montrer que l’inhibition exercée par la perméase Gap1 sur l’induction d’AGP1 se produit non pas aux étapes de clivage endoprotéolytique ou de translocation dans le noyau des facteurs Stp, mais bien au niveau de leur recrutement au promoteur du gène cible.<p>Finalement, nous présentons un modèle de la voie de signalisation Ssy1 rassemblant l’ensemble de nos résultats. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’obésité est devenue une véritable épidémie mondiale qui résulte principalement de la surnutrition mais peut également avoir une origine iatrogène, par la prise au long cours de glucocorticoïdes (GC). Le but de ce travail a été d’identifier les mécanismes impliqués dans la survenue et dans le développement de l’obésité nutritionnelle et induite par les GC. Le modèle d’obésité induite par un régime hyperlipidique a permis de caractériser des perturbations intestinales associées: une capacité d’absorption des acides aminés élevée, un temps de transit ralenti et une perméabilité intestinale augmentée ainsi qu’une flore intestinale altérée qui pourraient concourir à moduler la balance azotée et énergétique.Parallèlement, le second modèle de diabète et d’obésité cortico-induits a révélé des effets différentiels des GCs selon les dépôts adipeux : une hyperplasie adipocytaire et une invasion précoce des macrophages spécifiquement au niveau viscéral ainsi qu’une polarisation macrophagique distincte entre les dépôts viscéraux et sous-cutanés. L’accumulation des macrophages viscéraux est responsable tout au moins partiellement de l’insulino-résistance induite par les GC. D’autre part, en terme d’homéostasie glucidique, le traitement par GC provoque des réponses différentes sur deux fonds génétiques distincts ce qui s’explique par une adaptation pancréatique souche-dépendante. L’ensemble de ce travail met en exergue différents mécanismes d’adaptation des organes périphériques à l’obésité. / Obesity becomes a worldwide epidemic due to over-nutrition, but also to drug treatments, particularly glucocorticoids (GCs). The aim of this work was to identify the mechanisms involved in obesity induced by high-fat diet or by GCs. High-fat diet-induced obesity model was used to characterize intestinal disturbances: an elevated amino acids absorption capacity, a delayed transit time and an increased intestinal permeability and an altered gut microbiota, which can further modulate nitrogen and energy balance. Meanwhile, GC-induced obesity model revealed differential effects of GCs on fat depots. Adipogenesis and an early increased macrophage infiltration were restricted to visceral adipose tissue with a differential macrophage polarization between visceral and subcutaneous fat pads. Visceral macrophage infiltration was responsible for GC-induced insulin resistance. Moreover, GC exposure resulted in opposite phenotypes of glucose metabolism in two distinct genetic murine backgrounds that could be explained by a strain-dependent pancreatic adaptation. Taken together, our work highlights adaptive mechanisms of peripheral organs during obesity.

La fluorooléfine (CF=CH), motif isostère et isoélectronique de la liaison amide, peut être utilisé comme mime efficace de la liaison peptidique. De plus, ce motif confère une meilleure résistance à la dégradation enzymatique comparé à la liaison peptidique. Cette thèse s’inscrit dans notre programme de développement de nouvelles méthodologies d’accès aux fluoropseudopeptides. Dans une première partie, nous appliquons diverses stratégies originales du laboratoire vers la synthèse d’un analogue du neuropeptide 26RFa. Dans une seconde partie est présentée une stratégie générale vers l’accès à des pseudopeptides possédant un motif proline, un acide aminé extrêmement important. Ainsi, la synthèse asymétrique d’analogues fluorés de dipeptide incluant l’unité proline (AA-[(Z) ou (E)CF=C]-Pro), de conformation cisoïde ou transoïde, a été développée. Enfin, nous avons étendu cette méthodologie à la synthèse d’un analogue de l’Enalapril®, molécule biologiquement active. / The Fluoroolefin moiety (CF=CH) can be used as an effective peptide bond mimic due to isoelectronic and isosteric properties. Moreover, this moiety provides better resistance to enzymatic degradation compared to native peptide bond. This thesis is part of our program aiming at developing new methodologies towards fluoropseudopeptides. In a first part, we apply various innovative strategies from the laboratory to the synthesis of an analog of neuropeptide 26RFa. In the second part is presented an overall strategy towards fluorinated pseudopeptide including a proline residue, an amino acid extremely important. Thus, the asymmetric synthesis of fluorinated dipeptide analogues AA-[(Z) or (E) CF=C]-Pro, under cisoid or transoid conformation, has been developed. Finally, we extend this methodology to the synthesis of an analogue of biologically active Enalapril®.

An increase in myofibrillar protein accretion can occur in the very early post-exercise period and can be potentiated by dietary protein intakes. The positive effect of nutrition on net muscle protein balance is credited to essential amino acids (EAAs), and particularly to the branched-chain amino acid leucine. Thus, leucine plays a key role in feeding-induced muscle protein synthesis by its unique ability to activate signalling pathways modulating translational initiation (Dreyer et al. 2008). Furthermore, strength exercise induces important disturbances in protein turnover, especially in novice athletes, and unaccustomed physical exercise, particularly repeated eccentric muscle contractions, induces muscle soreness and alterations in muscle cellular structure. Still, muscle strength gains induced by resistance training are mainly attributed to neural adaptations in the initial part of training, and subsequently to changes in the force capacity of muscle fibres due to hypertrophy (Duchateau et al. 2006; Sale, 1988). Since acute post-exercise muscle protein accretion does not inform on chronic muscle adaptations, the main purpose of this work is to test the effectiveness of an EAA supplementation on muscle hypertrophy and strength gains in response to resistance training, and on repair-oriented remodelling of disrupted muscle fibres in the early recovery period of an unaccustomed exercise. The first investigations aim at evaluating the effects of an EAA supplementation on muscle mass, architecture, and strength in the early stages of a heavy-load training programme, and at establishing if the enrichment of the supplement with leucine induces greater improvements in these muscle functional adaptations. In a second part, central and peripheral adaptations are examined following training to compare whether EAA supplementation modifies the relative contribution of neural and muscular factors to the increase in muscle torque, and promotes adaptations in muscle mechanical and contractile properties. The purpose of the third investigation is to study the potential effects of an EAA supplementation on the reduction in the efflux of indirect markers of muscle damage and the delayed onset muscle soreness in the week following a heavy-load eccentric training session.In the first and in the second investigation, young males trained for 12 weeks. They were divided into a placebo (PLA) group (n = 14), an EAA group (n = 15) and a leucine (LEU) group (n = 14). At baseline, daily food intakes and nitrogenous balance were assessed with a food questionnaire over 7 days and two 24h urine collections. The effect of training on muscle mass was assessed by anthropometric techniques. Muscle thickness and pennation angle were recorded by ultrasonography of the medial gastrocnemius (MG). Maximal strength during squat and bench press exercises was tested on an isokinetic ergometer. The torque produced by the plantar flexors and the surface electromyogram (EMG) from the soleus (Sol) and MG were recorded during maximal voluntary isometric contractions (MVC). Central activation was tested by the superimposed electrical stimulation method during MVC and by computing the ratio between voluntary average EMG and compound muscle action potential (M wave) induced by electrical stimulation (average EMG/M-wave). Contractile properties of the plantar flexor muscles were investigated by recording the mechanical responses to single and paired maximal stimuli. In the third investigation, young males performed a bench press exercise in eccentric condition. They were subdivided into a PLA group (n=11) and an EAA group (n=12). The effect of the training session was assessed by analysing two indirect markers of muscle damage, namely creatine kinase (CK) and myoglobin (Mb). Plasma concentrations were measured before, immediately after, and on post-workout days 1, 2, 3, 4 and 7. Muscle soreness was evaluated by a visual analogic scale (VAS) at the same time points as the markers of muscle damage.Resistance training resulted in significant increases in muscle mass and strength in all PLA, EAA and LEU groups with no statistical differences between groups. A positive linear regression was found between nitrogen balance and the increase in muscle mass in the PLA group only. When strength was normalised to skeletal muscle mass, negative linear regressions were observed between the normalised initial strength and the increase in muscle strength in both EAA and LEU groups. EAA and LEU ingestion induced changes in MG muscle architecture in response to training. After training, plantar flexor torque recorded during MVC was increased in PLA, EAA and LEU groups. Central activation level was enhanced with no effect of EAA supplementation. Twitch torque evoked by single and paired supramaximal stimuli, maximal rate of torque development to single stimulus and rate of torque relaxation to single and paired stimulus were significantly improved in the LEU group in response to training. The eccentric training session induced a significant increase in muscle soreness in both PLA and EAA groups. Plasma CK release increased significantly at D+3 and D+4 and Mb efflux rose at D+3 in PLA group only. No statistical differences were observed between groups for the two indirect markers of muscle damage. Gaussian distribution was found to be the best fit model for plasma Mb and CK concentration curves. F-test showed that individual curves were statistically distinguishable when comparing the best-fit values of the three parameters (area, SD and mean) between PLA and EAA group data sets (P < 0.01).In summary, the data indicates that EAA supplementation results in similar muscle mass and strength adaptations in response to resistance training with no additional effect by the enrichment of the supplement with LEU. However, the nutritional interventions appear to be more effective in subject having a lower initial nitrogen balance and/or a lower initial strength, potentially by promoting changes in muscle architecture. EAA ingestion does not potentiate neural adaptations, but leucine-enriched EAA supplementation may induce earlier peripheral adaptations, resulting in enhanced torque production and transmission. Finally, EAA supplementation could have minor effects on the overall plasmatic release of indirect markers of muscle damage during the recovery period without any impact on delayed onset muscle soreness. / Doctorat en Sciences de la motricité / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019. / Chez l’abeille domestique, il est impératif d’avoir accès à une diversité florale pour combler les besoins en acides aminés essentiels via le pollen. Ainsi, dans les régions où la diversité florale est limitante, certains apiculteurs ont recours à des suppléments protéiques pour éviter les carences. Cependant, il est important et parfois difficile de quantifier les effets de ces produits sur des colonies commerciales. Les objectifs du projet étaient : 1) comparer la santé des colonies d’abeilles supplémentées à celles non supplémentées; 2) comparer deux types de suppléments commerciaux quant à leur taux de consommation et leurs effets sur la santé des colonies; 3) évaluer l’impact du paysage sur le statut nutritionnel des colonies. Cinquante colonies réparties sur trois sites en Montérégie ont été échantillonnées de mai à septembre 2016. Des trappes à pollen ont permis de placer certaines colonies en conditions simulées de manque de pollen. Les résultats démontrent que fournir des suppléments aux colonies en période de pénurie de pollen permet aux abeilles de maintenir leur production de couvain, ainsi qu’un taux de protéines plus élevé. Cependant, les abeilles supplémentées démontrent une longévité réduite, ce qui suggère que les produits testés ne sont pas optimaux. Le supplément Global PattiesMD, contenant du pollen, a été davantage consommé que le Ultra BeeMD, sans pollen. Il semble également convenir mieux aux colonies, les abeilles y étant exposées présentant un effort de récolte de pollen inférieur (lorsque limitées dans leur accès au pollen), un taux de protéines généralement plus élevé par rapport au témoin et une meilleure longévité. Enfin, les ruches du site présentant la plus grande proportion de terres agricoles dans un rayon de 5 km performaient mieux qu’aux autres sites en fin de saison, ce qui pourrait s’expliquer par la présence de certaines plantes nutritionnellement intéressantes retrouvées en milieu agricole. / The honeybees (Apis mellifera L.) must have access to a diversity of pollen sources to meet their nutritional requirements. In regions where floral resources are scarce, beekeepers sometimes provide protein supplements to their colonies to avoid nutritional deficiencies. However, it is important and sometimes difficult to quantify the effects of these products on commercial colonies. The goals of this study were to 1) compare the health of commercial honeybee colonies supplemented or not with a protein supplement, 2) compare the consumption and impact on honey bee health of two commercial protein supplements and 3) evaluate the impact of surrounding landscape on the nutritional status of colonies. Fifty colonies located in three apiaries in Montérégie, Québec, were monitored from May to September 2016. Pollen traps placed certain colonies in simulated pollen shortage conditions. We found that supplemented colonies limited in pollen collection were able to raise the same amount of brood than the control colonies. Nurse bees in supplemented colonies also had a higher body protein content compared to control bees. However, bees of supplemented colonies displayed shorter lifespan, which casts a doubt on the suitability of these products for honey bee nutrition. The supplement containing pollen, Global Patties, was more consumed than the supplement containing no pollen, Ultra Bee. It also seemed more suitable, colonies consuming it displaying a lower pollen foraging effort (in pollen shortage conditions), nurse bees with a higher protein compared to the control and bees with a longer lifespan. Finally, colonies from the apiary surrounded by the highest proportion of cultivated land in a 5-km radius performed better overall compared to the other apiaries toward the end of the season. This could be explained by the presence of nutritionally interesting plants present in the agricultural landscape at that time of the year

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / De nouveaux catalyseurs peuvent être générés par la construction de peptides, incorporant des acides aminés naturels et conformationnellement restreints, dans l’objectif de mimer les aspects structuraux des sites actifs d’enzymes. Le travail présenté dans ce mémoire consiste en la synthèse et en la caractérisation d’un nouveau peptide cyclique, le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), dans lequel deux résidus d’acide aspartique sont situés entre deux résidus d’acide aminé indolizidinone (IAA). Ce peptide cyclique est conçu de façon à placer les groupes carboxyliques des résidus d’acide aspartique à proximité grâce aux restrictions de la chaîne peptidique causées par les IAA. Avec ces caractéristiques, le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) est proposé comme mimétique des protéases aspartiques. Les protéases aspartiques constituent une classe d’enzymes qui ont pour fonction d’hydrolyser les liaisons amides des peptides et des protéines. Leur site actif contient deux résidus d’acide aspartique dont les chaînes latérales sont situées à proximité. Un seul groupe carboxylate est protoné dans la forme active de l’enzyme. Le mécanisme d’hydrolyse pour ces molécules procède soit par une attaque nucléophile par un des groupes carboxylates soit par l’attaque d’une molécule d’eau assistée par les groupes carboxyles comme acide général/base générale. Dans le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), la relation spatiale entre les deux groupes carboxyliques des résidus d’acide aspartique pourrait promouvoir l’hydrolyse de liaisons esters ou amides selon le mécanisme base générale/acide général ou nucléophile. Deux conformations de même énergie ont été trouvées pour le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) en utilisant la recherche conformationnelle de Monte Carlo. La première conformation possède les caractéristiques d’un feuillet plissé β antiparallèle situé entre deux IAA placés aux positions i + 1 et i + 2 de repliements β de type II’. Dans la seconde, les résidus IAA sont placés aux positions i et i + 1 d’un repliement tordu. Le peptide cyclique 1 a été préparé en solution avec un rendement de 11 % ainsi que sur support solide avec un rendement de 25 % en utilisant la résine PAB-BHA. La conformation du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) a été déterminée avec l’aide des constantes de couplage scalaires en RMN de ^1H, des couplages dipolaires du spectre NOESY et avec les gradients de déplacement chimiques des protons amides en fonction de la température (Δδ/ΔT). Les résultats de l’analyse conformationnelle soutiennent l’une des conformations trouvées par la modélisation moléculaire et non la seconde. Les constantes de couplage vicinales entre les protons en α et les deux protons diastéréotopiques en β des résidus Asp indiquent que les groupes carboxyliques sont positionnés au-dessus du cycle. De plus, le titrage potentiométrique dans l’eau du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) donne des valeurs anormales de pKa pour les deux acides carboxyliques. Par contre, les expériences préliminaires consistant à déterminer l’activité catalytique du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) montrent que le peptide cyclique est peu efficace pour accélérer l’hydrolyse de l’acétate de 2,4-dinitrophényle. En détaillant la synthèse et la caractérisation du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), ce travail de recherche discute du mérite de l’utilisation d’acides aminés naturels et conformationnellement restreints pour la construction de peptides pouvant mimer les sites actifs d’enzymes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La cartographie peptidique est une technique comparative couramment utilisée pour l'analyse des protéines et l'identification de substitutions d'acides aminés ou de modifications post-transductionnelles dont certaines sont à l'origine de maladies graves comme l'anémie. Cette technique est constituée de trois étapes: le clivage enzymatique ou chimique de la protéine, la séparation et la détection des fragments peptidiques par une technique chromatographique. La cartographie peptidique de protéines provenant d'échantillons biologiques est une technique longue et fastidieuse. Afin de digérer les protéines, nous avons mis au point un microréacteur qui contient de la trypsine immobilisée sur un support solide. La solution de protéine est perfusée à travers le microréacteur où a lieu la digestion. Les fragments peptidiques sont collectés à la sortie du micro-réacteur et séparés par électrophorèse capillaire (CE). Ce microréacteur a montré une bonne reproductibilité des cartes peptidiques pour des concentrations de protéines assez élevées (0.08 mM). Cependant, le nombre de pics obtenus sur nos électrophérogrammes dans le cas de la [3-caséine est supérieur au nombre de peptides attendus. Nous avons montré que ce phénomène est dû au fait que les échantillons commerciaux de cette protéine comportent plusieurs isoforrnes. Dans les échantillons biologiques, les fragments peptidiques issus de la digestion de protéines sont souvent présents à des concentrations inférieures aux limites de détection usuelles par spectrophotométrie. Nous avons donc fabriqué un préconcentrateur fait de billes d'octadécylsilane (1 mm x 370 lm). Dans un premier temps, la solution de fragments peptidiques est perfusée à travers le préconcentrateur où les peptides sont retenus. Après connexion de celui-ci à un capillaire de séparation par électrophorèse capillaire, la désorption est effectuée en injectant à travers le préconcentrateur un petit volume d'une solution d'acétonitrile (65 n1). Ce volume d'élution est ensuite poussé par pression dans le capillaire de séparation. Pour éviter les problèmes associés à la présence du préconcentrateur lors de la séparation, ce dernier est déconnecté du capillaire de séparation avant application du voltage. Nos études ont montré que l'étape de préconcentration induit un phénomène chromatographique qui se superpose à la séparation électrophorétique. En conséquence, les cartes peptidiques obtenues avec une étape de préconcentration sont très différentes de celles obtenues à des concentrations élevées. En dépit de ce phénomène, nous avons obtenu des cartes peptidiques de digestats de la [3-caséine avec une bonne reproductibilité et avec des solutions de protéine à des concentrations de 400 nM. Afin de minimiser la perte d'échantillon, les manipulations et le temps nécessaires pour obtenir la cartographie peptidique à partir de la solution de protéine à basse concentration, nous avons connecté le microréacteur, le préconcentrateur et le capillaire de séparation en un système continu. Malgré la perte de résolution et d'efficacité induite par le design du système et le relativement important volume de désorption injecté (60 n1), nous avons atteint un facteur de préconcentration de 500. Nous avons obtenu les cartes peptidiques de différentes protéines à des concentrations allant de 400 nM à 800 nM en quatre heures et ce de manière reproductible. De plus, notre système est réutilisable.