A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima essencial que encerra a transmissão colinérgica através de uma rápida hidrólise do neurotransmissor, acetilcolina (ACh). Uma ampla série de evidências mostraram que os inibidores da AChE podem interferir com a progressão da doença de Alzheimer (DA). O desenvolvimento bem sucedido de compostos inibidores da AChE foi baseado na teoria de que o declínio nas funções cognitivas e mentais associadas a DA está relacionado com a perda da neurotransmissão cortical colinérgica, sendo assim, esses compostos podem ser usados para tratar as deficiências colinérgicas. Uma coleção de moléculas orgânicas foi escaneada para ser avaliada a capacidade dessas moléculas em inibir a atividade enzimática da AChE com o objetivo de se encontrar compostos líderes para posteriores otimizações, conduzindo a fármacos com aumento da eficácia e/ou menores efeitos adversos. As estratégias aplicadas incluem o screening ou triagem virtual baseado na estrutura e também no ligante, modelagem farmacofórica, docking molecular e buscas por similaridade (forma e eletrostática). Os estudos foram também concentrados na descoberta de novas classes de inibidores da AChE, tendo como molécula de referência o fármaco donepezil, o qual inaugurou uma nova classe de inibidores da AChE com a ação mais longa e mais seletiva com efeitos adversos manejáveis. Do total de compostos triados, 50 foram selecionados com adequadas propriedades físico-químicas e ADME/Tox. Em geral, esses compostos possuem substancial interação com o sítio periférico aniônico (PAS) da AChE e a maioria deles faz interações adicionais com o sítio catalítico (CAS) e com outros resíduos de aminoácidos importantes ao longo da enzima. Destes 50 compostos, oito foram comercialmente adquiridos e os ensaios enzimáticos revelaram que estes compostos exibem uma alta afinidade pela AChE. Os resultados apontam, ainda, que o composto entitulado ZINC30019441 exibiu a mais potente atividade inibitória para a AChE, com 1,8 micromolar de concentração, e os demais ficaram ainda situados em baixo micromolar, de 2 a 3 micromolar de concentração. Estes resultados, além das modificações químicas ora propostas in silico para estes inibidores protótipos, apontam para o desenvolvimento de uma nova e promissora série de potentes anticolinesterásicos, contendo propriedades de fármacos, as quais são ainda apropriadas para atuarem no Sistema Nervoso Central e interagirem com o peptídeo beta-amiloide, com vistas ao tratamento quimioterápico da doença de Alzheimer. A perspectiva imediata inclui os ensaios de anti-agregação do peptídeo com os oito inibidores já testados com a Acetilcolinesterase. / Acetylcholinesterase (AChE) is an essential enzyme that terminates cholinergic transmission by rapid hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh). A wide range of evidence shows that AChE inhibitors may interfere with the progression of Alzheimer\'s disease (AD). The successful development of AChE inhibitor compounds was based on the theory that the decline in cognitive and mental functions associated with AD is related to the loss of cortical cholinergic neurotransmission, thus, these compounds can be used for treating cholinergic deficiencies. A collection of organic molecules has been scanned to evaluate the ability of these molecules to inhibit the enzymatic activity of AChE in order to find lead compounds for further optimization, leading to drugs with increased efficacy and/or fewer adverse effects. The strategies applied include structure-based virtual screening and also in ligand-based virtual screening, pharmacophoric modeling, molecular docking and similarity searches (shape and electrostatic). Studies have also focused on the discovery of new classes of AChE inhibitors, having as a reference molecule the drug donepezil, which has opened a new class of AChE inhibitors with longer and more selective action with manageable side effects. 50 of the compounds screened, were selected with appropriate physical and chemical properties and ADME/Tox. In general, these compounds possess substantial interaction with the peripheral anionic site (PAS) of AChE and most of them make further interact with the catalytic site (CAS) and other key amino acid residues throughout the enzyme. Out of these 50 compounds, eight were commercially purchased and the enzyme assays have shown that these compounds exhibit a high affinity for AChE. The results show also that the compound titled ZINC30019441 exhibited the most potent inhibitory activity for AChE, with 1.8 micromolar concentration, and the rest were still located in low micromolar, 2-3 micromolar concentration. These results as well as chemical modifications herein proposed for these prototypes, indicate the development of a new and promising series of potent anticholinesterase containing drug properties, which are still suitable to act on the central nervous system and interact with the ?-amyloid peptide, for chemotherapy treatment of Alzheimer\'s disease. The immediate prospect includes the peptide anti-aggregation assays with the eight inhibitors already tested against acetylcholinesterase

O Mal de Alzheimer é a causa mais importante de demência em idosos. A progressão dos sintomas da doença está associada com modificações estruturais nas sinapses colinérgicas em determinadas regiões cerebrais e, consequentemente, à diminuição do potencial de neurotransmissão colinérgica. Desta forma, o aumento da capacidade de neurotransmissão colinérgica constitui o mecanismo fundamental dos fármacos utilizados para o tratamento do Mal de Alzheimer. Atualmente, o único tratamento clínico eficaz para o Mal de Alzheimer (MA) é a utilização de inibidores da acetilcolinesterase (AChE). Os anticolinesterásicos são os fármacos mais promissores desenvolvidos até hoje, pois é a única classe terapêutica que mostrou melhora nos sintomas cognitivos do MA. Para esse projeto, foram utilizadas diferentes técnicas de modelagem molecular como estratégia de planejamento racional de fármacos, tendo como base os inibidores de Acetilcolinesterase (AChE) descritos na literatura além dos que possuem estruturas depositadas no PDB, incluindo alguns que já vêm sendo utilizados no tratamento do Mal de Alzheimer. O objetivo foi planejar e testar novos potenciais inibidores desse alvo terapêutico, na tentativa de obter e futuramente otimizar novos protótipos como futuros candidatos a fármacos em Mal de Alzheimer. Os objetivos estendem-se a propostas de novos potenciais protótipos, selecionados de bases de dados de compostos comerciais contendo propriedades de fármacos. Os screenings virtuais foram tendenciados às estruturas dos inibidores já reportados da literatura bem como ao padrão farmacofórico comum a eles, a ser modelado. / Alzheimer\'s disease is the leading cause of dementia in the elderly. The progression of symptoms is associated with structural changes in cholinergic synapses in specific brain regions and consequentely to decrease the potential of cholinergic neurotransmission. Thus, the increased capacity of cholinergic neurotransmission is the fundamental mechanism of the drugs used to treat Alzheimer\'s disease. Currently, the only effective clinical treatment for Alzheimer\'s (MA) is the use of inhibitors of acetylcholinesterase (AChE). Cholinesterase inhibitors are the most promising drugs developed so far, it is the only therapeutic class that showed improvement in cognitive symptoms of MA. For this project, we used different techniques of molecular modeling as a strategy for rational design of drugs based on inhibitors of acetylcholinesterase (AChE) in the literature than those which have structures deposited in the PDB, including some that have already been used in the treatment Alzheimer\'s disease.The objective was to design and test new potential inhibitors of therapeutic target in attempts to obtain and optimize future new prototypes as future drug candidates in Alzheimer\'s disease. The goals extend to proposals from potential new prototypes, selected from databases of commercial compounds containing properties of drugs. The virtual screenings were trends to structures of the inhibitors already reported in the literature as well as the pharmacophoric pattern common to them, to be modeled.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O Transtorno de DÃficit de AtenÃÃo/ Hiperatividade (TDAH) Ã um transtorno prevalente e debilitante, diagnosticado com base em persistentes nÃveis de hiperatividade, desatenÃÃo e impulsividade. FÃrmacos estimulantes tÃm sido eficazes no tratamento desse transtorno, sendo que o metilfenidato (MFD) Ã o agente terapÃutico mais prescrito e seu uso aumentou significativamente nos Ãltimos anos, entretanto, as conseqÃÃncias da sua utilizaÃÃo ainda sÃo pouco conhecidas. O MFD foi avaliado em modelos animais clÃssicos para screening de drogas com atividade em ansiedade, depressÃo e convulsÃo, tais como, labirinto em cruz elevado (LCE), campo aberto, rota rod, nado forÃado e convulsÃo induzida por pilocarpina, e em estudo neuroquÃmico, atravÃs da concentraÃÃo de monoaminas, tais como dopamina (DA), noradrenalina (NE) e 5-hidroxitriptamina (5-HT), alÃm da atividade da enzima Acetilcolinesterase (AChE). O MFD foi administrado de forma aguda em todos os testes, nas doses de 2,5; 5; 10 e 20 mg/Kg, atravÃs da via oral (v.o.) em camundongos jovens (21 dias) e adultos. Os resultados mostraram que o MFD apresentou efeito ansiolÃtico nos modelos LCE, pois aumentou todos os parÃmetros analisados no LCE, como NEBA, PEBA, TPBA e PTBA nas doses de 10 e 20mg/Kg nos animais jovens e apenas na de 20mg/Kg nos animais adultos. No teste do campo aberto, foi observado aumento na atividade locomotora em todas as doses nos animais jovens e apenas nas doses maiores (10 e 20mg/Kg) nos animais adultos. NÃo alterou o nÃmero de grooming e rearing. O MFD apresentou efeito antidepressivo no Sistema Nervoso Central (SNC), pois no teste do nado forÃado diminuiu o tempo de imobilidade nas doses de 10 e 20 mg/Kg nos animais jovens e apenas na dose de 20mg/Kg nos animais adultos. A avaliaÃÃo neuroquÃmica comprovou o efeito antidepressivo do MFD, pois se verificou um aumento da concentraÃÃo das monoaminas. No teste da convulsÃo induzida por pilocarpina, o metilfenidato diminuiu a latÃncia de convulsÃo, bem como a latÃncia de morte nos animais jovens e adultos, sugerindo que o MFD apresenta atividade proconvulsivante. O estudo sobre os efeitos sobre o sistema de neurotransmissÃo colinÃrgica demonstrou que o prÃ-tratamento com MFD reduziu a atividade da AChE apenas no corpo estriado. Em conclusÃo, esses efeitos mostraram que o MFD apresenta efeito ansiolÃtico, efeito antidepressivo e atividade proconvulsivante. / Attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD) is a prevalent and debilitating disorder diagnosed on the basis in persistent levels of overactivity, inattention and impulsivity. Stimulant drugs have been effective in treating this disorder, and methylphenidate (MPH) is the most widely prescribed therapeutic agent and its use has increased significantly in recent years, however, the consequences of its use are still poorly known. The MFD was assessed in classical animal models to the screening of drugs with activity in anxiety, depression and convulsion, such as elevated plus maze (EPM), open field, rota rod, forced swimming and pilocarpine-induced seizures and a neurochemistry study, through the level of monoamines, such as dopamine (DA), norepinephrine (NE) and 5-hidroxytriptamine (5-HT) but the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE). The MPH was administered acutely in all tests at doses of 2,5; 5; 10 e 20 mg/Kg, through the oral via (p.o.) in young mice (21 days) and adults. Results showed that the MPH presented an anxyolitic effects in the models of EPM, since increased all the parameters analyzed in the EPM, such as NEOA, PEOA, TPOA, PTOA, at doses of 10 and 20 mg/Kg in young animals, and only in animals of 20 mg/Kg in adults. In the open field, we observed an increase in locomotor activity at all doses in young animals and only at higher doses (10 e 20 mg/Kg) in adult animals. Not was observed no alteration the number of rearing and grooming. MPH presented antidepressant effect of Central Nervous System (CNS), since in the forced swimming, decreases the time of immobility in doses of 10 and 20 mg/Kg in young animals and only at a dose of 20 mg/Kg in adult animals. The neurochemistry evaluation comproved the antidepressant effect do MPH, because there was an increased concentration of monoamines. The test of the seizure by pilocarpine, MPH did decrease the latency of convulsion and latency of death in young and adult animals, suggesting that the MPH has proconvulsivante activity. The study of the effects of the cholinergic neurotransmission system has show that pretreatment with MPH reduced AChE activity only in the striatum. In conclusion, these effects showed that MPH presented anxiolitic effect, antidepressant effect and proconvulsivante activity.

A esclerose múltipla é a principal doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É considerada a principal causa de incapacidade neurológica em adultos jovens. O comprometimento cognitivo é muito comum nessa doença, envolvendo o aprendizado, a memória e a organização cortical do movimento, funções vitais que são reguladas pelo sistema colinérgico. O modelo de desmielinização tóxica induzida pelo brometo de etídio (BE) foi utilizado neste estudo, para avaliar a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) no estriado (ST), hipocampo (HP), córtex cerebral (CC), hipotálamo (HY) e ponte (PN) associado ao tratamento com interferon beta (IFN-b), ciclosporina A (CsA), vitamina E (vit E) e ebselen (Ebs). Além disso, também foi investigado o efeito in vitro do BE na atividade da AChE, juntamente com os parâmetros cinéticos dessa enzima no ST, HP, CC e CB de ratos adultos. Os resultados demonstraram que o BE inibiu significativamente a atividade da AChE no ST, HP, CC e CB nas concentrações de 0,00625, 0,0125, 0,025, 0,05 e 0,1mM e a análise dos dados cinéticos mostraram uma inibição do tipo incompetitiva no ST, HP e CC, enquanto no CB a inibição foi do tipo mista. No estudo in vivo, foi observado uma inibição na atividade da AChE no CC, ST, HP, HY, PN e CB nos diferentes períodos avaliados pós-injeção do BE (3, 7, 15, 21 e 30 dias). Quando ratos desmielinizados com BE foram tratados com IFN-b e CsA, não houve alteração na atividade dessa enzima. Por outro lado, o tratamento com Vit E e Ebs foram capazes de aumentar a atividade da AChE no ST, CC e HP. Estudos imuno-histoquímicos demonstraram que nos ratos tratados com Vit E e Ebs as lesões induzidas pelo BE foram menores, sugerindo que estes compostos interferem no desenvolvimento de lesões desmielinizantes. Foi também avaliado o efeito per se do IFN-b, da CsA, da Vit E e do Ebs na atividade da AChE, os quais demonstraram um efeito inibitório sobre a atividade dessa enzima. Em plaquetas de ratos desmielinizados, foi observado uma diminuição na atividade da NTPDase e o tratamento com a Vit E e o Ebs modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina. O presente trabalho demonstrou que o BE é um potente inibidor da atividade da AChE in vitro e os resultados in vivo demonstraram que a atividade dessa enzima está alterada após um evento de desmielinização tóxica no SNC. Os resultados deste estudo ajudaram a confirmar que drogas utilizadas no tratamento de pacientes com esclerose múltipla tais como o IFN-b e a CsA causam efeitos na atividade da AChE. A Vit E e o Ebs, além de demonstrarem uma interação com a neurotransmissão colinérgica, também modularam a hidrólise dos nucleotídeos de adenina em plaquetas de ratos, contribuindo no controle da coagulação plaquetária em processos desmielinizantes. Neste contexto, sugere-se que o IFN-b, a CsA, a vitamina E e o ebselen podem ser investigados em estudos futuros com a intenção de encontrar uma melhor terapia para beneficiar pacientes com patologias desmielinizantes. / Multiple sclerosis is the main demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is the most common cause of neurological disability among young adults. The cognitive impairment is very commum in this illness, involving learning, memory and cortical organization of the movement, vital functions regulated by the cholinergic system. The model of toxic demyelination induced by ethidium bromide (EB) was used to evaluate brain acetylcholinesterase (AChE) activity in the striatum (ST), hippocampus (HP), cerebral cortex (CC), cerebellum (CB), hypothalamus (HY) and pons (PN), associated with treatment with interferon beta (IFN-b), ciclosporine A (CsA), vitamin E (Vit E) and ebselen (Ebs). In addition, the per se effect of EB on AChE activity was studied in vitro together with the kinetic parameters of this enzyme in the ST, HP, CC and CB of adult rats. The results showed that EB in vitro significantly inhibited AChE activity in the ST, HP, CC and CB at concentrations of 0.00625, 0.0125, 0.025, 0.05 and 0.1mM. The kinetic analysis demonstrated an uncompetitive inhibition in the ST, HP and CC, whereas in the CB the inhibition type was mixed. In relation to the in vivo results, AChE activity was inhibited after demyelination by EB in the CC, ST, HP, HY, PN and CB at the post-injection points of time evaluated (3-7-15-21 and 30 days). When demyelinated rats were submitted to the treatment with IFN-b and CsA, the results demonstrated that these compounds did not alter AChE activity. However, Vit E and Ebs were able to increase AChE activity in the ST, CC and HP. In addition, immunohistochemistry studies demonstrated that in Vit E and Ebs treated rats, the lesions induced by EB were smaller suggesting that these compounds somehow interfered in the development of the lesions. The per se effect of IFN-b, CsA, Vit E and Ebs were also evaluated, demonstrating that these compounds have an inhibitory effect on AChE activity. Platelets of the demyelinated rats demonstrated a reduction in NTPDase activity and the treatments with Ebs and Vit E modulated adenine nucleotide hydrolysis. The present investigation demonstrated that EB is a strong inhibitor of AChE activity in vitro and the results in vivo showed that the activity of this enzyme is altered after an event of toxic demyelination in the CNS. The results this study help the confirm that drugs used in the treatment of the patients with multiple sclerosis such as IFN-b and CsA cause effects in the AChE activity. The Vit E and Ebs besides of interaction with the cholinergic neurotransmission also modulated adenine nucleotide hydrolysis in platelets of the rats, contributing to the control of the platelet coagulant status in the demyelinating process. In this context, we can suggest that IFN-b, CsA, Vit E and Ebs may be investigated in future studies with the intention of finding a better therapy for to improve patients with demyelinating pathologies.

A anatoxina-a(s) (antx-a(s)) é uma neurotoxina produzida por cianobactérias, cujo mecanismo de ação conhecido consiste na inibição irreversível da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE). Em razão da instabilidade da molécula e da inexistência de um padrão analítico, as informações referentes a presença dessa toxina nos reservatórios de água doce e, a completa elucidação dos processos envolvidos na sua toxicidade, são escassas. Na última década, a pesquisa referente a capacidade dos inseticidas organofosforados de induzir estresse oxidativo em humanos e animais tem sido bastante importante. Pelo fato da antx-a(s) ser o único organofosforado produzido por cianobactérias conhecido, este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos bioquímicos envolvidos na ação pró-oxidante de extratos aquosos contendo antx-a(s). A atividade das enzimas colinesterásicas AChE e butirilcolinesterase (BuChE) e, das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e superóxido dismutase (SOD) foram avaliadas em dois modelos experimentais: (i) Camundongos Swiss tratados por via intraperitoneal (ip) com uma dose sub-letal (20 mg.kg-1) de extrato contendo antx-a(s) e sacrificados após 24 h, 48 h, 7 e 14 dias e, (ii) sementes de alfafa regadas com extrato contendo antx-a(s) por um período de 7 dias. Também foi avaliado o efeito de extratos contendo antx-a(s) em coração de baratas da espécie Leurolestes circunvagans. A atividade enzimática das colinesterases avaliadas em camundongos tratados com extrato contendo antx-a(s) manteve-se inibida 58% até 48 h após tratamento (n=9, p<0,001), voltando a níveis normais (comparada ao controle) a partir do sétimo dia (n=10, p>0,05). Em contraposição, as alterações na atividade das enzimas antioxidantes avaliadas iniciaram-se após 48 h do tratamento, quando foi observada uma diminuição na atividade das enzimas CAT e GPx (n=9, p<0,001). No sétimo dia, enquanto a atividade das enzimas CAT e GR apresentou-se aumentada, a atividade da enzima GPx manteve-se significantemente diminuída (n=10, p<0,001). A SOD não mostrou diferença estatística significante em nenhum dos tratamentos. A atividade de todas as enzimas avaliadas voltou a normalidade após 14 dias. O desequilíbrio encontrado na atividade das enzimas antioxidantes em camundongos tratados com extrato contendo antx-a(s), também foi observado em sementes de alfafa. Neste último modelo de exposição, além da diminuição da atividade da enzima GPx (n=5, p<0,01) houve um aumento na atividade da enzima glutationa transferase (GST) com relação ao controle (n=5, p<0,05). Com relação ao efeito do extrato contendo antx-a(s) sobre a preparação de coração semi-isolado de baratas, observou-se um efeito taquicardíaco significante (aumento da frequência em quase 20%) nos animais tratados com 2,5x103 &#181;g de extrato contendo antx-a( s).g-1 (n=9, p<0,05). A partir destes resultados, pôde-se concluir que o extrato contendo antx-a(s) apresentou capacidade pró-oxidante em ambos os modelos avaliados (camundongo e semente) induzindo alterações na atividade das enzimas antioxidantes. Assim também, este extrato mostrou exercer um efeito cardiotóxico em baratas. / Anatoxin-a(s) (antx-a(s)) is a cyanobacterial neurotoxin whose principal mechanism of action is the irreversible inhibition of the enzymatic activity of acetylcholinesterase (AChE). Because of the molecule´s instability and the lack of an analytical standard, the occurrence of this toxin in freshwater reservoirs and the knowledge of the whole events related to its toxicity are scarce. In the last decade, research related to organophosphates insecticides capability to induce oxidative stress in humans and animals has been profuse. Considering that antx-a(s) is the unique organophosphate produced by cyanobacteria currently known; the main of this work was to investigate the biochemical mechanism related to the pro-oxidant capacity of antx-a(s)-containing extracts. In order to achieve the objective, there was determined the activity of cholinesterasic and antioxidant enzymes such as acetylcholinesterase (AChE), butirylcholinesterase (BuChE), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and superoxide dismutase (SOD). Two experimental models were used: (i) Swiss mice were treated intraperitoneally (ip) with 20 mg.kg-1 of antx-a(s)-containing extract and sacrificed after 24 h, 48 h, 7 and 14 days of treatment and, (ii) alfalfa seeds were irrigated with antx-a(s)-containing extract for 7 days. Additionally, the cardiac effect of antx-a(s)-containing extract on Leurolestes circunvagans cockroach was evaluated. The AChE and BuChE activity in mice treated with antx-a(s)-containing extract stayed inhibited more than 55% during 48 h (n=9, p<0,001). Normal activity of both enzymes was observed after seven days of treatment. By the other hand, changes in the antioxidant enzymes activity only began after the second day of treatment. Initially, both CAT and GPx showed lower activity than the control group after 48 h. Among those enzymes, GPx showed the highest decreased activity (n=9, p<0,001). After seven days, while the antx-a(s)- containing extract promoted increasing of CAT and GR activity, GPx activity remained deeply decreased (n=10, p<0,01). SOD activity did not show any statistical difference related to the control during all the treatments. Activity of all the evaluated enzymes was completely recovered after fourteen days. A similar unbalance on the antioxidant enzymes activity was provoked by the extract containing antx-a(s) in seeds irrigated with the extract. The seeds\' GPx activity showed low level (n=5, p<0,01), while GST activity was higher than the control (n=5, p<0,05). Regarding the cardiac effect of antx-a(s)-containing extract on semi-isolated cockroach heart, significant tachycardia (increase of almost 20% of the heartbeat frequency) was observed on the animals treated with 2,5x103 &#181;g.g-1 (n=9, p<0,05). From the obtained results, it can be concluded that the antx-a(s) extract demonstrated its pro-oxidant capacity in both experimental models evaluated (mice and seeds). This fact was proved through the unbalance on the activity of the antioxidant enzymatic defense system. Furthermore, the antx-a(s)-containing extract provoked a cardiotoxic effect on cockroach.

Submitted by Diego Santos (diegosantos@unipampa.edu.br) on 2015-04-22T13:18:43Z No. of bitstreams: 1 111010004.pdf: 1141567 bytes, checksum: 9fb488f70fd98276e395948b1d63e1d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-22T13:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 111010004.pdf: 1141567 bytes, checksum: 9fb488f70fd98276e395948b1d63e1d8 (MD5) Previous issue date: 2012-11-14 / O triclorfon é um inseticida e acaricida organofosforado utilizado na agricultura e na pecuária. Em concentrações normalmente encontradas no meio ambiente, como resultado da acumulação de organofosfato persistente, o triclorfon inibiu significativamente a atividade da enzima acetilcolinesterase, que resulta em um excesso de estimulação colinérgica. Esta inibição enzimática mostrou ser potencialmente tóxica por alterar o perfil de marcha e comportamento de grooming do animal. As alterações comportamentais são desenvolvidos principalmente pela modulação da via da dopamina, que inclui a ativação de receptores DA-D1 que pode causar o aumento de atividade de grooming. Os receptores muscarínicos da subclasse M1 também foram investigados e revelaram estar estreitamente relacionados com o aumento das alterações comportamentais. Interneurónios nicotínicos neuronais devem estar envolvidos, pois como a d-tubocurarina houve uma diminuição do aumento da atividade de limpeza (grooming) induzido por triclorfon. Os resultados apontam para uma interação entre os receptores colinérgicos e dopaminérgicos no sistema nervoso dos insetos. E também reforçam que a persistência ambiental de inseticidas e sua influência sobre o sistema nervoso dos animais é um problema que não precisa ser levado em consideração. / Sublethal doses of the organophosphate trichlorfon induce behavioral alterations in Phoetalia pallida. At concentrations normally found in the environment, as a result of persistent organophosphate accumulation, trichlorfon inhibited significantly the acetylcholinesterase activity, resulting in a cholinergic over-stimulation. This enzymatic inhibition proved to be potentially toxic to cause the reinforcement of the drive for walking and the increasing grooming activity. The behavioral alterations are mainly developed by changing dopamine pathway regulation, which at least include the activation of DA-D 1 receptors to cause increase of grooming activity. Muscarinic receptors of M 1- subclass were also investigated and showed to be closely related to the increase of behavioral alterations. Neuronal nicotinic interneurons must be involved as d-tubocurarine, was able to decrease the trichlorfon-induced increase of grooming activity. The results point out to the cross-talking between cholinergic and dopaminergic receptors at insect nervous system. They also reinforce the environmental persistence of insecticides and their remaining and important influence on animal nervous system.

O uso indiscriminado de inseticidas pode causar a contaminação do ambiente, afetando o solo, o ar e as águas superficiais e subterrâneas. Um dos organofosforados mais utilizados no Brasil é o Malathion, com ampla utilização na agricultura e uso domiciliar, bem como em programas de saúde pública no controle de vetores de doenças. Em ambientes sujeitos a pressão seletiva de agrotóxicos, os alelos conferem resistência a inseticidas tendem a aumentar sua frequência. Dados obtidos no estudo com Zaprionus indianus confirmam a presença de um locus marcador para ambientes expostos ao Malathion, conferindo a essa espécie numerosas possibilidades de uso como bioindicador para monitorar o uso excessivo. 0 presente estudo, teve como objetivo: ampliar o conhecimento sobre a ocorrência e a sobrevivência de Z. indianus, submetidas ao bioensaio com Malathion, analisar a atividade enzimática e a inibição por Malathion. Os indivíduos coletados em Uberlândia, apresentaram o maior número e a maior diferenciação da proporção sexual. Não houve diferença significativa estatisticamente no padrão de resistência ao Malathion, quanto a sobrevivência dos indivíduos de Z. indianus, entre as localidades estudadas. O conjunto de dados obtidos nesse trabalho reforça a premissa que Z. indianus, aparece em grande abundância dentro das comunidades de drosofilídeos coletadas em áreas do Bioma Cerrado. Apresenta também, aspectos enzimáticos na inibição por Malathion, os quais poderão auxiliar no direcionamento de estudos futuros, ligados à avaliação de risco ecológico pela contaminação de inseticidas no ambiente urbano. / The indiscriminate use of insecticides can cause contamination of the environment, affecting soil, air and surface and groundwater. One of the most organophosphorus insecticide widely used in Brazil is the malathion one, which is employed in agriculture and domestic, as well as in control of disease’s vector into public health. In environments subject to selective pressure of pesticides, alleles confer resistance to insecticides tend to increase their frequency. Data obtained in the study with Zaprionus indianus confirm the presence of a marker locus for environments exposed to Malathion, giving this species numerous possibilities of use as a bioindicator to monitor overuse. The objective of this study was to increase knowledge about the occurrence and survival of Zaprionus indianus, submitted to the bioassay with Malathion, to analyze the enzymatic activity and inhibition by Malathion. The individuals collected in Uberlândia, presented the greatest number and the greatest differentiation of the sexual proportion. There was no statistically significant difference in the pattern of resistance to Malathion, as the survival of individuals of Z. indianus, among the studied localities. The set of data obtained in this work reinforces the premise that Z. indianus appears in great abundance within the communities of drosofilídeos collected in areas of the Cerrado Biome. It also presents enzymatic aspects in inhibition by Malathion, which may help in the direction of future studies, linked to the ecological risk assessment by the contamination of insecticides in the urban environment.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-08-29T13:03:42Z No. of bitstreams: 1 2009 - Suzana Vieira da Silva.pdf: 1145565 bytes, checksum: cb8b708d2e722a6ccc8d9c091be5270f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T13:03:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - Suzana Vieira da Silva.pdf: 1145565 bytes, checksum: cb8b708d2e722a6ccc8d9c091be5270f (MD5) Previous issue date: 2009-06-12 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior. CAPES / The Evil of Alzheimer is a disease neurodegenerativa that reaches to the cognitive functions among them the memory, attention and learning. The main strategy used for his/her treatment is addressed in the search of improving the hipofun??o colin?rgica, inhibiting the enzyme acetylcholinesterase, so that the acetylcholine can stay more available in the rift sin?ptica for the accomplishments of the sinapses, since this enzyme has the hidrolisar function the acetylcholine. The nature offers an enormous variety of substances used as f?rmacos and the sea sponges has been demonstrating be rich in these substances. They were extracted of the sponge Plakortis angulospiculatus three polyketides that through the method Ellman demonstrated activity anticolinester?sica. Through techniques of Molecular Modelling, calculations semiempiricos were accomplished using the method PM3 to analyze the geometric interactions and energies involved in the compound polyketidesacetylcholinesterase with the objective of analyzing a possible use of these as f?rmacos for the Evil of Alzheimer. As if he/she didn't know the state in that the ranch would be (with Ser200 and neutral His440 or no) in the moment of the interaction, calculations were accomplished for the three polyketides in both ranches. Studies with inhibitors already known tacrina and huprina X (both neutral one and protonadas) they were also accomplished at both ranches in order to comparison. Resulted obtained he in this work showed the reliability of the employed method, likewise as values of favorable entalpia for the formation of all the compounds independent pollyketide-acetylcholinesterase of the ranch. It was observed by the energy values a preference when the same ones if they found in the ranch protonado diferencialmente of the inhibitors tacrina and huprina X that independent of his/her state (protonados or no) they showed better interaction for the neutral ranch. The calculations accomplished for the tacrina demonstrated that even after optimization the main interactions described already by the literature stayed and that possibly she meets protonada inside of the seen ranch the values of energy found for this structure. The huprina X that is a hybrid of the tacrina with the huperzina A it showed HER likewise the most significant interactions as the more favorable energy values, what is in agreement with the high constant of inhibition of 26pM found in the literature for human's acetilcolinesterase. Before the obtained data we can end that the polyketides in spite of they obtain favorable energy values the formation of the compound polyketide-acetylcholinesterase these values are not competitive with the energy values found for the inhibitors tacrina and huprina X. however, in the production of a f?rmaco they are not taken into account just energy interactions and as the tacrina it already demonstrated to possess high hepatic toxicity, besides adverse reactions as nausea and vomit, the polyketides for they be natural substance were able to in this case be competitive if they demonstrated to possess softer adverse reactions. / O Mal de Alzheimer ? uma doen?a neurodegenerativa que atinge ?s fun??es cognitivas entre elas a mem?ria, aten??o e aprendizagem. A principal estrat?gia utilizada para seu tratamento est? direcionado na busca de melhorar a hipofun??o colin?rgica, inibindo a enzima acetilcolinesterase, para que a acetilcolina possa permanecer mais dispon?vel na fenda sin?ptica para as realiza??es das sinapses, j? que esta enzima tem a fun??o de hidrolisar a acetilcolina. A natureza oferece uma enorme variedade de subst?ncias utilizadas como f?rmacos e as esponjas marinhas tem demonstrado serem ricas nestas subst?ncias. Foram extra?dos da esponja Plakortis angulospiculatus tr?s policet?deos que atrav?s do m?todo Ellman demonstraram atividade anticolinester?sica. Atrav?s de t?cnicas de Modelagem Molecular, foram realizados c?lculos semiempiricos utilizando o m?todo PM3 para analisar as intera??es geom?tricas e energias envolvidas no complexo policet?deos-acetilcolinesterase com o objetivo de analisar uma poss?vel utiliza??o destes como f?rmacos para o Mal de Alzheimer. Como n?o se conhecia o estado em que o s?tio se encontraria (com a Ser200 e His440 neutros ou n?o) no momento da intera??o, foram realizados c?lculos para os tr?s policet?deos em ambos os s?tios. Estudos com inibidores j? conhecidos tacrina e huprina X (ambas neutra e protonadas) tamb?m foram realizados em ambos os s?tios a fim de compara??o. O resultados obtidos neste trabalho mostraram a confiabilidade do m?todo empregado, assim tamb?m como valores de entalpia favor?veis para a forma??o de todos os complexos policet?deo-acetilcolinesterase independente do s?tio. Observou-se pelos valores energ?ticos uma prefer?ncia quando os mesmos se encontravam no s?tio protonado diferencialmente dos inibidores tacrina e huprina X que independente do seu estado (protonados ou n?o) mostraram melhor intera??o pelo s?tio neutro. Os c?lculos realizados para a tacrina demonstraram que mesmo ap?s otimiza??o as principais intera??es j? descritas pela literatura se mantiveram e que possivelmente ela se encontra protonada dentro do s?tio visto os valores de energia encontrados para esta estrutura. A huprina X que ? um h?brido da tacrina com a huperzina A mostrou as intera??es mais significativas assim tamb?m como os valores energ?ticos mais favor?veis, o que est? de acordo com a alta constante de inibi??o de 26pM encontrados na literatura para a acetilcolinesterase de humano. Diante dos dados obtidos podemos concluir que os policet?deos apesar de obterem valores energ?ticos favor?veis a forma??o do complexo policet?deo-acetilcolinesterase estes valores n?o s?o competitivos com os valores energ?ticos encontrados para os inibidores tacrina e huprina X. No entanto, na fabrica??o de um f?rmaco n?o s?o levados em conta apenas intera??es energ?ticas e como a tacrina j? demonstrou possuir alta toxicidade hep?tica, al?m de rea??es adversas como n?usea e v?mito, os policet?deos por serem subst?ncia naturais poderiam neste caso ser competitivos se demonstrassem possuir rea??es adversas mais brandas.

Desde a descoberta dos nanotubos de carbono, tem sido grande o interesse em explorar suas aplicações, e uma delas é a modificação de eletrodos. Muitos trabalhos ilustram as vantagens da aplicação de eletrodos de carbono vítreo modificados com nanotubos de carbono e enzimas. Estes sistemas apresentam resposta amperométrica elevada, com diminuição nos potencias de oxidação ou redução do substrato ou produto enzimático, eliminando a resposta de interferentes. Apresentam bons limites de detecção, melhoras na sensibilidade e estabilidade à medida que oferecem um microambiente favorável à atividade da enzima. Todas estas vantagens tornam interessante o emprego de tais biossensores no monitoramento de pesticidas. Diante da escassez de trabalhos que descrevem esta aplicação, neste trabalho, objetivou-se explorá-la, com ganho em sensibilidade pelo uso dos nanotubos de carbono e em seletividade pelo uso das enzimas. Neste trabalho foi desenvolvido um nanobiossensor para a determinação de carbaril em amostras de tomate. Para isto, os nanotubos de carbono utilizados foram tratados quimicamente e em seguida caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão. O eletrodo de carbono vítreo modificado com nanotubos de carbono foi caracterizado eletroquimicamente e por microscopia eletrônica de varredura. A enzima acetilcolinesterase utilizada teve sua atividade catalítica enzimática determinada pelo método espectrofotométrico. O nanobiossensor teve seus parâmetros de operação otimizados e foi utilizado na determinação de carbaril em amostras de tomate. A avaliação de reprodutibilidade de preparação do nanobiossensor apresentou desvio padrão relativo de 4,02%. Os desvios padrão relativos para a repetibilidade e reprodutibilidade de medidas são, respectivamente, 1,18 e 3,27%. Duas amostras de tomate foram dopadas com 0,500 µmol L-1 e 6,00 µmol L-1 de carbaril, e as respectivas recuperações foram de 96,00 e 95,08%. Os limites de detecção e quantificação obtidos com o nanobiossensor foram LD = 8,96 nmol L-1 e LQ = 29,9 nmol L-1. / Since the discovery of carbon nanotubes, a great interest in exploring their applications has raised, being one of those the modification of electrodes. Many works has shown the advantages of applying glassy carbon electrodes modified with carbon nanotubes and enzymes. These systems present elevated amperometric response with decreased potentials of oxidation or reduction of either the substract or the enzymatic product, eliminating the response of interferences as well. Moreover, these systems present good detection limits, as well as sensibility and stability improvements in consequence of a favorable microenvironment for the enzyme action. All these advantages make interesting the employment of such biosensors in pesticides monitoring. Due to the scarcity of works describing this kind of application, the aim of this work is its exploration, focusing on sensibility increasing caused by the use of carbon nanotubes, as well as selectivity increasing caused by the use of enzymes. In this work a nanobiosensor was developed to carbaryl determination in tomato samples. For this, the employed carbon nanotubes were chemically treated before their characterization by transmission electron microscopy. The glassy carbon electrode modified with carbon nanotubes was characterized both electrochemically and by scan electron microscopy. The employed acetylcholinesterase enzyme had its enzymatic activity measured by spectrophotometric means. The nanobiosensor had its operational parameters optimized and it was employed in the determination of carbaryl in tomato samples. The reproducibility of the nanobiosensor preparation was 4.02%. The relative standard deviation for the repeatability and reproducibility were, respectively, 1.18 and 3.27%. Two tomato samples were spiked with 0.500 µmol L-1 and 6.00 µmol L-1 of carbaryl, and their respective recoveries were 96.00 and 95.08%. The detection and quantitation limits obtained with the developed nanobiosensor were, respectively, 8.96 and 29.9 nmol L-1.

Le projet de cette thèse était l'évaluation du processus de réactivation et l'étude du site actif de l'AChE inhibée par un agent neurotoxique par des méthode computationnelles. L'objectif était de guider le design rationnel de nouveau réactivateurs. Une étude initiale avec un modèle QM tronqué a indiqué la nécessité de modéliser l'environnement enzymatique pour compenser la charge du Glu334. Elle a aussi confirmé le rôle du trou oxyanionique dans la stabilisation des états de transition de la réactivation. Des simulations QM/MM de la réactivation par le réactivateur classique 2-PAM, ainsi que par deux réactivateurs au coeur aromatique non chargé ont été effectuées. Il a été démontré que le Glu202, un résidu à proximité de la triade catalytique de l'AChE, doit être protoné pour que la réactivation ait lieu. Ces simulations ont aussi montré que le réactivateur peut être déprotoné dans le site actif de l'AChE par His447. Les réactivateurs au coeur aromatique non chargé sont plus nucléophiles que la 2-PAM et l'un d'entre eux est plus aisément déprotoné dans le site actif. Nos résultats indiquent que la capacité d'un réactivateur à être facilement déprotoné est plus importante que sa nucléophilie. Enfin, un mécanisme de migration de protons a été identifié par des calculs QM/MM et EVB. Il implique deux glutamates derrière le site actif, Glu450 et Glu452. La possibilité que ces deux protons soient temporairement protonés et donc impliqués dans une migration de protons a été confirmé par des calculs CpHMD. La migration de proton passe par la N-protonation d'une liaison amide, ce qui constitue un nouveau mécanisme. / The project of this PhD was to investigate the reactivation process and the active site of nerve agent inhibited AChE by computational methodologies to gain insight about the rational design of new reactivators. An initial truncated QM model study provided some insight in the necessary compensation of Glu334 by the enzyme. It also confirmed the role of the oxyanionic hole in the stabilization of the transition state of the reactivation. QM/MM simulations of the reactivation with classical reactivator 2-PAM, as well as two non-pyridinium reactivators, were performed. It was shown that Glu202, a residue near the catalytic triad of AChE, needs to be protonated for the reactivation to occur. Those simulations also showed that the reactivator can be deprotonated in the active site of AChE by His447. Non-pyridinium reactivator were found to have a greater nucleophilicity than 2-PAM and, for one of them, to be easily deprotonated in the active site. Our results indicate that the capacity of a reactivator to be deprotonated in the active site of the enzyme is more important than its nucleophilicity. Finally, a proton relay mechanism was identified through QM/MM and EVB simulations. It involves two glutamate residues, Glu450 and Glu452, positioned behind the active site. The potential for these two residues to be transiently protonated and thus involved in a proton relay was confirmed by CpHMD simulations. This proton relay mechanism relies on the N-protonation of an amide which is a novel mechanism.