A amígdala participa dos processos de aprendizagem e memória de natureza emocional, incluindo os comportamentos aversivos. Essa estrutura compreende vários núcleos que estabelecem diferentes conexões com outras estruturas do sistema nervoso. Seu núcleo basal (BA) é um dos principais alvos amigdalares de informações processadas pelo hipocampo. Evidências apontam que o hipocampo seria responsável pela aprendizagem contextual, construindo uma representação integrada dos diferentes estímulos do ambiente numa representação única, denominada representação configuracional do contexto, que inclui também representações do espaço. Congruente com essa hodologia, lesões seletivas do BA resultam em prejuízos comportamentais similares aos encontrados após lesão hipocampal. Por exemplo, ratos com lesão no BA exibem deficiências na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não ao som, indicando que essa região está envolvida no processo de condicionamento aversivo contextual. Porém, não está claro se esse prejuízo decorre da participação do BA na aquisição e/ou evocação e expressão do medo contextual. Os objetivos do presente estudo incluíram avaliar, por meio da inativação reversível do BA, (1) se ele é necessário na aquisição do condicionamento aversivo ao som e/ou ao contexto e (2) qual a natureza da sua participação no condicionamento aversivo ao contexto, isto é, se é necessário para a construção do contexto, para sua associação com o estímulo aversivo e/ou para a evocação da memória e expressão das respostas condicionadas. Num primeiro experimento, muscimol foi infundido no BA antes do treinamento na tarefa de condicionamento aversivo concorrente ao som e ao contexto, e os testes de medo condicionado ao som e ao contexto foram realizados separadamente, na ausência de muscimol. Como esperado, os resultados revelaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não na tarefa de medo condicionado ao som. Num segundo experimento, muscimol foi infundido, em grupos independentes de animais, antes de cada fase da variante do condicionamento aversivo ao contexto que envolve facilitação pela pré-exposição ao contexto, a qual permite distinguir entre a construção configuracional do contexto (fase 1), sua associação com o estímulo aversivo (fase 2) e posterior evocação e expressão do medo condicionado (fase 3). Resultados mostraram que somente os ratos que receberam muscimol antes da fase 2, mas não os que receberam muscimol antes das fases 1 e 3, apresentaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto. No conjunto, esses resultados indicam que o BA participa do condicionamento aversivo ao contexto sendo imprescindível no processo de associação da representação configuracional do contexto com o estímulo aversivo, mas não nos processos de construção da representação sobre o contexto e nem de evocação da memória e expressão das respostas condicionadas de medo / The amygdala is involved in emotional learning and memory, including fear conditioning. This brain structure includes several nuclei with distinct hodology. The basal nucleus (BA) receives processed information from the hippocampal formation. Evidence indicates that the hippocampus integrates environmental stimuli in a single representation thus rendering it involved in contextual (including spatial) learning and memory. Congruent with this hodological evidence, selective damage to the BA results in behavioral impairments similar to those found after hippocampal damage. For instance, rats with BA damage exhibit performance impairments in contextual, but not auditory, fear conditioning tasks. However, it is not clear to which extent this disruption is related to the BA involvement in either acquisition of contextual fear or retrieval of memory and fear expression, or both. This study aimed at investigating, by way of reversible inactivation of the BA, (1) its involvement in acquisition of auditory and contextual fear conditioning, and (2) the nature of its participation in contextual fear conditioning, that is, if it is necessary for building a representation about the context, for associating the context with the aversive stimulus and/or for memory retrieval and expression of contextual fear conditioning. In the first experiment, muscimol was infused into the BA before training in a concurrent auditory and contextual fear conditioning task, and testing for auditory and contextual fear conditioning was run separately in the absence of muscimol. As expected, results revealed disruption of performance in the contextual, but not in the auditory, conditioning task. In the second experiment, muscimol was infused into the BA, in independent groups of animals, before each of the three phases of a contextual fear conditioning variant that involves context pre-exposure facilitation, thus allowing to evaluate if functional reversible inactivation of the BA interfered with (1) building an integrated representation of the environment (the context), (2) its association with the aversive stimulus, and/or (3) memory retrieval and expression of fear conditioning. Results showed that muscimol infusion into BA before phase 2, but not phases 1 and 3, impaired performance in the contextual fear conditioning task. Together, these results indicate that a functional BA is required for acquisition of contextual fear conditioning in order to establish an association between the context and the aversive stimulus, but not for building a context neither for memory retrieval and expression of fear conditioned responses

Previous research investigating the neural circuitry underlying memory consolidation has primarily focused on single “nodes” in the circuit rather than the neural connections between brain regions, despite the likely importance of these connections in mediating different aspects or forms of memory. This focus has, in part, been due to technical limitations; however the advent of optogenetics has altered our capabilities in this regard, enabling optical control over neural pathways with temporal and spatial precision. The current set of experiments took advantage of optogenetics to control activity in specific pathways connecting brain regions in rats immediately after different kinds of learning. Chapter 2 first established the use of optogenetics to manipulate activity in the basolateral amygdala (BLA), which has been shown to modulate memory consolidation for a variety of types of learning likely through its connections to various downstream regions. Using a one-trial inhibitory avoidance task, a simple and robust fear learning paradigm, we found that both post-training stimulation and inhibition of BLA activity could enhance or impair later retention of the task, respectively. Enhancement was specific to stimulation using trains of 40, but not 20, Hz light pulses. Chapters 3 and 4 examined the projections from the BLA to the ventral hippocampus (VH) and medial entorhinal cortex (mEC) as the BLA’s ability to influence the consolidation for many types of memory is believed to be mediated through discrete projections to distinct brain regions. Indeed, the BLA innervates both structures, and prior studies suggest that the mEC and VH have distinct roles in memory processing related to contextual and nociceptive (footshock) learning, such as those involved in contextual fear conditioning (CFC). Optogenetic stimulation or inhibition of the BLA-VH or BLA-mEC pathway after training on a modified CFC task, in which the nociceptive or emotional stimulus (the footshock) and the context are separated, enabled experimental manipulations to selectively affect the consolidation for learning about one component and not the other. Optogenetic stimulation/inhibition was given to each candidate pathway immediately after the relevant training to determine its role in influencing consolidation for that component of the CFC learning. Chapter 3 results showed that stimulation of the BLA-VH pathway following footshock, but not context, training enhanced retention, an effect that was specific to trains of 40 Hz stimulation. Post-footshock photoinhibition of the same pathway impaired retention for the task. Similar investigations of the BLA-mEC pathway in Chapter 4 produced complementary findings. Post-context, but not footshock, stimulation of the pathway enhanced retention. In this particular case, only trains of 8 Hz stimulation were effective at enhancing retention. These results are the first, to our knowledge, to find that BLA inputs to different structures selectively modulate consolidation for different aspects of learning, thus enhancing our understanding of the neural connections underlying the consolidation of contextual fear conditioning and providing a critical foundation for future research.

A extinção é uma forma de aprendizado inibitório que se origina na omissão do reforço ou estímulo incondicionado, inibindo a evocação de uma resposta ou comportamento aprendido anteriormente. Muitas formas de aprendizado são moduladas por receptores β- noradrenérgicos, D1-dopaminérgicos e H2-histaminérgicos no córtex pré-frontal ventromedial (vmPFC), no complexo basolateral da amígdala (BLA) e no hipocampo dorsal (DH). Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar a modulação da extinção de memória aversiva nestas três regiões cerebrais. Para isso, utilizamos ratos machos Wistar, que foram submetidos ao paradigma de esquiva inibitória (EI) ou condicionamento contextual ao medo (CCM). As diferentes drogas utilizadas foram infundidas através das cânulas guias implantadas estereotaxicamente no DH, BLA ou vmPFC imediatamente após a sessão de extinção e seus efeitos sobre a extinção foram avaliados em uma sessão de teste realizada 24 h depois. A DSerina (50 μg/lado), modulador positivo do receptor NMDA, e o SKF9188 (12.5 μg/lado), inibidor da enzima histamina metil-transferase, melhoraram a consolidação da memória de extinção nas tarefas de EI e CCM. Entretanto, o AP5 (5 μg/lado), antagonista do receptor glutamatérgico NMDA, e a ranitidina (17.5 μg/lado), antagonista do receptor histaminérgico H2, prejudicaram a extinção em ambos os paradigmas, indicando que os receptores glutamatérgicos do tipo NMDA estão envolvidos na consolidação dos dois paradigmas utilizados, e que os receptores histaminérgicos H2 modulam a extinção nas três estruturas estudadas. A noradrenalina (1 μg/lado), o antagonista β-adrenoreceptor, timolol (1 μg/lado), o agonista dos receptores D1, SKF38393 (12.5 μg/lado) e o antagonista dos receptores D1, SCH23390 (1.5 μg/lado) também afetam a extinção nas duas tarefas, porém, seus efeitos são variados dependendo da tarefa e do local da infusão, sugerindo que a modulação da extinção pelos receptores β- e D1 é mais complexa. Nossos resultados mostram que as três estruturas são ativadas durante o processo de extinção da memória e que os sistemas neuromodulatórios atuam de formas distintas nessas tarefas. / Extinction consists of the learned inhibition of retrieval of previously acquired memory. Many forms of learning are modulated by β-noradrenergic, D1-dopaminergic and H2-histaminergic receptors on ventromedial prefrontal cortex (vmPFC), basolateral amygdala (BLA) and dorsal hippocampus. Therefore, the aim of this work was investigated the modulation of aversive memory extinction in these brain structures. Male Wistar rats were submitted to inhibitory avoidance paradigm (EI) or contextual fear conditioning (CCM). The drugs were infused through cannulae implanted into the DH, BLA or vmPFC immediately after the extinction session and their effects were evaluated 24 h later. D-serine (50 μg/side), a NMDA receptor stimulant, and SKF9188 (12.5 μg/side), a histamine methyl-transferase inhibitor, enhanced the consolidation of the extinction memory in EI and CCM tasks. However, AP5 (5 μg/side), a NMDA-antagonist, and ranitidine (17.5 μg/side), a H2- histaminergic antagonist, impaired the extinction of both tasks, indicated that NMDA receptors are involved in the consolidation of extinction of both tasks, and histamine H2 receptors modulate that process in all areas studied. Noradrenaline (1 μg/side), timolol 1 μg/side), a β-adrenergic antagonist, SKF38393 (12.5 μg/side) and SCH23390 (1.5 μg/side), D1 agonist and antagonist receptor, respectively, also affected the extinction, but their effects varied with the task and with the site of infusion, suggesting that extinction modulation by β- and D1 is more complex. In conclusion, the three structures investigated are activated in the aversive memory extinction and the neuromodulatory systems act of different forms in these structures.

A extinção é uma forma de aprendizado inibitório que se origina na omissão do reforço ou estímulo incondicionado, inibindo a evocação de uma resposta ou comportamento aprendido anteriormente. Muitas formas de aprendizado são moduladas por receptores β- noradrenérgicos, D1-dopaminérgicos e H2-histaminérgicos no córtex pré-frontal ventromedial (vmPFC), no complexo basolateral da amígdala (BLA) e no hipocampo dorsal (DH). Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar a modulação da extinção de memória aversiva nestas três regiões cerebrais. Para isso, utilizamos ratos machos Wistar, que foram submetidos ao paradigma de esquiva inibitória (EI) ou condicionamento contextual ao medo (CCM). As diferentes drogas utilizadas foram infundidas através das cânulas guias implantadas estereotaxicamente no DH, BLA ou vmPFC imediatamente após a sessão de extinção e seus efeitos sobre a extinção foram avaliados em uma sessão de teste realizada 24 h depois. A DSerina (50 μg/lado), modulador positivo do receptor NMDA, e o SKF9188 (12.5 μg/lado), inibidor da enzima histamina metil-transferase, melhoraram a consolidação da memória de extinção nas tarefas de EI e CCM. Entretanto, o AP5 (5 μg/lado), antagonista do receptor glutamatérgico NMDA, e a ranitidina (17.5 μg/lado), antagonista do receptor histaminérgico H2, prejudicaram a extinção em ambos os paradigmas, indicando que os receptores glutamatérgicos do tipo NMDA estão envolvidos na consolidação dos dois paradigmas utilizados, e que os receptores histaminérgicos H2 modulam a extinção nas três estruturas estudadas. A noradrenalina (1 μg/lado), o antagonista β-adrenoreceptor, timolol (1 μg/lado), o agonista dos receptores D1, SKF38393 (12.5 μg/lado) e o antagonista dos receptores D1, SCH23390 (1.5 μg/lado) também afetam a extinção nas duas tarefas, porém, seus efeitos são variados dependendo da tarefa e do local da infusão, sugerindo que a modulação da extinção pelos receptores β- e D1 é mais complexa. Nossos resultados mostram que as três estruturas são ativadas durante o processo de extinção da memória e que os sistemas neuromodulatórios atuam de formas distintas nessas tarefas. / Extinction consists of the learned inhibition of retrieval of previously acquired memory. Many forms of learning are modulated by β-noradrenergic, D1-dopaminergic and H2-histaminergic receptors on ventromedial prefrontal cortex (vmPFC), basolateral amygdala (BLA) and dorsal hippocampus. Therefore, the aim of this work was investigated the modulation of aversive memory extinction in these brain structures. Male Wistar rats were submitted to inhibitory avoidance paradigm (EI) or contextual fear conditioning (CCM). The drugs were infused through cannulae implanted into the DH, BLA or vmPFC immediately after the extinction session and their effects were evaluated 24 h later. D-serine (50 μg/side), a NMDA receptor stimulant, and SKF9188 (12.5 μg/side), a histamine methyl-transferase inhibitor, enhanced the consolidation of the extinction memory in EI and CCM tasks. However, AP5 (5 μg/side), a NMDA-antagonist, and ranitidine (17.5 μg/side), a H2- histaminergic antagonist, impaired the extinction of both tasks, indicated that NMDA receptors are involved in the consolidation of extinction of both tasks, and histamine H2 receptors modulate that process in all areas studied. Noradrenaline (1 μg/side), timolol 1 μg/side), a β-adrenergic antagonist, SKF38393 (12.5 μg/side) and SCH23390 (1.5 μg/side), D1 agonist and antagonist receptor, respectively, also affected the extinction, but their effects varied with the task and with the site of infusion, suggesting that extinction modulation by β- and D1 is more complex. In conclusion, the three structures investigated are activated in the aversive memory extinction and the neuromodulatory systems act of different forms in these structures.

A extinção é uma forma de aprendizado inibitório que se origina na omissão do reforço ou estímulo incondicionado, inibindo a evocação de uma resposta ou comportamento aprendido anteriormente. Muitas formas de aprendizado são moduladas por receptores β- noradrenérgicos, D1-dopaminérgicos e H2-histaminérgicos no córtex pré-frontal ventromedial (vmPFC), no complexo basolateral da amígdala (BLA) e no hipocampo dorsal (DH). Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar a modulação da extinção de memória aversiva nestas três regiões cerebrais. Para isso, utilizamos ratos machos Wistar, que foram submetidos ao paradigma de esquiva inibitória (EI) ou condicionamento contextual ao medo (CCM). As diferentes drogas utilizadas foram infundidas através das cânulas guias implantadas estereotaxicamente no DH, BLA ou vmPFC imediatamente após a sessão de extinção e seus efeitos sobre a extinção foram avaliados em uma sessão de teste realizada 24 h depois. A DSerina (50 μg/lado), modulador positivo do receptor NMDA, e o SKF9188 (12.5 μg/lado), inibidor da enzima histamina metil-transferase, melhoraram a consolidação da memória de extinção nas tarefas de EI e CCM. Entretanto, o AP5 (5 μg/lado), antagonista do receptor glutamatérgico NMDA, e a ranitidina (17.5 μg/lado), antagonista do receptor histaminérgico H2, prejudicaram a extinção em ambos os paradigmas, indicando que os receptores glutamatérgicos do tipo NMDA estão envolvidos na consolidação dos dois paradigmas utilizados, e que os receptores histaminérgicos H2 modulam a extinção nas três estruturas estudadas. A noradrenalina (1 μg/lado), o antagonista β-adrenoreceptor, timolol (1 μg/lado), o agonista dos receptores D1, SKF38393 (12.5 μg/lado) e o antagonista dos receptores D1, SCH23390 (1.5 μg/lado) também afetam a extinção nas duas tarefas, porém, seus efeitos são variados dependendo da tarefa e do local da infusão, sugerindo que a modulação da extinção pelos receptores β- e D1 é mais complexa. Nossos resultados mostram que as três estruturas são ativadas durante o processo de extinção da memória e que os sistemas neuromodulatórios atuam de formas distintas nessas tarefas. / Extinction consists of the learned inhibition of retrieval of previously acquired memory. Many forms of learning are modulated by β-noradrenergic, D1-dopaminergic and H2-histaminergic receptors on ventromedial prefrontal cortex (vmPFC), basolateral amygdala (BLA) and dorsal hippocampus. Therefore, the aim of this work was investigated the modulation of aversive memory extinction in these brain structures. Male Wistar rats were submitted to inhibitory avoidance paradigm (EI) or contextual fear conditioning (CCM). The drugs were infused through cannulae implanted into the DH, BLA or vmPFC immediately after the extinction session and their effects were evaluated 24 h later. D-serine (50 μg/side), a NMDA receptor stimulant, and SKF9188 (12.5 μg/side), a histamine methyl-transferase inhibitor, enhanced the consolidation of the extinction memory in EI and CCM tasks. However, AP5 (5 μg/side), a NMDA-antagonist, and ranitidine (17.5 μg/side), a H2- histaminergic antagonist, impaired the extinction of both tasks, indicated that NMDA receptors are involved in the consolidation of extinction of both tasks, and histamine H2 receptors modulate that process in all areas studied. Noradrenaline (1 μg/side), timolol 1 μg/side), a β-adrenergic antagonist, SKF38393 (12.5 μg/side) and SCH23390 (1.5 μg/side), D1 agonist and antagonist receptor, respectively, also affected the extinction, but their effects varied with the task and with the site of infusion, suggesting that extinction modulation by β- and D1 is more complex. In conclusion, the three structures investigated are activated in the aversive memory extinction and the neuromodulatory systems act of different forms in these structures.

A amígdala participa dos processos de aprendizagem e memória de natureza emocional, incluindo os comportamentos aversivos. Essa estrutura compreende vários núcleos que estabelecem diferentes conexões com outras estruturas do sistema nervoso. Seu núcleo basal (BA) é um dos principais alvos amigdalares de informações processadas pelo hipocampo. Evidências apontam que o hipocampo seria responsável pela aprendizagem contextual, construindo uma representação integrada dos diferentes estímulos do ambiente numa representação única, denominada representação configuracional do contexto, que inclui também representações do espaço. Congruente com essa hodologia, lesões seletivas do BA resultam em prejuízos comportamentais similares aos encontrados após lesão hipocampal. Por exemplo, ratos com lesão no BA exibem deficiências na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não ao som, indicando que essa região está envolvida no processo de condicionamento aversivo contextual. Porém, não está claro se esse prejuízo decorre da participação do BA na aquisição e/ou evocação e expressão do medo contextual. Os objetivos do presente estudo incluíram avaliar, por meio da inativação reversível do BA, (1) se ele é necessário na aquisição do condicionamento aversivo ao som e/ou ao contexto e (2) qual a natureza da sua participação no condicionamento aversivo ao contexto, isto é, se é necessário para a construção do contexto, para sua associação com o estímulo aversivo e/ou para a evocação da memória e expressão das respostas condicionadas. Num primeiro experimento, muscimol foi infundido no BA antes do treinamento na tarefa de condicionamento aversivo concorrente ao som e ao contexto, e os testes de medo condicionado ao som e ao contexto foram realizados separadamente, na ausência de muscimol. Como esperado, os resultados revelaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto, mas não na tarefa de medo condicionado ao som. Num segundo experimento, muscimol foi infundido, em grupos independentes de animais, antes de cada fase da variante do condicionamento aversivo ao contexto que envolve facilitação pela pré-exposição ao contexto, a qual permite distinguir entre a construção configuracional do contexto (fase 1), sua associação com o estímulo aversivo (fase 2) e posterior evocação e expressão do medo condicionado (fase 3). Resultados mostraram que somente os ratos que receberam muscimol antes da fase 2, mas não os que receberam muscimol antes das fases 1 e 3, apresentaram prejuízo de desempenho na tarefa de medo condicionado ao contexto. No conjunto, esses resultados indicam que o BA participa do condicionamento aversivo ao contexto sendo imprescindível no processo de associação da representação configuracional do contexto com o estímulo aversivo, mas não nos processos de construção da representação sobre o contexto e nem de evocação da memória e expressão das respostas condicionadas de medo / The amygdala is involved in emotional learning and memory, including fear conditioning. This brain structure includes several nuclei with distinct hodology. The basal nucleus (BA) receives processed information from the hippocampal formation. Evidence indicates that the hippocampus integrates environmental stimuli in a single representation thus rendering it involved in contextual (including spatial) learning and memory. Congruent with this hodological evidence, selective damage to the BA results in behavioral impairments similar to those found after hippocampal damage. For instance, rats with BA damage exhibit performance impairments in contextual, but not auditory, fear conditioning tasks. However, it is not clear to which extent this disruption is related to the BA involvement in either acquisition of contextual fear or retrieval of memory and fear expression, or both. This study aimed at investigating, by way of reversible inactivation of the BA, (1) its involvement in acquisition of auditory and contextual fear conditioning, and (2) the nature of its participation in contextual fear conditioning, that is, if it is necessary for building a representation about the context, for associating the context with the aversive stimulus and/or for memory retrieval and expression of contextual fear conditioning. In the first experiment, muscimol was infused into the BA before training in a concurrent auditory and contextual fear conditioning task, and testing for auditory and contextual fear conditioning was run separately in the absence of muscimol. As expected, results revealed disruption of performance in the contextual, but not in the auditory, conditioning task. In the second experiment, muscimol was infused into the BA, in independent groups of animals, before each of the three phases of a contextual fear conditioning variant that involves context pre-exposure facilitation, thus allowing to evaluate if functional reversible inactivation of the BA interfered with (1) building an integrated representation of the environment (the context), (2) its association with the aversive stimulus, and/or (3) memory retrieval and expression of fear conditioning. Results showed that muscimol infusion into BA before phase 2, but not phases 1 and 3, impaired performance in the contextual fear conditioning task. Together, these results indicate that a functional BA is required for acquisition of contextual fear conditioning in order to establish an association between the context and the aversive stimulus, but not for building a context neither for memory retrieval and expression of fear conditioned responses

Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

O receptor canabinoide CB1, altamente expresso em várias regiões do sistema límbico, possui um importante papel na regulação da plasticidade sináptica implicada nas diferentes fases da memória emocional. Em roedores, embora já estejam bem caracterizados os efeitos da manipulação farmacológica do receptor CB1 na amígdala, no hipocampo e no córtex pré-frontal medial sobre a modulação de memórias aversivas, sua função no córtex retrosplenial (RSC) permanece desconhecida. Neste trabalho, usando o paradigma pavloviano de condicionamento aversivo ao contexto em ratos, exploramos o papel do sistema canabinoide no RSC sobre as fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória. Demostramos que a infusão intra-RSC imediatamente pós-treino de AM251 (11 μg/μL), um antagonista seletivo CB1, causa amnésia retrógrada no teste de retenção da memória conduzido 48 h após o condicionamento, enquanto que a infusão bilateral de CP55940, um agonista canabinoide CB1/CB2 (5μg/μL), facilita a consolidação da memória. No protocolo de reconsolidação (injeção intra-RSC após uma sessão de reativação de 4 min, conduzida 48 h depois do condicionamento) foram encontramos efeitos opostos no teste de retenção da memória realizado 24 h após a reativação: o bloqueio dos receptores CB1 facilita, enquanto que sua ativação prejudica o fenômeno de reconsolidação da memória. Além disso, quando o AM251 é injetado intra-RSC 20 min antes de uma reexposição prolongada (de 30 min), observamos que a consolidação da memória de extinção é prejudicada, enquanto que o CP55940 acelera a extinção e impede sua recuperação espontânea ao longo do tempo. Concluindo, nossos resultados apresentam novas evidências sobre a função do sistema canabinoide no RSC sobre a modulação das fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória emocional. / The CB1 cannabinoid receptor is highly expressed in many regions of the limbic system, having an important role in the regulation of synaptic plasticity implicated in different phases of emotional memory processing. In rodents, although are well characterized the effects of the pharmacological manipulations of the CB1 receptor in the amygdala, hippocampus, and medial prefrontal cortex upon the modulation of aversive memories, their function in the retrosplenial cortex (RSC) remains unknown. In this study, using pavlovian contextual fear conditioning in rats, we explored the role of the cannabinoid system in the RSC on memory consolidation, reconsolidation, and extinction. We showed that posttraining intra-RSC infusion of AM251 (11 μg/μL), a selective CB1 antagonist, causes retrograde amnesia during the test for memory retention conducted 48 h after learning, whereas the bilateral infusion of CP55940 (5 μg/μL), a CB1/CB2 agonist, enhanced fear memory consolidation. In the reconsolidation protocol (postreactivation intra-RSC infusions conducted 48 h after training) we found opposite effects in the test session performed 24 h after memory reactivation: blocking CB1 receptors enhanced, whereas the activation of cannabinoid receptors impaired memory reconsolidation. Furthermore, when AM251 was infused intra-RSC 20 min before a prolonged reexposure (30 min), memory extinction was impaired, whereas the infusion of CP55940 accelerates memory extinction and prevents spontaneous recovery, maintaining memory extinguished over time. In conclusion, these data shed new light about the function of the cannabinoid system in the RSC on the role of contextual-fear related memory consolidation, reconsolidation, and extinction.

O receptor canabinoide CB1, altamente expresso em várias regiões do sistema límbico, possui um importante papel na regulação da plasticidade sináptica implicada nas diferentes fases da memória emocional. Em roedores, embora já estejam bem caracterizados os efeitos da manipulação farmacológica do receptor CB1 na amígdala, no hipocampo e no córtex pré-frontal medial sobre a modulação de memórias aversivas, sua função no córtex retrosplenial (RSC) permanece desconhecida. Neste trabalho, usando o paradigma pavloviano de condicionamento aversivo ao contexto em ratos, exploramos o papel do sistema canabinoide no RSC sobre as fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória. Demostramos que a infusão intra-RSC imediatamente pós-treino de AM251 (11 μg/μL), um antagonista seletivo CB1, causa amnésia retrógrada no teste de retenção da memória conduzido 48 h após o condicionamento, enquanto que a infusão bilateral de CP55940, um agonista canabinoide CB1/CB2 (5μg/μL), facilita a consolidação da memória. No protocolo de reconsolidação (injeção intra-RSC após uma sessão de reativação de 4 min, conduzida 48 h depois do condicionamento) foram encontramos efeitos opostos no teste de retenção da memória realizado 24 h após a reativação: o bloqueio dos receptores CB1 facilita, enquanto que sua ativação prejudica o fenômeno de reconsolidação da memória. Além disso, quando o AM251 é injetado intra-RSC 20 min antes de uma reexposição prolongada (de 30 min), observamos que a consolidação da memória de extinção é prejudicada, enquanto que o CP55940 acelera a extinção e impede sua recuperação espontânea ao longo do tempo. Concluindo, nossos resultados apresentam novas evidências sobre a função do sistema canabinoide no RSC sobre a modulação das fases de consolidação, reconsolidação e extinção da memória emocional. / The CB1 cannabinoid receptor is highly expressed in many regions of the limbic system, having an important role in the regulation of synaptic plasticity implicated in different phases of emotional memory processing. In rodents, although are well characterized the effects of the pharmacological manipulations of the CB1 receptor in the amygdala, hippocampus, and medial prefrontal cortex upon the modulation of aversive memories, their function in the retrosplenial cortex (RSC) remains unknown. In this study, using pavlovian contextual fear conditioning in rats, we explored the role of the cannabinoid system in the RSC on memory consolidation, reconsolidation, and extinction. We showed that posttraining intra-RSC infusion of AM251 (11 μg/μL), a selective CB1 antagonist, causes retrograde amnesia during the test for memory retention conducted 48 h after learning, whereas the bilateral infusion of CP55940 (5 μg/μL), a CB1/CB2 agonist, enhanced fear memory consolidation. In the reconsolidation protocol (postreactivation intra-RSC infusions conducted 48 h after training) we found opposite effects in the test session performed 24 h after memory reactivation: blocking CB1 receptors enhanced, whereas the activation of cannabinoid receptors impaired memory reconsolidation. Furthermore, when AM251 was infused intra-RSC 20 min before a prolonged reexposure (30 min), memory extinction was impaired, whereas the infusion of CP55940 accelerates memory extinction and prevents spontaneous recovery, maintaining memory extinguished over time. In conclusion, these data shed new light about the function of the cannabinoid system in the RSC on the role of contextual-fear related memory consolidation, reconsolidation, and extinction.