Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-09-09Bitstream added on 2014-06-13T18:44:22Z : No. of bitstreams: 1 medeiros_mim_dr_jabo.pdf: 522825 bytes, checksum: 066e5211f8954b4b476c5f2c60691d33 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Foi realizado o estudo epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do Queijo Tipo Minas Frescal em uma micro-usina no Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras, as quais foram colhidas do leite cru e pasteurizado, mãos do manipulador, queijo embalado para consumo e diversos pontos do fluxograma de seu processamento. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de genes codificadores das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1, foram realizadas a partir da amplificação dos fragmentos de DNA genômico específico. Entre as 41 (29,3,4%) das estirpes confirmadas como sendo S. aureus, 25 (61%) mostraram-se positivas na pesquisa de genes codificadores de toxinas estafilocócicas. Os pontos de maior frequência de estirpes de S. aureus toxigênico foram as mãos do manipulador (16,0%), o leite cru do tanque de recepção (12,0%), o leite pasteurizado (12,0%) e o Queijo Tipo Minas Frescal pronto para consumo (12,0%). O gene codificador de enterotoxina de maior frequência identificada foi o sea. Na determinação do potencial toxigênico das estirpes com genes codificadores de enterotoxinas por imunodifusão, apenas uma estirpe isolada da superfície interna do tanque de estocagem do leite cru foi produtora da enterotoxina SEC. Houve variabilidade genética entre as 41 estirpes de S. aureus isoladas, uma vez que foram identificados 22 pulsotipos diferentes pelo PFGE. Os resultados obtidos permitem a adoção de medidas para a melhoria do processamento do Queijo Tipo Minas Frescal de modo a reduzir o risco potencial que estas toxinas podem representar para a saúde da população consumidora deste produto / We performed molecular epidemiological study of strains of Staphylococcus aureus isolated toxigenic potential in the process of producing the Frescal Minas Type Cheese in a micro-mill in State of São Paulo. For this, six samples were taken during the period June 2008 to July 2009 in order to make a total of 140 samples, which were collected raw and pasteurized milk, the handler's hands, cheese packaged for consumption and different points flowchart of processing. Confirmation of the molecular species of the isolates and the presence of genes encoding enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin, were made from the amplification of specific fragments of genomic DNA. Among the 41 (29.3%) of strains confirmed as S. aureus, 25 (61%) were positive in the research of genes encoding staphylococcal toxins. Points higher frequency of toxigenic strains of S. aureus were the hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk (12.0%) and Frescal Minas Type Cheese ready for consumption (12.0%). The gene encoding enterotoxin most frequently identified was the sea. In determining the potential toxigenic strains with genes encoding enterotoxins by immunodiffusion, only one strain isolated from the inside surface of the storage tank of raw milk was the producer of enterotoxin SEC. There was genetic variability among the 41 strains of S. aureus isolated, since they were identified by 22 different PFGE pulsotypes. The results obtained allow the adoption of measures to improve the processing of Frescal Minas Type Cheese to reduce the potential risk that these toxins can pose to the health of consumers of this product

Os produtos de origem animal, produzidos em indústrias brasileiras e inspecionados pelo Serviço de Inspeção Federal, passam por diversos controles, em todas as etapas do seu processamento. Após a industrialização, são submetidos a análises em laboratórios oficiais, para verificação do cumprimento de parâmetros que os definem como aceitáveis ao consumo e isentos de risco. Uma das análises realizadas rotineiramente é a enumeração de Staphylococcus aureus (S. aureus). Este microrganismo possui um risco associado a sua presença em grande número, pois alguns deles têm a capacidade de produzir, sob determinadas condições, enterotoxinas termoestáveis, que, ao serem ingeridas, juntamente com o alimento, produzem uma enfermidade. A proposta deste trabalho foi estudar a distribuição das cepas de S. aureus isoladas de amostras de produtos de origem animal das regiões sul, sudeste, norte e nordeste do Brasil e caracterizá-las, com objetivo de estimar riscos de transmissão, através dos alimentos, de cepas resistentes aos antimicrobianos normalmente utilizados em tratamentos de infecções estafilocócicas e investigar a capacidade destas de produzirem as chamadas "enterotoxinas clássicas" (SEA, SEB, SEC, SED e SEE). Os isolados bacterianos foram originários de 3.748 amostras de diversos produtos de origem animal, que foram analisadas em laboratórios oficiais do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), no período de 2003 e 2004. Duzentos e quarenta e cinco cepas de S. aureus, com diversas quantificações, foram isoladas e caracterizadas fenotipicamente, através de critérios estabelecidos como padrões nas análises do MAPA e através de outros complementares, para certificação de que se tratavam mesmo de S. aureus. Os isolados obtidos foram submetidos ao ensaio imunoenzimático automatizado (ELFA - Enzyme-linked Fluorescent Assay - VIDAS®Staph enterotoxin II SET2), para detectar a capacidade de produzirem quantidades detectáveis das cinco enterotoxinas clássicas (SEs). Entre os isolados positivos no ensaio imunoenzimático, determinou-se a freqüência de amplificação, pela Reação em Cadeia da Polimerase, de cada um dos genes respectivos (sea, seb, sec, sed e see). Posteriormente, foi realizado estudo das resistências dos isolados de S. aureus frente a 17 antimicrobianos de importância clínica, pelo método da difusão em ágar. Os isolados foram agrupados de acordo com os perfis de amplificação dos genes das enterotoxinas e pelos perfis de resistência aos antimicrobianos, correlacionando-os com os tipos de alimentos e as regiões nas quais foram encontrados. Oitenta e um isolados produziram quantidades detectáveis de enterotoxinas. Os genes mais freqüentemente encontrados foram o seb e o sec-1 (ambos com 76,54%), seguidos do sea (61,73%). Apenas quatro dos isolados produtores de enterotoxinas clássicas (três originários de queijo de coalho e um de bacon) apresentaram contagens >105. Em cinqüenta e nove cepas (72,84%) houve amplificação de múltiplos genes que codificam enterotoxinas (A-E). Com relação às 81 cepas que produziram enterotoxinas em caldo de cultivo, observou-se que 63 (77,8%) eram provenientes de produtos cárneos, 11 (13,6%) de produtos lácteos, três (3,7%) de pescados e quatro (4,9%) de outros produtos de origem animal. Cinco eram da região norte, quatro da região nordeste, 19 da região sul e 53 da região sudeste. O grupo formado pelo perfil sea, seb e sec combinados foi o mais freqüente, com 33 isolados. Vinte e seis cepas deste grupo eram originárias da região sudeste, cinco da região norte e dois da região sul. Oitenta e oito cepas não apresentaram nenhuma resistência aos antimicrobianos testados. As resistências mais freqüentes foram frente à penicilina, norfloxacina, canamicina e tetraciclina. Foram formados 64 perfis diferentes de resistência. O perfil mais freqüente foi resistência à penicilina, unicamente, seguido de resistência à penicilina/canamicina. A partir dos resultados deste trabalho, pode-se concluir que o risco de estarem presentes enterotoxinas nos alimentos de origem animal que passam por processos de industrialização controlados e acompanhados pelo Serviço Oficial de Inspeção brasileiro é muito baixo, (somente quatro das 3.748 amostras) Entretanto, uma vez que foram detectados diversos perfis de resistência a antimicrobianos nos isolados de Staphylococcus aureus obtidos, a possibilidade de veiculação e disseminação dessas cepas resistentes, através de alimentos de origem animal, pode existir e deve ser monitorada. / Food from animal origin produced at Brazilian industries and inspected by the Federal Inspection Service suffer many controls in all stages of their processing. After the industrialization, they are tested in official laboratories for verification of the parameters which define them as acceptable for consumption and free of risk. One of the tests routinely carried out is the Staphylococcus aureus (S. aureus) enumeration. These microorganism have a risk associated with their presence in large numbers. Some of them have the capacity to produce, under certain conditions, heat-stable staphylococcal toxins. If they are ingested with food, they will produce foodborne disease. The aim of this report was to study the distribution and feature of S. aureus strains isolated from food animal origin products, in order to estimate risks of transmission of resistant strains to antibiotics commonly used in treatment of staphylococcal infections through food and to investigate their ability to produce so-called "classical enterotoxins" (SEA, SEB, SEC, SED and SEE). The food samples tested were from different regions of Brazil (south, southest, north and northeast). From a total of 3,748 food samples, analized in official laboratories from Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA) between 2003 and 2004, 245 presented different counts of S. aureus. They were isolated and characterized phenotypically, using analysis criteria established by the MAPA and through others complementary tests, for guarantee that they are really S. aureus. The isolates were submited to automated immunoassay method (Enzyme-Linked Fluorescent Assay - VIDAS®Staph enterotoxin II SET2) for detection of the strains ability to produce detectable quantities of the five classical enterotoxins (SEs). Among the positive strains in enzyme immunoassay, it was determinate the frequency of amplification, by Polymerase Chain Reaction (PCR), of each of the respective genes (sea, seb, sec-1, sed and see). Subsequently, it was studied S. aureus resistance, by the diffusion in agar method, to 17 clinical importance antimicrobials. The strains were grouped according to the enterotoxin genes and the antimicrobial resistance profiles, correlating them with the types of food and regions which they have been found. Eighty-one strains produced detectable amounts of enterotoxins. The most frequent genes found in those strains were seb and sec-1 (both with 76.54%), followed by sea (61.73%). Only four enterotoxin producer strains presented counts >105 (three samples of Brazilian cottage-like cheese - "queijo de coalho", and one sample of bacon). In 59 isolates (72.84%) it was observed an amplification of multiple genes encoding enterotoxins (A-E). In relation to the 81 strains that produced enterotoxins in culture broth, we observed that 63 (77.8%) came from meat products, 11 (13.6%) were samples of milk products, three (3.7%) were fish, and four (4.9%) were others products of animal origin. Five samples were from the North, four from the Northeast, 19 from the South and 53 from the Southeast region of Brazil. The most frequent profile was found in 33 strains, and was composed by sea, seb, and sec genes. Twenty-six strains of this group were from Sutheast, five from North and two from South Region. Eighty-eight strains did not show any resistance to antimicrobial tested. The highest resistance frequency was observed against penicillin, norfloxacin, kanamycin and tetracycline. Sixty four different resistance profiles could be identified. The profile resistance to penicillin, follow by the profile to penicillin/kanamycin, were the most prevalent. From these results, it is possible to conclude that the risk of having pre-formed enterotoxins in animal derived food items that go through an industrial process, controlled by the Brazilian Official Inspection Service, is very low (only four of 3,748 samples). However, the identification of resistance profiles was detected in S. aureus strains. The possibility of transmission and distribution of these resistant strains through food of animal origin can exist and should be monitored.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-27Bitstream added on 2014-06-13T20:59:44Z : No. of bitstreams: 1 guimaraes_ff_me_botfmvz.pdf: 668649 bytes, checksum: 605a29631d65d4e6c7ea318a710ab952 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Alguns dos agentes patogênicos de mastite bovina são relevantes em relação à qualidade do leite, bem como, para a saúde pública. Foram estudadas dez fazendas localizadas em cinco regiões do estado de São Paulo. Foram examinadas 1.148 vacas, correspondentes a 4.592 glândulas mamárias avaliadas pelos testes de tamis e CMT. Foram colhidas 1.318 amostras de leite, das vacas positivas na triagem para avaliação microbiológica e contagem de células somáticas (CCS). A frequência dos agentes variou de 0,3 a 36,4%. Do total de isolados de Staphylococcus spp (36,4%), 48,7% corresponderam a estafilococos coagulase negativa (SCN), 34,2% S. aureus e 15,9% outros estafilococos coagulase positiva (SCP). Streptococcus spp foram isolados de 23,3% das amostras, dos quais 41,7% Streptococcus. agalactiae, 41,1% Streptococcus dysgalactiae e 17,3% Streptococcus uberis. Corynebacterium spp. foram isolados em 31,8% dos casos de mastite. As amostras de leite das glândulas mamárias infectadas apresentaram CCS significativamente mais elevada que as negativas. Dos 48,7% de SCN foram identificadas 18 espécies: S. warneri, S. epidermidis, S. hyicus, S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares, S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. saccharolyticus, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri e S. chromogenes. As fazendas, II (27,3%) e III (26,7%) apresentaram maior frequência de SCN, enquanto as fazendas I (13,3%) e X (44,4%) revelaram maior prevalência de SCP sendo as diferenças significantes. Foram avaliados por PCR 263 estafilococos para detecção de gene codificadores das enterotoxinas clássicas. Entre os SCN foram detectados: sea (35,5%) seb (7,1%), sec (6,5%), sed (1,8%) e associações destes genes. Em SCP foram detectados: sea (9,5%) seb (4,4%)... / The purpose of this study was to assess the occurrence of mastitis cases in ten Brazilian dairy herds located in five regions in São Paulo state, to characterize the main etiological agents and, to proceed staphylococcal isolates identification to species level, to perform detection by PCR assays of enterotoxin encoded genes aiming the awareness of their potential capability in producing the classical enterotoxins and, mecA a methicilin resistance gene and, evaluated resistance toward antimicrobials. A total of 4,592 mammary glands of 1,148 dairy cows were examined by strip cup and CMT. From these 1,318 milk samples were collected for microbiological exams. It was isolated 263 (19.9%) staphylococci from mastitis cases and they were identified, as being: S.aureus (34.2%), other CPS (15.9%) respectively, S. intermedius (15.2%), S.hyicus(12.9%) and, S. schleiferi subsp coagulans(3.8%), and CNS (48.7%). Among these 128 CNS isolates eighteen species were identified: S. xylosus, S. haemolyticus, S. auriculares; S. cohnii subsp cohnii, S. lugdunensis, S. pasteuri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus subsp bovis, S. schleiferi subsp scheleiferi, S. simulans, S. capitis, S. saprophyticus subsp saprophyticus, S. sciuri subsp sciuri and, S. chromogenes. The more frequently isolated species were: S.warneri (31.3%), S. epidermidis (14.8%) and S.hyicus (12.5%). The milk samples from infected mammary glands showed higher CCS than the negatives. PCR assay was used to determine the presence of classical enterotoxin codifying genes (sea, seb, sec and sed). Among CNS the occurrence of enterotoxin classical genes was determined as: 35.1% for sea, 7.1% for seb, 6.5% for sec, 1.8% for sed) 5.3% for both sea and seb, 3.6% for both sea, sec and sed, 1.8% for both sec and sed. Whereas among CPS isolates the occurrence of enterotoxin... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luis Manuel Medina Canalejo / Banca: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Resumo: Foi realizado o estudo epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do Queijo Tipo Minas Frescal em uma micro-usina no Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras, as quais foram colhidas do leite cru e pasteurizado, mãos do manipulador, queijo embalado para consumo e diversos pontos do fluxograma de seu processamento. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de genes codificadores das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1, foram realizadas a partir da amplificação dos fragmentos de DNA genômico específico. Entre as 41 (29,3,4%) das estirpes confirmadas como sendo S. aureus, 25 (61%) mostraram-se positivas na pesquisa de genes codificadores de toxinas estafilocócicas. Os pontos de maior frequência de estirpes de S. aureus toxigênico foram as mãos do manipulador (16,0%), o leite cru do tanque de recepção (12,0%), o leite pasteurizado (12,0%) e o Queijo Tipo Minas Frescal pronto para consumo (12,0%). O gene codificador de enterotoxina de maior frequência identificada foi o sea. Na determinação do potencial toxigênico das estirpes com genes codificadores de enterotoxinas por imunodifusão, apenas uma estirpe isolada da superfície interna do tanque de estocagem do leite cru foi produtora da enterotoxina SEC. Houve variabilidade genética entre as 41 estirpes de S. aureus isoladas, uma vez que foram identificados 22 pulsotipos diferentes pelo PFGE. Os resultados obtidos permitem a adoção de medidas para a melhoria do processamento do Queijo Tipo Minas Frescal de modo a reduzir o risco potencial que estas toxinas podem representar para a saúde da população consumidora deste produto / Abstract: We performed molecular epidemiological study of strains of Staphylococcus aureus isolated toxigenic potential in the process of producing the Frescal Minas Type Cheese in a micro-mill in State of São Paulo. For this, six samples were taken during the period June 2008 to July 2009 in order to make a total of 140 samples, which were collected raw and pasteurized milk, the handler's hands, cheese packaged for consumption and different points flowchart of processing. Confirmation of the molecular species of the isolates and the presence of genes encoding enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin, were made from the amplification of specific fragments of genomic DNA. Among the 41 (29.3%) of strains confirmed as S. aureus, 25 (61%) were positive in the research of genes encoding staphylococcal toxins. Points higher frequency of toxigenic strains of S. aureus were the hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk (12.0%) and Frescal Minas Type Cheese ready for consumption (12.0%). The gene encoding enterotoxin most frequently identified was the sea. In determining the potential toxigenic strains with genes encoding enterotoxins by immunodiffusion, only one strain isolated from the inside surface of the storage tank of raw milk was the producer of enterotoxin SEC. There was genetic variability among the 41 strains of S. aureus isolated, since they were identified by 22 different PFGE pulsotypes. The results obtained allow the adoption of measures to improve the processing of Frescal Minas Type Cheese to reduce the potential risk that these toxins can pose to the health of consumers of this product / Doutor

Os produtos de origem animal, produzidos em indústrias brasileiras e inspecionados pelo Serviço de Inspeção Federal, passam por diversos controles, em todas as etapas do seu processamento. Após a industrialização, são submetidos a análises em laboratórios oficiais, para verificação do cumprimento de parâmetros que os definem como aceitáveis ao consumo e isentos de risco. Uma das análises realizadas rotineiramente é a enumeração de Staphylococcus aureus (S. aureus). Este microrganismo possui um risco associado a sua presença em grande número, pois alguns deles têm a capacidade de produzir, sob determinadas condições, enterotoxinas termoestáveis, que, ao serem ingeridas, juntamente com o alimento, produzem uma enfermidade. A proposta deste trabalho foi estudar a distribuição das cepas de S. aureus isoladas de amostras de produtos de origem animal das regiões sul, sudeste, norte e nordeste do Brasil e caracterizá-las, com objetivo de estimar riscos de transmissão, através dos alimentos, de cepas resistentes aos antimicrobianos normalmente utilizados em tratamentos de infecções estafilocócicas e investigar a capacidade destas de produzirem as chamadas "enterotoxinas clássicas" (SEA, SEB, SEC, SED e SEE). Os isolados bacterianos foram originários de 3.748 amostras de diversos produtos de origem animal, que foram analisadas em laboratórios oficiais do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), no período de 2003 e 2004. Duzentos e quarenta e cinco cepas de S. aureus, com diversas quantificações, foram isoladas e caracterizadas fenotipicamente, através de critérios estabelecidos como padrões nas análises do MAPA e através de outros complementares, para certificação de que se tratavam mesmo de S. aureus. Os isolados obtidos foram submetidos ao ensaio imunoenzimático automatizado (ELFA - Enzyme-linked Fluorescent Assay - VIDAS®Staph enterotoxin II SET2), para detectar a capacidade de produzirem quantidades detectáveis das cinco enterotoxinas clássicas (SEs). Entre os isolados positivos no ensaio imunoenzimático, determinou-se a freqüência de amplificação, pela Reação em Cadeia da Polimerase, de cada um dos genes respectivos (sea, seb, sec, sed e see). Posteriormente, foi realizado estudo das resistências dos isolados de S. aureus frente a 17 antimicrobianos de importância clínica, pelo método da difusão em ágar. Os isolados foram agrupados de acordo com os perfis de amplificação dos genes das enterotoxinas e pelos perfis de resistência aos antimicrobianos, correlacionando-os com os tipos de alimentos e as regiões nas quais foram encontrados. Oitenta e um isolados produziram quantidades detectáveis de enterotoxinas. Os genes mais freqüentemente encontrados foram o seb e o sec-1 (ambos com 76,54%), seguidos do sea (61,73%). Apenas quatro dos isolados produtores de enterotoxinas clássicas (três originários de queijo de coalho e um de bacon) apresentaram contagens >105. Em cinqüenta e nove cepas (72,84%) houve amplificação de múltiplos genes que codificam enterotoxinas (A-E). Com relação às 81 cepas que produziram enterotoxinas em caldo de cultivo, observou-se que 63 (77,8%) eram provenientes de produtos cárneos, 11 (13,6%) de produtos lácteos, três (3,7%) de pescados e quatro (4,9%) de outros produtos de origem animal. Cinco eram da região norte, quatro da região nordeste, 19 da região sul e 53 da região sudeste. O grupo formado pelo perfil sea, seb e sec combinados foi o mais freqüente, com 33 isolados. Vinte e seis cepas deste grupo eram originárias da região sudeste, cinco da região norte e dois da região sul. Oitenta e oito cepas não apresentaram nenhuma resistência aos antimicrobianos testados. As resistências mais freqüentes foram frente à penicilina, norfloxacina, canamicina e tetraciclina. Foram formados 64 perfis diferentes de resistência. O perfil mais freqüente foi resistência à penicilina, unicamente, seguido de resistência à penicilina/canamicina. A partir dos resultados deste trabalho, pode-se concluir que o risco de estarem presentes enterotoxinas nos alimentos de origem animal que passam por processos de industrialização controlados e acompanhados pelo Serviço Oficial de Inspeção brasileiro é muito baixo, (somente quatro das 3.748 amostras) Entretanto, uma vez que foram detectados diversos perfis de resistência a antimicrobianos nos isolados de Staphylococcus aureus obtidos, a possibilidade de veiculação e disseminação dessas cepas resistentes, através de alimentos de origem animal, pode existir e deve ser monitorada. / Food from animal origin produced at Brazilian industries and inspected by the Federal Inspection Service suffer many controls in all stages of their processing. After the industrialization, they are tested in official laboratories for verification of the parameters which define them as acceptable for consumption and free of risk. One of the tests routinely carried out is the Staphylococcus aureus (S. aureus) enumeration. These microorganism have a risk associated with their presence in large numbers. Some of them have the capacity to produce, under certain conditions, heat-stable staphylococcal toxins. If they are ingested with food, they will produce foodborne disease. The aim of this report was to study the distribution and feature of S. aureus strains isolated from food animal origin products, in order to estimate risks of transmission of resistant strains to antibiotics commonly used in treatment of staphylococcal infections through food and to investigate their ability to produce so-called "classical enterotoxins" (SEA, SEB, SEC, SED and SEE). The food samples tested were from different regions of Brazil (south, southest, north and northeast). From a total of 3,748 food samples, analized in official laboratories from Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA) between 2003 and 2004, 245 presented different counts of S. aureus. They were isolated and characterized phenotypically, using analysis criteria established by the MAPA and through others complementary tests, for guarantee that they are really S. aureus. The isolates were submited to automated immunoassay method (Enzyme-Linked Fluorescent Assay - VIDAS®Staph enterotoxin II SET2) for detection of the strains ability to produce detectable quantities of the five classical enterotoxins (SEs). Among the positive strains in enzyme immunoassay, it was determinate the frequency of amplification, by Polymerase Chain Reaction (PCR), of each of the respective genes (sea, seb, sec-1, sed and see). Subsequently, it was studied S. aureus resistance, by the diffusion in agar method, to 17 clinical importance antimicrobials. The strains were grouped according to the enterotoxin genes and the antimicrobial resistance profiles, correlating them with the types of food and regions which they have been found. Eighty-one strains produced detectable amounts of enterotoxins. The most frequent genes found in those strains were seb and sec-1 (both with 76.54%), followed by sea (61.73%). Only four enterotoxin producer strains presented counts >105 (three samples of Brazilian cottage-like cheese - "queijo de coalho", and one sample of bacon). In 59 isolates (72.84%) it was observed an amplification of multiple genes encoding enterotoxins (A-E). In relation to the 81 strains that produced enterotoxins in culture broth, we observed that 63 (77.8%) came from meat products, 11 (13.6%) were samples of milk products, three (3.7%) were fish, and four (4.9%) were others products of animal origin. Five samples were from the North, four from the Northeast, 19 from the South and 53 from the Southeast region of Brazil. The most frequent profile was found in 33 strains, and was composed by sea, seb, and sec genes. Twenty-six strains of this group were from Sutheast, five from North and two from South Region. Eighty-eight strains did not show any resistance to antimicrobial tested. The highest resistance frequency was observed against penicillin, norfloxacin, kanamycin and tetracycline. Sixty four different resistance profiles could be identified. The profile resistance to penicillin, follow by the profile to penicillin/kanamycin, were the most prevalent. From these results, it is possible to conclude that the risk of having pre-formed enterotoxins in animal derived food items that go through an industrial process, controlled by the Brazilian Official Inspection Service, is very low (only four of 3,748 samples). However, the identification of resistance profiles was detected in S. aureus strains. The possibility of transmission and distribution of these resistant strains through food of animal origin can exist and should be monitored.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-21T15:37:36Z No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista.pdf: 835746 bytes, checksum: b0b2b877160378bd92adbf49b27783c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T15:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista.pdf: 835746 bytes, checksum: b0b2b877160378bd92adbf49b27783c3 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The species Anomalocardia brasiliana is found in abundance on the beaches of the Brazilian coast and much appreciated in Northeastern cuisine. This study aimed to characterize molecular enterotoxins and resistance gene mecA in Staphylococcus spp. isolates of coagulase-negative beef samples A. brasiliana in the metropolitan area of Recife, Brazil. Isolated from fresh samples (n = 9), collected in the resort of Mangue Seco, Igarassu-PE, were identified as Staphylococcus xylosus (4/9), Staphylococcus cohnii spp. urealyticus (4/9) and Staphylococcus sciuri (1/9). Among commercialized samples (n = 21) were identified Staphylococcus sciuri (16/21), Staphylococcus xylosus (4/21) and Staphylococcus lentus (1/21). The determination of antibiotic resistance profile was performed following the CLSI guidelines. The highest rates of resistance were observed in isolates from fresh samples against erythromycin (58.53%), penicillin (51.21%) and tetracycline (43.9%). Isolated from samples marketed presented greater resistance to oxacillin (55.3%) and penicillin (36.8%). All isolates were characterized as coagulase-negative and were resistant to oxacillin and / or cefoxitin and positive for the presence of mecA gene but phenotypically susceptible to vancomycin. Also, the genes for enterotoxins seg and seh were detected in 77,7% and 88,8% of isolates from environmental samples, versus 90.5% and 100% of the isolates of real samples, respectively. The results of this study reveal the presence of Staphylococcus coagulase-negative methicillin-resistant carriers of toxigenic genes in bivalve mollusk A. brasiliana. This is first report of Staphylococcus coagulase-negative methicillin-resistant bivalve mollusk in A. brasiliana. / A espécie Anomalocardia brasiliana é encontrada em abundância nas praias da costa brasileira e bastante apreciada na culinária nordestina. Neste estudo, objetivou-se a caracterização molecular de enterotoxinas e do gene de resistência mecA de Staphylococcus spp. coagulase-negativos isolados de amostras da carne de A. brasiliana na região metropolitana do Recife, Brasil. Isolados de amostras in natura (n=9), coletados no balneário de Mangue Seco, Igarassu-PE, foram identificados como Staphylococcus xylosus (4/9), Staphylococcus cohnii spp. urealyticus (4/9) e Staphylococcus sciuri (1/9). Dentre amostras comercializadas (n=21), foram identificados Staphylococcus sciuri (16/21), Staphylococcus xylosus (4/21) e Staphylococcus lentus (1/21). A determinação do perfil de resistência a antibióticos foi realizada seguindo orientações do CLSI. Os maiores índices de resistência foram observados em isolados de amostras in natura contra eritromicina (58,53%), penicilina (51,21%) e tetraciclina (43,9%). Isolados de amostras comercializadas apresentaram maior percentual de resistência à oxacilina (55,3%) e penicilina (36,8%). Todos os isolados foram caracterizados como coagulase-negativos e foram resistentes à oxacilina e/ou cefoxitina e positivos para a presença do gene mecA, mas sensíveis fenotipicamente à vancomicina. Ainda, os genes das enterotoxinas seg e seh foram detectados em 77,7 % e 88,8% dos isolados de amostras ambientais, contra 90,5% e 100% dos isolados de amostras comercializadas, respectivamente. Os resultados obtidos nesse estudo revelam a presença de Staphylococcus coagulase-negativos resistentes à meticilina portadores de genes toxigênicos no molusco bivalve A. brasiliana. Este é primeiro relato de Staphylococcus coagulase-negativos resistentes à meticilina no molusco bivalve A. brasiliana.

Orientador: José Luiz Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_IsabelaMateus_M.pdf: 18364444 bytes, checksum: 31989d921c63b7a58bff34af51349106 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Staphylococcus são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais suas principais fontes. A contaminação cruzada após a pasteurização do leite, especialmente por manipulação inadequada, é apontada como a mais importante forma de contaminação dos derivados do leite por estes patógenos, que são importantes em alimentos devido à sua habilidade de produzir uma grande quantidade de proteínas extracelulares (enterotoxinas) que, se pré-formadas no alimento e ingeridas, causam a intoxicação estafilocócica. Apesar da legislação brasileira (RDC 12/2001, Anvisa) preconizar apenas a contagem de Staphylococcus coagulase positiva, relacionando a produção da coagulase com o risco de produção de enterotoxinas, já foi comprovado que espécies coagulase negativas também são capazes de produzir enterotoxinas nos alimentos. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: i) quantificar e analisar a presença de Staphylococcus coagulase positiva e negativa em 104 amostras de derivados lácteos, sendo 24 de sorvete artesanal, 20 de creme de leite pasteurizado, 20 de patê à base de queijo, 20 de queijo Minas frescal e 20 de queijo Minas meia cura; ii) identificar fenotipicamente as espécies isoladas; iii) avaliar a produção de enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE) in vitro pelo sistema VIDAS e relacionar os resultados obtidos com a presença de possíveis genes codificadores destas enterotoxinas, pela aplicação da técnica de PCR. Os valores médios de contagens preliminares nos diferentes grupos de alimentos analisados foram: 5 x 103 UFC/g em sorvete, 2,9 x 105 UFC/g em creme de leite, 6,2 x 103 UFC/g em patê, 6,6 x 105 UFC/g em queijo Minas frescal e 6,4 x 105 UFC/g em queijo Minas meia cura. Do total de isolados, 83,6% (148/177) foram classificados como sendo do gênero Staphylococcus e 16,4% (29/177) como Micrococcus. Staphylococcus foram isolados de 43,3% (45/104) das amostras, sendo detectados em 25 amostras de queijos, em 16 sorvetes, em 3 patês e em apenas 1 amostra de creme de leite. Entre os isolados de Staphylococcus, 74,3% (110/148) eram coagulase negativa e 25,7% (38/148) eram coagulase positiva recuperados apenas nas amostras de queijos. Dos 111 isolados selecionados (27 coagulase positiva e 84 coagulase negativa), foram identificadas 13 espécies através do sistema API-Staph (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas clássicas, foi utilizado o kit (bioMérieux-SA). Dos?imunoenzimático ViDAS SET ¿Staph enterotoxin¿ 111 isolados, apenas um (0,9%) produziu enterotoxina, sendo este identificado como S. aureus, coagulase positiva, isolado a partir de queijo Minas meia cura, cuja contagem foi de 1,9 x 106 UFC/g. Ao contrário do esperado, não foram detectados genes codificadores das 5 enterotoxinas em nunhum dos isolados analisados. Discrepâncias entre resultados de testes fenotípicos e genotípicos para detecção de enterotoxinas são comuns, sendo necessária a realização de outros testes imunológicos e moleculares para confirmação destes resultados. Possíveis justificativas seriam a existência de variações nas sequências dos genes do isolado ou a presença de uma toxina que possui reação imunológica cruzada com as enterotoxinas clássicas. Neste estudo, apesar da quase totalidade dos isolados não terem produzido enterotoxinas clássicas, havia um número bem elevado de Staphylococcus em diversos produtos analisados, não excluindo um possível risco de produção das demais enterotoxinas já descritas e demonstrando a falta de cuidados higiênico-sanitários e de boas práticas durante a produção e comercialização destes alimentos / Abstract: Staphylococcus are microorganisms widespread in nature and humans and animals are their main sources. Cross-contamination after milk pasteurization, caused especially by improper handling, is considered the most recurrent source of dairy products contamination by these pathogens. Staphylococus deserves our close attention due their ability to produce a large amount of extracellular proteins (enterotoxins), that if preformed in food and ingested, cause staphylococcal food poisoning. Although the Brazilian legislation (RDC 12/2001, Anvisa) only recommends coagulase-positive staphylococci count monitoring (relating coagulase production to the risk of enterotoxins production), previous researches showed that coagulase-negative species are also capable of producing enterotoxins in foods. Thus, this research aimed: i) to quantify and analyze the presence of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci from 104 dairy products samples, being: 24 homemade ice cream, 20 pasteurized dairy cream, 20 cheese pate, 20 Minas fresh cheese, and 20 Minas half cured cheese; ii) to identify phenotypically the species; iii) to evaluate the production of classic enterotoxins (SEA, SEB, Sec1, 2.3, SED and SEE) in vitro by using VIDAS system and correlate the results to the presence of possible coding genes of these enterotoxins, applying the PCR technique. The average staphylococcal preliminary count values in different food groups analyzed were: 5 x 103 CFU/g in ice cream, 2,9 x 105 CFU/g in dairy cream, 6,2 x 103 CFU/g in pate, 6,6 x 105 CFU/g in Minas fresh cheese and 6,4 x 105 CFU/g in Minas half cured cheese. From isolated strains, 83,6% (148/177) were classified as genus Staphylococcus and 16,4% (29/177) as Micrococcus. Staphylococcus were isolated from 43,3% (45/104) of samples, being found in 25 cheese samples, in 16 ice creams, in 3 pates and in just one dairy cream sample. Among staphylococcal strains, 74,3% (110/148) were coagulase-negative Staphylococcus and 25,7% (38/148) were coagulase-positive Staphylococcus, being these recovered only from cheeses samples. On 111 selected isolates (27 coagulase-positive and 84 coagulase-negative), were identified 13 staphylococcal species by using API-Staph system (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. For classical staphylococcal enterotoxins detection was used VIDAS SET Staph- Enterotoxin immunoassay kit (bioMérieux-SA). From 111 isolates, just one (0,9%) produced enterotoxin, which was identified as S. aureus, coagulasepositive, isolated from Minas half cured cheese, whose count was 1,9 x 106 CFU/g. Contrary to expectations, no coding genes were present in isolates analyzed. Discrepancies between phenotypic and genotypic results of enterotoxin detection tests are common, requiring the application of other immunological and molecular tests for the confirmation of the results. Possible explanations would be that there are genes sequences variations or another enterotoxin that has immunological cross-reaction with classic enterotoxins. For this research, although the higher number of the isolates did not produce classical enterotoxins, the analyzed samples showed high staphylococcal concentration, that do not exclude a newly described enterotoxins risk production. It also demonstrates the lack of hygiene, health care and good practices during the production and commercialization of dairy products / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Arnaldo Yoshiteru Kuaye / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-05T22:35:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esper_LucianaMariaRamires_M.pdf: 799385 bytes, checksum: 87dd89627de1603ab2c21bcb0f84f8aa (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A ricota é um tipo de queijo fresco, de origem italiana, obtido pela precipitação das proteínas do soro do queijo, por acidificação associada ao calor, cuja produção aumenta a cada ano, justificado em parte pela procura por alimentos mais saudáveis e de baixo valor calórico. O teor de umidade, em geral de 70%, caracteriza a ricota como sendo um alimento de muito alta umidade, o que a torna bastante susceptível à contaminação microbiana, podendo ocasionar doenças de origem alimentar, mesmo sendo submetida à refrigeração. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar a qualidade microbiológica e parâmetros físicoquímicos de amostras de ricotas comercializadas no município de Campinas-S.P. A conformidade das informações nutricionais declaradas nos rótulos, com o estabelecido pela RDC nº 360/2003 da ANVISA foi avaliada. Para qualidade microbiológica foi utilizada como referência a Resolução da Diretoria Colegiada nº 12/2001 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, além de pesquisas complementares como a contagem de bolores e leveduras, Bacillus cereus mesófilos e psicrotróficos e sua capacidade de produção de toxinas, a presença de enterotoxinas estafilocócicas na ricota e a produção destas por cepas isoladas de estafilococos, e os fatores de virulência de Listeria monocytogenes isoladas das amostras.Os resultados das análises físico-químicas demonstraram grande variabilidade em todos os parâmetros avaliados entre as amostras e marcas. Particularmente em relação à gordura, segundo a Portaria nº 146/96 do Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária, 8,89% das amostras seriam classificados como queijo magro, 42,22% queijo semi- gordo, 40,00% queijo gordo e 8,89% como queijo extra- gordo. Na maioria dos rótulos as informações nutricionais se apresentavam em desacordo com a legislação (> ±20% de tolerância) sendo 60% em relação à proteína, 60% em relação ao valor energético total e 66,7% em relação à gordura. Estes resultados enfatizam a necessidade do estabelecimento de padrões de identidade para melhor controle da qualidade do produto e segurança do consumidor. Os resultados das análises microbiológicas demonstraram que 46,7% das amostras estavam em desacordo com o padrão estabelecido pela RDC nº 12/2001.O número de amostras acima do permitido pela legislação em relação a coliformes termotolerantes foi de 46,7%, estafilococos coagulase positiva, 2,2% e Listeria monocytogenes, 6,7% . Não foi isolada Salmonella em nenhuma das amostras. Além dos critérios microbiológicos exigidos pela legislação uma avaliação complementar mostrou que 51,1% da amostras estavam contaminadas por B.cereus, sendo que 28,9% com contagens na faixa de 104 a 106 UFC/g; 47,5% contaminadas por bolores e 97,5% por leveduras ambas com elevado nível de contaminação. Embora não tenha sido detectada a presença de toxinas estafilocócicas nas ricotas, 23,64% dos isolados de estafilococos eram produtores de toxinas. Destes, 69,23% eram estafilococos coagulase negativa e 30,77% estafilococos coagulase positiva, evidenciando a importância dos estafilococos coagulase negativa. Quanto ao potencial enterotoxigênico de B. cereus, 85,7% (36/45) dos isolados analisados, foram positivos para o Kit BDE-VIA. Foram identificados 11 perfis toxigênicos na pesquisa de genes codificadores de enteroroxinas pela técnica de PCR, atestando o alto potencial enterotoxigênico dos isolados de B.cereus. Na avaliação da patogenecidade dos isolados de Listeria monocytogenes, 100% apresentaram o gene actA do tipo 4 e hly do tipo 1, classificados portanto, como linhagem do tipo I, esta linhagem encontrada na maior parte dos surtos e casos de listeriose em humanos. O presente trabalho revela que a ricota deveria merecer maior atenção por parte da comunidade científica, setor produtivo e órgãos de vigilância sanitária visando a melhoria da qualidade e conseqüente segurança do consumidor tendo em vista o seu consumo crescente e utilização em dietas especiais / Abstract: Ricotta is a soft white cheese, of Italian origin, obtained from the precipitation of proteins from the whey of cheese through heating associated with acidification. The production of ricotta cheese increases every year, thanks to the widespread search for healthier foods with low caloric value. Ricotta cheese is characterized by its high moisture content (70% in general), which makes it susceptible to microbiological contamination and therefore able to cause food poisoning, even when stored under refrigeration. This work evaluates the microbiological quality and some physical-chemical parameters (pH, titratable acidity, moisture, protein, fat, salt and ash) of commercial samples of ricotta cheese at the local market of Campinas city, in the state of Sao Paulo, Brazil. We have first evaluated the compliance of the nutritional information in labels with that established by the applicable regulation RDC nº 360/2003 of ANVISA and the variation between values declared in the labels and those obtained through laboratorial analyses. In order to determine microbiological quality, the standard RDC nº12/2001 from ANVISA was used as reference, as well as complementary research, including the counting of mold, yeast, mesophilic and psycrotrophic Bacillus cereus and their potential enterotoxin production capacity. In addtion, the presence of staphylococcal enterotoxin in ricotta and the production of enterotoxin by isolated strains of staphylococci, and also the virulence factors of Listeria monocytogenes strains isolated from the samples. The physical-chemical analyses resulted in great variability among the samples of ricotta cheese for all the parameters evaluated. Particularly regarding fat, according to regulation Portaria nº146/96 of MAARA, 8.89% of the samples would be considered fat-free cheese, 42.22% low-fat cheese, 40.00% high-fat cheese and 8.89% as extra high-fat cheese. In most of the labels the nutritional information failed to comply with the regulation (over ±20% tolerance): 60% regarding protein content, 60% regarding total energetic value and 66.7% regarding fat content. Such results stress the need for identity standards to improve quality control of the product and consumer safety. According to the results of the microbiological analyses, 46.7% of the samples failed to meet the standards established by the RDC nº 12/2001 regulation. A great deal of the samples had microbiological content above the levels allowed by the regulation: 46,7%, for thermotolerant coliforms, 2.2% for coagulase-positive staphylococci, and 6,7% for Listeria monocytogenes. Salmonella was not isolated in any of the samples. Besides the microbiological criteria required by the regulation, a complementary evaluation showed that 51.1% of the samples were contaminated by B. cereus, being that 28.9% with countings in the band 104 to 106 UFC/g; also, 47.5% of the samples were contaminated by mold and 97.5% by yeast, both at high contamination levels. Although the presence of staphylococcal enterotoxins was not detected in the ricotta analyzed, 23.64% of the staphylococci isolated strains were toxin producers. Out of these, 69,23 % were coagulase-negative staphylococci and only 30.77% were coagulase-positive staphylococci, what demonstrates the importance of the coagulase-negative staphylococci strains. As for the enterotoxigenic potential of B. cereus, 85.7% (36/45) of the isolated B. cereus strains analyzed were positive for the BDE-VIA Kit. PCR technique was applied to enteroroxin code genes and identified 11 toxigenic profiles, what demonstrates the high enterotoxigenic potential of the isolated B. cereus strains. In the assessment of the pathogenic potential of isolated L. monocytogenes strains, 100% presented the genes actA type 4 and hly type 1, therefore lineage I was found in most of the outbreaks and isolated cases of listeriosis in human beings. This work points out that ricotta cheese should be given greater attention by the scientific community, the productive sector and the food safety agencies aiming at the improvement of the quality of the product and therefore the security of the consumer, inasmuch as ricotta cheese has been increasingly consumed and used in special diets / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niemann_FernandaSoares_M.pdf: 1512099 bytes, checksum: db41f8402852d861b0bf574aeef40677 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Estudos das propriedades de virulência de Escherichia coli associadas às infecções intestinais são importantes para compreender seus mecanismos diarreiogênicos. Em um trabalho anterior, realizado em nosso laboratório descrevemos um fator de virulência no sobrenadante de E. coli isoladas de água de consumo na cidade de Ouro Preto, MG, com atividades enterotóxica e citotóxica. Este fator foi denominado enterotoxina termo-estável ST-like (ST-L). A ST-L foi purificada a partir dos sobrenadantes de cultura de amostras de E.coli cultivadas em meio CAYE modificado, fracionado com sulfato de amônio e por ultrafiltração e concentrado por liofilização. Este material foi submetido às cromatografias de exclusão molecular e fase reversa, em sistema HPLC. A ST-L purificada mostrou, pela análise eletroforética em 2D, ponto isoelétrico (pI) em 6,19 e massa molecular de aproximadamente 2kDa. A atividade biológica pelos tratamentos com enzimas tripsina, proteinase K, ribonuclease ou pepsina. A citotoxicidade da ST-L manteve-se inalterada sob variações de pH (3 a 9) e tratamento com solventes orgânicos. A toxina resistiu ao aquecimento à 100ºC mostrando ser termoestável. A caracterização biológica da ST-L mostrou que várias linhagens celulares foram sensíveis aos seus efeitos citotóxicos, sofrendo alterações celulares e nucleares, em até 24h, com a formação de vacúolos citoplasmáticos e morte celular, conforme verificado pelos testes de viabilidade celular dos lisossomos, mitocôndrias, membranas celulares e quantificação da população celular das linhagens HEp-2, Vero, CaCo-2 e HT-29. A ST-L não induziu acúmulo de fluídos no teste de alça ligada em intestino de coelhos induzindo, contudo, acúmulo de fluidos intestinais no teste de camundongos recém-nascidos (Dean). Foi possível determinar que a toxina STL encontra-se codificada num plasmídeo e apresenta uma região conservada de alta similaridade com estA2, o que justifica a presença de efeito enterotóxico no teste de Dean. No entanto, não foi possível determinar a região ativa para a atividade citotóxica da ST-L. Em função das características apresentadas sugere-se a toxina ST-L seja uma variante do grupo das enterotoxinas termoestáveis (ST) com atividade citotóxica produzida por E. coli diarreiogênicas. / Abstratc: Studies on the virulence properties of Escherichia coli associated with intestinal infections are important for the understanding of diarrheic diseases mechanisms. In a previous work we have described a factor presenting enterotoxic and cytotoxic activities in the culture supernatants of E. coli isolated from drinking water in the city of Ouro Preto, MG. This factor was called as thermo stable enterotoxin - like (ST-L) and it was purified from cultured supernatants produced with modified CAYE medium, fractionated with ammonium sulfate, being subsequently ultrafiltrated, subjected to molecular exclusion chromatography and then to reversed-phase chromatography in HPLC-system. The ST-L showed to be pure by the electrophoretic analysis in the bidimensionl electrophoresis (2D), being the isoelectric point (pI) of 6.19 and the molecular mass of approximately 2kDa. The toxin can not be inactivated by enzimes like trypsin, proteinase K, ribonuclease or pepsin. The cytotoxic activity of ST-L does not change whith pH variations (3 - 9), does not change after treatment with organic solvents and resists heating treatments of 100°C showing it to be heat-stable. Biological characterization of the toxin showed, through the tests of cell viability with the ST-L, that several cell lines were sensitive to the cytotoxin action, with major cellular and nuclear changes observed within 24 hour assays, presenting cytoplasmic vacuoles and cell death, what was verified by tests of cell viability of lysosomes, mitochondria, cell membranes and quantification of the cell population on cell lines like HEp-2, Vero, CaCo-2 and HT-29. The rabbits ileal intestinal loop tests, performed with the ST-L, did not show positive results, but the toxin acts by inducing intestinal fluid accumulation into the newborn mice test (Dean). Through molecular characterization tests, we found that the gene enconding for the toxin ST-L is in a plasmid and has a conserved region with high similarity to estA2, what justifies the presence of the positive enterotoxic result in the Dean test. However, it was not possible to determine the fragment responsible for cytotoxic activity of ST-L. According to the characteristics presented we suggest that the toxin-ST-L is a variant group of the heat-stable enterotoxin (ST) with cytotoxic activity produced by the diarrheagenic E. coli. / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-07-03T15:08:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marcos César Fernandes Pessoa.pdf: 6006738 bytes, checksum: 6bf14f8b1d3cb3d2908ac7e37e22c668 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T15:51:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marcos César Fernandes Pessoa.pdf: 6006738 bytes, checksum: 6bf14f8b1d3cb3d2908ac7e37e22c668 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T15:56:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marcos César Fernandes Pessoa.pdf: 6006738 bytes, checksum: 6bf14f8b1d3cb3d2908ac7e37e22c668 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-13T15:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Marcos César Fernandes Pessoa.pdf: 6006738 bytes, checksum: 6bf14f8b1d3cb3d2908ac7e37e22c668 (MD5) Previous issue date: 2009-07-15 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium commonly used in the tropical disease vectors and agriculture pragues control. Despite of its use both agriculture and human health, this bacterium can be enterotoxins producer that are also present in a few Bacillus cereus strains, emphasizing the non-haemolytic enterotoxin (NHE), haemolysin BL (HBL) and enterotoxin T (BceT) that have been related to food poisoning outbreaks reported in the literature. Thereby, this work had as a purpose to identify and to realize a genotypic characterization of these enterotoxins in one hundred B. thuringiensis strains isolated in the Amazon State, as well as to achieve the sequencing of these enterotoxin genes starting from the product of Polymerase Chain Reaction (PCR). The prevalence of these enterotoxin genes in B. thuringiensis strains by PCR method was relatively high, of which the results for the seven genes researched (bceT, hblA, hblD, hblC, nheA, nheB and nheC) showed different between themselves. By the genotypic profile were determined 27 groups and was evidenciated that 41% of the strains were positives for all the enterotoxin genes, whereas 3% were negatives for all the genes studied.. The analysis of the nucleotides and amino acids sequences of the Amazonian B. thuringiensis strains identified similarities with the nucleotides and amino acids sequences that are deposited in the GenBank and EMBL databases. / Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva comumente utilizada no controle de vetores de doenças tropicais e pragas da agricultura. Apesar de seu uso tanto na agricultura quanto em saúde humana, esta bactéria pode ser produtora de enterotoxinas que estão presentes também em algumas linhagens de Bacillus cereus, destacando-se a enterotoxina não-hemolítica (NHE), a hemolisina BL (HBL) e a enterotoxina T (BceT), que têm sido relacionadas a surtos de intoxicação alimentar relatados na literatura. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar genotipicamente estas enterotoxinas em 100 linhagens de B. thuringiensis isoladas no Estado do Amazonas, bem como realizar o seqüenciamento destes genes de enterotoxinas a partir do produto da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). A prevalência dos genes destas enterotoxinas nas estirpes de B. thuringiensis pelo método de PCR foi relativamente alta, cujos resultados para os sete genes pesquisados (bceT, hblA, hblD, hblC, nheA, nheB e nheC) mostraram-se distintos entre si. Pelo perfil genotípico foram determinados 27 grupos e ficou evidenciado que 41% das linhagens deram positivas para todos os genes de enterotoxinas, enquanto que 3% foram negativas para todos os genes estudados. A análise das sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das linhagens de B. thuringiensis amazônicas identificou similaridades com as sequências de nucleotídeos e aminoácidos que estão depositadas no banco de dados do GenBank/EMBL.