L'apoptose est un processus primordial pour le développement et le maintien des organismes eucaryotes. Elle est régulée à différents niveaux de l’expression génique. En fonction des stimuli intra- et extra-cellulaires, les facteurs de transcription régulent l'expression des protéines pro-survies et pro-apoptotiques. Ces facteurs de transcription facilitent la formation du complexe de pré-initiation (CPI) de la transcription pour activer la transcription. Le CPI est composé de l’ARN polymérase II et des facteurs généraux de transcription dont le facteur de reconnaissance du promoteur, TFIID. TFIID est un complexe multi-protéique composé de la protéine de liaison de la boîte TATA (TBP) et de 14 facteurs associés à TBP (TAFs) tel que TAF6 qui nous intéresse. TAF6 est exprimé sous 5 isoformes d'épissage alternatif (?, ?, ?, ð, ? ). TAF6? et TAF6ð sont deux entités antagonistes. Ils sont issus de l’épissage alternatif du deuxième exon de TAF6. Contrairement au variant majoritaire TAF6? qui a une activité oncogénique et antiapoptotique, le variant minoritaire TAF6ð est pro-apoptotique. À l’opposé de TAF6?, l’excision de la partie alternative du deuxième exon empêche la dimérisation de TAF6ð avec TAF9 dans TFIID (TFIID?). Les analyses de puce à ADN ont montré que l'impact sur le transcriptome de la perte de TAF6? est fortement distinct de l'impact causé par l'induction de l’isoforme pro-mort TAF6ð par des oligonucléotides antisens qui bascule l’épissage (SSO pour Splice site Switching Oligonucleotids). En outre, la déplétion du variant d'épissage majeur TAF6? aboutit à la perte de la viabilité des cellules. L'importance de l'induction de TAF6ð dans la mort cellulaire programmée et nos résultats précédents montrant que TAFð induit l’apoptose indépendamment de p53 dans de nombreux types de cellules cancéreuses, nous ont incités à entreprendre une dissection des éléments cis d'ARN qui contrôlent l'épissage du variant TAF6ð. Nous avons développé un système de minigène pour étudier les éléments cis d'ARN qui contrôlent l'expression de TAF6ð. Le minigène inclut la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 3) qui est dirigé par le promoteur CMV et il mime le patron d’épissage alternatif de TAF6? et TAF6ð endogène. Nous avons entrepris une analyse mutationnelle pour identifier les éléments cis de TARN pré-messager de TAF6. Nos données ont mis en évidence un site activateur d'épissage dans l’exon 2 constitutif. Dans l’intron, deux motifs polyC et polyG pourraient réguler l’épissage alternatif de TAF6ð. Ces motifs représentent des sites potentiels de liaison pour les protéines de liaison à l’ADN, hnRNP K et H respectivement. Nous avons donc testé l’effet de la surexpression de hnRNP K et H sur l’épissage alternatif de TAF6 et nous n'avons eu aucuns changement sur l’expression de TAF6ð endogène. De plus, nous avons constaté que la mutation d'un seul nucléotide qui semble perturber la structure secondaire d'ARN au site d’épissage proximal, renverse complètement le patron d’épissage. Cette mutation favorise le choix du site d’épissage distal (un site faible) à la place du site d’épissage proximal (TAF6?). Nos résultats suggèrent aussi qu’un élément régulateur d’épissage qui favorise TAF6? est présent dans l’exon 2 alternatif. Pour permettre l’identification des facteurs d’épissage influençant le choix du site d’épissage, nous avons créé un nouveau système d’épissage rapporteur. Notre nouveau vecteur contient la séquence génomique de TAF6 (exon 2 à exon 4) modifiée par l’introduction d’un codon stop prématuré (CSP) dans l’exon 2 alternatif et fusionné à la protéine EYFP. La combinaison des essais de transfections transitoires avec les SSOs ont été utilisés pour valider ce système contrôlé par cytométrie de flux. Dans le futur, ce système pourrait être utilisé pour produire une lignée stable afin d'identifier les facteurs d’épissage impliqués dans la régulation de l’épissage alternatif par un criblage d’inhibition (siRNA) ou de surexpression (ADNc). Donc, mon projet présente la première identification des éléments cis qui contrôlent l’épissage du facteur aussi bien que le développement d’un système d'épissage rapporteur créé pour permettre l’identification des protéines d'épissage qui régulent l’expression de TAF6ð. [symboles non conformes]

Les travaux présentés dans cette thèse s'inscrivent dans le cadre bio-informatique de l'analyse des génomes. Plus particulièrement, ces travaux concernent l'expression des gènes et les éléments régulateurs, présents dans l'ADN, qui participent à la modulation de cette expression.<br />Le problème de la recherche de ces éléments régulateurs peut être envisagé sous l'angle informatique de la recherche de motifs approchés particuliers.<br /><br />La recherche de motifs régulateurs est une question difficile du fait de la faible spécificité des motifs recherchés. Pour pouvoir y répondre, il faut prendre en compte différentes formes d'information. En particulier, il est pertinent de prendre en compte la conservation entre espèces (génomique comparative), la conservation entre séquences génomiques partageant des éléments de régulation (gènes co-régulés) ou encore, dans certains cas, la conservation spatiale des sites de fixation.<br /><br />Dans ce cadre, nous proposons une méthode permettant de tirer parti, à la fois de la conservation spatiale, et de la conservation entre espèces. Cette approche se compose d'un algorithme de recherche locale et d'évaluateurs statistiques adaptés au problème de la recherche de motifs sur-représentés localement lorsque l'environnement de recherche est hétérogène, c'est-à-dire pour des séquences pouvant provenir d'organismes différents ou de régions différentes du génome. Ces travaux ont été mis en oeuvre dans un logiciel appelé TFM-Explorer, que nous avons évalué avec succès sur des données issues du génome humain, de la souris et du rat.

Les éléments cis-régulateurs contrôlent l'expression spatio-temporelle des gènes au cours du développement. La segmentation du rhombencéphale en rhombomères (r) établit l'organisation du cerveau postérieur des vertébrés. La spécification et la formation des segments r3 et r5 sont gouvernées par l'expression du facteur de transcription Krox20/Egr2, sous le contrôle de plusieurs éléments cis-régulateurs. Les éléments B (dans r5) et C (dans r3 et r5) sont actifs au démarrage de l'expression de Krox20 alors que l'élément A (dans r3 et r5) est un élément autorégulateur. En générant la délétion de l'élément A dans le génome murin, nous avons montré qu'il est nécessaire au maintien de l'expression de Krox20 dans r3 et r5. De façon inattendue, la délétion de l'élément C n'impacte pas la phase de démarrage mais abolit le maintien de l'expression de Krox20 dans r3 de manière analogue à celle de l'élément A. J'ai mis en évidence par différentes approches génétiques que l'élément C coopère en cis avec l'élément A, lors de la phase d'autorégulation. Plusieurs approches de conformation et d'accessibilité de la chromatine au locus Krox20 indiquent que l'élément A interagit de façon constitutive avec le promoteur et que l'élément C est capable d'affecter l'accessibilité de l'élément A à distance. Parallèlement, j'ai montré que la délétion de l'élément C chez le poisson-zèbre n'entraîne pas de modification de l'expression du gène Krox20 contrairement à la souris malgré un patron d'expression similaire. Ces approches complémentaires ont permis de caractériser le rôle fonctionnel de plusieurs éléments cis-régulateurs contrôlant l'expression d'un gène clef du développement des Vertébrés. / Cis-regulatory elements ensure the specifity and the maintenance of the spatio-temporal gene expression pattern throughout the development of an organism. Segmentation of the hindbrain into rhombomeres (r) establishes the posterior brain organisation in vertebrates. The specification and formation of r3 and r5 are governed by the expression of the transcription factor Krox20/Egr2, controlled by three cis-regulatory elements. Elements B (in r5) and C (in r3 and r5) are active during the initiation of Krox20 expression while element A (in r3 and r5) is an autoregulatory element. By studying the deletion of element A in the mouse genome, we have shown that Krox20 expression is not maintained in absence of this element. Unexpectedly, the deletion of element C does not impair Krox20 initiation but abolishes the maintenance of expression in r3, similarly to element A knock-out. I also showed by different genetic approaches that element C cooperates in cis with element A. Moreover, investigation of chromatin conformation and accessibility in the Krox20 locus indicate that element A and the promoter are engaged in a constitutive interaction and that element C is able to affect the accessibility of element A at a distance. In parallel, the deletion of element C in zebrafish did not reveal any modification in Krox20 expression, despite a similar expression pattern in mouse. These complementary approaches lead to the characterization of the functional role of several cis-regulatory elements driving the expression of a key developmental gene in vertebrates.

Les ascidies présentent des propriétés remarquables au sein des métazoaires qui en font un modèle particulièrement intéressant pour étudier le fonctionnement et l’évolution des éléments cis-régulateurs dans un contexte développemental. Ciona intestinalis et Phallusia mammillata, deux espèces d’ascidies qui ont divergé il y a environ 300 millions d’années, combinent une grande conservation de leurs processus développementaux avec une grande divergence de leur séquence génomique. Pour comprendre comment « fabriquer » des embryons similaires avec des génomes divergents, nous avons identifié les éléments cis-régulateurs actifs au cours du développement de Ciona intestinalis et Phallusia mammillata en développant et en appliquant la méthode de ChIP-Seq sur des modifications d’histones sur des jeunes gastrulae. La définition puis la validation fonctionnelle de différentes catégories d'éléments cis-régulateurs nous a permis de révéler quelques propriétés de la cis-régulation au sein de génomes compacts et intensément remaniés. En sus, les données que nous avons produites constituent une resource fonctionnelle unique pour la caractérisation des éléments cis-régulateurs chez les ascidies et l'étude de leur évolution au sein des Chordés. / Ascidians display remarkable features within metazoans making them particularly suited for the study of function and evolution of cis-regulatory elements in the context of embryonic development. Ciona intestinalis and Phallusia mammillata, two ascidian species that diverged about 300M years ago, combine high conservation of their developmental processes with high divergence of their genome sequence. To understand how to “make” similar embryos with divergent genomes, we identified active cis-regulatory elements during Ciona intestinalis and Phallusia mammillata development by developing and applying the ChIP-Seq method on histone modifications in early-gastrula embryos. Definition then functional validation of different categories of cis-regulatory elements led us to reveal some features of cis-regulation within compact and highly dynamic genomes. Together, our data constitute a unique functional resource for characterizing cis-regulatory elements in ascidians and questioning their evolution within the Chordates.

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP. / Transcription factors (TF) play important roles in various biological processes such as differentiation, cell cycle progression and tumorigenesis. They regulate gene expression by binding to specific DNA sequences (TFBS). Identifying these cis-regulatory elements is a crucial step to understand gene regulatory networks. Technological developments have enhanced DNA sequencing at genomic scale. On the basis of the resulting sequences, computational biologists now attempt to localize the most important functional regions, starting with genes, but also importantly the whole genome characterization of transcription factor binding sites and allow the development of several computational DNA motif discovery tools. Although these various tools are widely used and have been successful at discovering novel motifs, they are not adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The main drawback of these approaches is that most of the predicted motifs represent artifacts due to an inefficient assessment of their enrichment. This thesis is about transcription factor proteins and statistical analysis of their binding sites in ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The first objective was to develop a new do novo DNA motif discovery tool adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. SAMD-ChIP combines enumerative and stochastic strategies to predict enriched motifs in the vicinity of the ChIP peak summits. Our approach is an automated pipeline that includes motif discovery, motif clustering, motif optimization and finally motif identification using transcription factor (TF) databases. SAMD-ChIP outperforms state-of-the-art motif discovery tools in term of the number of predicted motifs and the prediction of rare and degenerate motifs. In particular, SAMD-ChIP efficiently identifies gapped motifs such as inverted or direct repeats bound by nuclear receptors and composite motifs resulting from the association of different single TF binding sites. The underlying assumption of the second objective is that in regulatory regions, binding sites of interacting transcription factors co-occur more often than expected by chance in the vicinity of the ChIP-peak summits. We proposed an approach to predict transcription factor binding sites co-localization based on the prediction of single motifs by do novo motif discovery tools or by using TFBS models from TF data bases.

Les membres de la famille Homeobox jouent un rôle critique dans le développement hématopoïétique normal. L'expression ectopique des gènes Homeobox provoque des désordres dans l'hématopoïèse et le développement de leucémies. L'oncogène TLX3 s'exprime de manière ectopique exclusivement dans les Leucémies Aiguës Lymphoblastiques T (LAL-T), avec un blocage des thymocytes à un stade de différentiation précoce cortical CD4+CD8+ DP. De nombreuses études ont investigué les mécanismes d'action des oncogènes TLX1/3, mais plusieurs questions restent en suspens. Durant ma thèse, j'ai étudié l'impact de l'expression ectopique de l'oncogène TLX3 sur le développement lymphocytaire T et les mécanismes de transformation leucémique associés. L'expression de TLX3 a provoqué le blocage des thymocytes à un stade DN2 avec une immortalisation des clones preleucémiques. Les souris transplantées avec les cellules TLX3 ont développé des tumeurs similaires aux LAL-T. Les analyses de ChIP-Seq et d'expression génique ont identifié un recrutement de TLX3 sur les enhancers spécifiques aux cellules T par le motif de fixation Ets/Runx1. Nos résultats suggèrent que la fixation de TLX3 sur les éléments cis-régulateurs peut contribuer à la transformation maligne des thymocytes en perturbant les réseaux transcriptionnels responsables de l'oncogenèse LAL-T. / It is now well established that members of the homeobox gene family play a critical role in normal hematopoietic cell development and that their unbalanced or ectopic expression can lead to characteristic perturbations in haemopoiesis and the onset of leukaemia. TLX3 expression in human haematologic malignancies is exclusive to T-ALL, where it is almost universally associated with transformation of early cortical CD4+CD8+ DP thymocytes. Multiple studies intensively investigated the mechanisms by which TLX1/3 oncogenes could promote complex tumor development, but many questions remain still unclear. During my thesis I investigated the impact of ectopic TLX3 expression on T cell development, and the initiating mechanisms of T-cell transformation leading to leukemia onset. Forced expression of TLX3 disrupted the thymic develoment at DN2-like stage giving rise to immortalized preleukemic clones. Following the transfer into immunodeficient mice TLX3 preleukemic cells initiated malignant cell transformation resulting into leukemia-like disease. Applying a combination of ChIP sequencing and gene expression profiling, we identified TLX3 recruitment onto T-cell specific enhancers via interaction with Ets1/Runx1 composite motif sites as preferential molecular events in the initial steps of TLX3-induced transformation. Thus our findings suggest that the genome-wide binding properties of TLX3 on cis-regulatory elements may contribute to its ability to promote thymocyte preleukaemic state via perturbation of transcriptional regulatory networks responsible for T-ALL oncogenesis.

L'évolution de la régulation de l'expression des gènes participe à l'évolution de leur fonction. L'existence de profils d'expression spécifiques évitant la redondance fonctionnelle expliquerait le maintien des gènes dupliqués dans les génomes. La PCR quantitative en temps réel se révèle adaptée à l'étude de l'expression des familles de gènes présentant des niveaux très variés et des séquences proches. Le génome modèle d'Arabidopsis thaliana contient une famille d'ARN hélicases à boîte DEAD (RH) de 58 membres, i.e. environ deux fois plus que n'en comptent les génomes d'animaux ou celui de la levure. L'expression transcriptionnelle de 20 AtRH a été obtenue par RT-PCR quantitative dans neuf organes différents. Dans cette famille de gènes " de ménage ", deux AtRH présentent des profils spécifiques alors que les 18 autres AtRH présentent le même profil spatial, mais des niveaux d'expression transcriptionnelle très différents. L'élément régulateur principal du niveau transcriptionnel est la présence simultanée d'une boîte TATA caractéristique et d'un intron en 5' UTR. Dès lors que la boîte TATA est présente, il y a une corrélation positive significative entre la taille de l'intron en 5' UTR et le niveau d'expression. Notre travail sur l'expression des AtRH permet d'introduire un scénario sur la dynamique évolutive des gènes dupliqués qui forment une même branche terminale d'un arbre phylogénétique et dont le niveau d'expression diffère fréquemment. Après la duplication d'un gène fortement transcrit, l'altération de l'activité transcriptionnelle des copies se produirait par des événements successifs de suppression de la boîte TATA et/ou de l'intron en 5' UTR.