Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2014-2015 / La réaction de glucuronidation prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases est une voie majeure du système de détoxification cellulaire qui influence la biodisponibilité de molécules endogènes et exogènes. Notre laboratoire a récemment découvert l’existence de nouvelles protéines UGT nommées i2 dérivées de l’épissage alternatif du gène UGT1A. Ces protéines sont dépourvues d’activité transférase. Nous avons démontré par immunohistochimie que les enzymes i1 et les protéines alternatives i2 sont coexprimées dans plusieurs tissus du tractus gastro-intestinal, ainsi que dans les mêmes types cellulaires de ces tissus. Les i2 sont localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) avec les i1, mais sont également présentes dans le cytosol. Étant donné la proximité physique des i1 et i2 au RE, nous avons généré des modèles cellulaires surexprimant différentes combinaisons d’enzymes i1 et de protéines i2. Nos données démontrent que la coexpression de ces deux types de protéines diminue l’activité de glucuronidation de 20 à 80 % dépendamment du substrat et de l’enzyme testés. Par co-immunoprécipitation, nous avons démontré que cette répression survient via l’interaction physique des i1 avec les i2. À l’inverse, l’augmentation de l’activité de glucuronidation suite à la répression des formes i2 endogènes a permis de confirmer ce rôle de modulateur négatif des i2. Il semble aussi que les i2 soient en mesure de moduler significativement l’activité UGT même lorsque leur niveau d’expression est inférieur à celui des i1, tel que retrouvé dans plusieurs tissus humains. Nos données supportent également l’influence de ces protéines alternatives sur la réponse pharmacologique. En effet, la répression de l’expression des i2 endogènes dans une lignée de cancer de côlon entraîne un avantage de survie sous traitement chimiothérapeutique. Enfin, l’identification de l’interactome tissulaire des isoformes des UGT1A démontre qu’elles ont le potentiel d’interagir avec des enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la migration cellulaire. Nos données supportent que les i2 ont même la capacité de modifier le potentiel migratoire de cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les i2 ont la capacité de moduler le stress oxydatif cellulaire, entre autres via l’interaction avec des protéines antioxydantes, telle la catalase. En conclusion, nos résultats démontrent que les protéines alternatives i2 auraient le potentiel de moduler le système de défense cellulaire à plusieurs niveaux, en plus d’influencer la réponse aux médicaments. / The glucuronidation reaction mediated by the UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes is a major pathway of cellular detoxification system and has a clear effect on xenobiotic and endobiotic bioavailability. We have recently discovered nine new UGT proteins, named i2, which are derived from UGT1A alternative splicing. Those proteins are devoid of transferase activity. Using immunohistochemistry, we have demonstrated that i1 enzymes and i2 alternative proteins are coexpressed in multiple tissues of the gastrointestinal tract and also in the same cell types. Alternative i2 are localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane along with i1, but are also detected in the cytosol. Given the physical proximity of i1 and i2 at the ER, we have generated cellular models overexpressing different combinations of enzymes and i2 alternative proteins. Our data revealed that coexpression of those two types of proteins leads to a decrease of 20 – 80 % of the glucuronidation activity depending on the substrate and enzyme tested. By co-immunoprecipitation experiments, we have demonstrated that this modulation occurs via the physical interaction of i1 and i2. We have confirmed the negative modulator function of i2 alternative proteins by RNA interference. Our results demonstrates that repression of endogenous i2 leads to a significant increase of cellular glucuronidation activity. Data also support the importance of expression ratio of i2 :i1. Indeed, even an expression of i2 below the level of i1, as found in several tissues, consistently resulted in a significant modulation of UGT activity. Our data also support the role of i2 alternative proteins on pharmacological response. Repression of endogenous i2 in a colon cancer cell line leads to an increased cell viability under chemotherapeutic treatment. Furthermore, identification of UGT1A endogenous interactome reveals their capacity to physically interact with protein implicated in energy metabolism and cell migration. Our data support that i2 alternative proteins have the capacity to modulate migration potential of cancer cells. We have also demonstrated that i2 alternative proteins are able to modulate cellular oxidative stress, in part via protein-protein interaction with anti-oxidant proteins, such as catalase. In conclusion, our results demontrate that i2 alternative proteins have the potential to modulate the cellular defense system at multiple levels in addition to influence pharmacological response.

L'enzyme UGT2B7 est un membre de la superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT), impliquée dans la glucuronidation. Cette réaction de conjugaison de l'acide glucuronique permet l'inactivation et l'élimination de certains composés alimentaires, polluants environnementaux, substances endogènes ainsi que d'environ 35% des médicaments présentement sur le marché. L'activité enzymatique de cette voie métabolique est sujette à une importante variabilité interindividuelle qui, dans le cas d'UGT2B7, n'est pas expliquée par la présence de polymorphismes génétiques. De nouvelles évidences suggèrent que l'épissage alternatif est un mécanisme qui pourrait contribuer à cette variabilité interindividuelle via la formation de nouveaux transcrits d'ARN messagers et de peptides pouvant avoir des rôles opposés, une fonction régulatrice ou encore une distribution tissulaire différentielle dans le cas des UGT. L'objectif de mon projet de recherche était de caractériser l'épissage alternatif du gène UGT2B7 humain avec l'objectif futur d'établir si ce phénomène est à l'origine de la variabilité de cette voie métabolique.

L’épissage alternatif en 3’ du gène UGT1A entraîne la production d’enzymes actives, les isoformes 1 (i1), et de protéines tronquées, les isoformes 2 (i2), qui ne possèdent pas de domaine transmembranaire (TMD) et d’activité de glucuronidation, mais plutôt des propriétés modulatrices sur l’activité enzymatique des i1 via des interactions protéiques. Nous croyons que les interactions i1-i2 impliquent plusieurs domaines d’interactions et qu’ils sont différents de ceux impliqués dans l’homo-oligomérisation des i1. Des expériences de co-immunoprécipitation démontrent que les isoformes i1 dépourvues du signal peptide +/- le TMD empêchent l’homo-oligomérisation sans affecter l’interaction i1-i2. De plus, la présence de complexes de hauts poids moléculaires observée par immunobuvardages en conditions non-réductrices démontre l’implication potentielle de ponts disulfures dans la formation des complexes i1-i2, et ce via plusieurs résidus cystéines. En somme, les résultats obtenus supportent que l’interaction i1-i2 implique plusieurs domaines protéiques et qu’ils diffèrent de ceux impliqués dans les complexes i1-i1. / Alternative splicing of UDP-glucuronosyltranferase UGT1A gene results in the production of enzyme, isoforms i1 and i2. Unlike the active i1 proteins, i2 are truncated proteins which lack the transmembrane domain and glucuronic acid transferase activity, but have an inhibitory effect on UGT1A activity likely through the formation of hetero-oligomers with i1. We believe that i1-i2 interaction involves binding of more than one domain. Our results showed that i1, in the presence or absence of the transmembrane domain, without the signal peptide did not self-interact but instead interacted with i2. In addition, high molecular weight complexes were observed by immunoblotting under non-reducing conditions. It demonstrates the involvement of disulfide bonds in the formation of i1-i2 complexes. In summary, these results support that i1-i2 interactions involve multiple protein domains and they differ from those involved in homo-oligomerization of i1.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / L'une des principales voies du métabolisme des médicaments est prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT). Nos récentes découvertes ont mis à jour l'existence de nouvelles protéines nommées isoformes 2 (i2) produites par épissage alternatif du gène UGT1A humain. Ces produits d'épissage ne possèdent pas d'activité enzymatique mais démontrent une distribution tissulaire similaire à celles des isoformes 1 actives. Les enzymes i 1 et les nouvelles formes i2 sont présentes notamment au foie, dans le tractus digestif et le rein et leur localisation subcellulaire est similaire. Par immunohistochimie, nous avons également pu observer leur présence dans les tissus tumoraux. Basé sur les profils d'expression tissulaire, nous avons démontré un impact significatif de l'expression hétérologue stable d'i2 sur la conjugaison de divers médicaments, en présence d'il. Nous avons établi diverses lignées cellulaires surexprimant différentes combinaisons d'il et i2. Une réduction significative de 20 à 82% de la production de metabolites glucuronides est observée en essais enzymatiques pour plusieurs substrats dont l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. Les expériences de co-immunoprécipitation supportent que cette répression survient via l'interaction directe des protéines il et i2 dans la membrane du reticulum endoplasmique, formant ainsi des complexes inactifs. La fonction répressive d'i2 sur l'activité UGT a en parallèle été validée par des expérimentations en cellules intactes visant la répression des isoformes i2 endogènes par interférence à l'ARN qui entraînaient pour leur part une augmentation significative de l'activité de glucuronidation. Ce phénomène pourrait donc avoir une importance physiologique et pharmacologique significative, alors que l'abondance relative des formes il et i2 interagissant sous la forme de complexes actifs (il-il) et inactifs il-i2) serait déterminante de l'activité de glucuronidation cellulaire. Nous avons également identifié la présence de sept nouvelles isoformes d'UGT2B4 qui sont inactives. Toutefois, la co-expression de trois d'entre elles avec la forme active classique d'UGT2B4 (il) provoque une diminution de l'activité de conjugaison. En conclusion, nos résultats démontrent que des événements d'épissage alternatif des gènes UGT humains influencent la voie de glucuronidation suggérant un mécanisme d'auto-régulation, et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement de plusieurs pathologies telles que le cancer.

TAF6 est un co-facteur de transcription qui fait partie du complexe multiprotéique, TFIID. TAF6 possède 4 isoformes et deux d'entre eux ont des fonctions opposées. TAF6[alpha] est l'isoforme anti-apoptotique et peut dimériser avec TAF9, tandis que TAF6[delta] est l'isoforme pro-apoptotique et ne peut pas dimériser avec TAF9. TAF6[delta] induit l'apoptose indépendamment de p53. Cette nouvelle voie apoptotique présente un intérêt certain et l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de TAF6[delta] est essentielle pour comprendre le mécanisme par lequel TAF6[delta] induit l'apoptose. Nous avons donc développé un minigène de TAF6 qui récapitule le patron d'épissage endogène. Nous avons muté le minigène TAF6 afin d'identifier des éléments sur l'ARN controllants son épissage. Ces éléments ont été retrouvés surtout au niveau de l'exon 2 et de l'intron entre l'exon 2 et l'exon 3. Trois sites activateurs d'épissage ont été déterminés dans l'exon 2. De plus, nous avons démontré la présence d'une structure secondaire importante dans le choix du site 5' d'épissage. Nous avons aussi établi que la distance de 30 nucléotides entre les deux sites 5' d'épissage avait un rôle à jouer dans le choix de ce site d'épissage. Un dernier site activateur a été positionné dans l'intron. D'après ces résultats de mutations et un criblage PCR d'ADNc de cellules transfectées par des siRNAs contre des protéines de liaison à l'ARN, nous avons identifié hnRNP K comme facteur trans potentiel régulant l'épissage de TAF6. Les facteurs trans liants les éléments cis permettent de réguler en partie l'épissage alternatif d'un ARN pré-messager. Des expériences d'immunoprécipitation in vivo nous ont permis d'établir qu'il existe une interaction entre l'ARN de TAF6 et hnRNP K. Le signal extracellulaire qui agit sur les éléments cis et permet de changer l'épissage alternatif de TAF6 est encore inconnu. Nous avons tenté de le déterminer, mais, pour l'instant, nos hypothèses n'ont pas été confirmées par les expériences menées. L'apoptose, si elle est dérégulée, peut mener à des pathologies. L'expression de TAF6 et l'inclusion d'éléments répétitifs Alus dans son ARN messager ont été démontrés comme étant augmentées dans les cellules tumorales du sein. Nous avons aussi commencé l'étude de l'importance de ces éléments répétitifs dans l'augmentation de l'expression de TAF6 dans les cancers. Nous avons identifié une mutation ponctuelle au niveau de la deuxième séquence répétitive Alu qui peut être retrouvée dans TAF6, mais nous ne connaissons pas encore sa fonction dans la surexpression de TAF6 dans les cancers du sein. Bref, ce mémoire présente les différents résultats obtenus dans le cadre d'expériences dont le but était d'identifier les éléments cis, les facteurs trans, le signal déclenchant l'épissage et le rôle des éléments répétitifs Alus présents dans l'ARN de TAF6.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La protéine tau est une protéine neuronale associée aux microtubules. L’exon 10 code pour un domaine de liaison aux microtubules et son épissage alternatif définit deux types d’isoformes ayant une fonction biologique distincte. En effet, quand l’exon 10 est exclu, les isoformes de tau ont trois domaines de liaison aux microtubules (Tau3R) alors que les isoformes en possèdent quatre lorsque l’exon 10 est inclus (Tau4R). Ainsi, les isoformes Tau4R sont connues pour avoir une meilleure affinité pour les microtubules, et permettent de mieux les stabiliser au sein de l’axone des neurones. Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives qui se caractérisent par la présence d’agrégats de la protéine tau sous forme hyperphosphorylée. Parmi ces agrégats, certains sont composés des isoformes Tau3R et Tau4R, alors que d’autres sont essentiellement composés soit des isoformes Tau3R, soit des isoformes Tau4R. Ces données montrent qu’un défaut d’épissage alternatif de l’exon 10 de tau peut conduire à une pathologie. Cependant, la régulation de l’épissage alternatif de l’exon 10 est encore mal connue à la fois dans un contexte physiologique et pathologique et l’absence de données sur la physio-pathologie des tauopathies et de modèles d’études intégrés rendent l’avancement des connaissances et le développement de stratégies thérapeutiques nébuleux. De manière intéressante, il existe un changement d’épissage alternatif de l’exon 10 au cours du développement du cerveau chez la souris. En effet, les isoformes Tau3R sont majoritaires dans les premiers stades du développement et ne sont plus du tout exprimées à l’âge adulte. En revanche, le cerveau humain à l’âge adulte exprime autant d’isoformes Tau3R que d’isoformes Tau4R. Nous avons remarqué que deux évènements ont lieu simultanément au cours du développement du cerveau chez la souris : le changement d’expression des isoformes de tau et la mise en place de la thermogénèse. Plusieurs études ont montré que la température influence le niveau de phosphorylation de la protéine tau, mais aucune n’a mis en évidence l’impact de la température sur l’épissage alternatif de tau. Ainsi, notre hypothèse de départ est que la température représente un nouveau régulateur de l’expression des isoformes de tau, en modulant l’épissage alternatif de l’exon 10. Les principaux objectifs de cette thèse étaient d’analyser l’impact de la température sur l’épissage alternatif de l’exon 10 de tau et les mécanismes cellulaires associés aux changements d’épissage alternatif de l’exon 10. Dans un premier temps, nous avons utilisé le développement du cerveau chez la souris comme modèle pour faire une caractérisation plus précise de l’expression des isoformes de tau. Ensuite, nous avons utilisé des cultures de neurones primaires de souris, dans le but d’évaluer l’impact de changements directs de température sur l’expression des isoformes de tau. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé une approche in vitro, pour caractériser les changements d’épissage alternatif de l’exon 10 de tau au niveau de l’ARNm et protéique. Dans un troisième temps, nous avons analysé les mécanismes cellulaires responsables de ces changements d’expression. Nos résultats montrent que la température affecte directement l’épissage alternatif de l’exon 10 au niveau de l’ARNm mais également des protéines synthétisées. De plus, nous avons vu que l’hypothermie favorise l’exclusion de l’exon 10, ce qui conforte notre observation de départ en lien avec le développement du cerveau chez la souris, tandis que l’hyperthermie favorise l’inclusion de l’exon 10 dans tous les modèles analysés. Nous avons également montré que la température affecte l’épissage alternatif de l’exon 10 humain. Nos résultats montrent également que la température affecte le patron développemental d’expression des isoformes de tau. De plus, nos résultats ciblent le facteur d’épissage Muscle blind-like (MBNL), comme mécanisme cellulaire responsable des changements d’expression des isoformes de tau induits par la température. De manière préliminaire, nos travaux de recherche montrent ainsi un nouveau rôle de la température dans la régulation de l’expression des isoformes de tau. Les prochaines étapes seraient d’évaluer l’impact fonctionnel de ces changements d’expression de tau sur le cerveau et de tester les changements de température comme nouvelle avenue thérapeutique pour le traitement des tauopathies présentant un défaut d’épissage alternatif de l’exon 10 de tau. / Tauopathies are a group of neurodegenerative disorders characterized by the presence of aggregates of hyperphosphorylated tau protein. These aggregates are either constituted of the six tau isoforms, or Tau4R isoforms or Tau3R isoforms, suggesting that altered tau exon 10 alternative splicing can lead to neurodegeneration. This was further supported by the discovery of mutations on matp gene mainly responsible for fronto-temporal dementia. The regulation of tau exon 10 alternative splicing is not fully understood in both physiological and pathological conditions. Indeed, the lack of data on the development of sporadic tauopathies (in absence of tau mutations) and models to study them make therapeutics strategies compromised. Interestingly, changes of tau isoforms expression has been reported during the mouse brain development. Indeed, Tau3R isoforms are dominant in the first developmental stages (embryonic and early post-natal) and are absent in adulthood. To the opposite, human adul brain expresses both Tau3R and Tau4R to equal amount. This inter-species fundamental difference of expression of tau isoforms is not understood. We noctided that some events are concomitant during the mouse brain development: shift of tau isoforms, shift of tau phosphorylation state and pups thermoregulation efficiency. It has been reported that temperature can influence the phosphorylation of tau protein and especially that hypothermia increases it. To date, no study has shown the impact of temperature on tau exon 10 alternative splicing. Thus, our hypothesis is that temperature is a new regulator of the expression of tau isoforms by modulating the alternative splicing of tau exon 10. The major goals of this thesis were to analyze the impact of temperature on the alternative splicing of tau exon 10 overall, and especially during the mouse brain development. On another hand, we want to analyze the mechanisms responsible for temperature-mediated tau exon 10 alternative splicing changes. First, we used the mouse brain development to characterize the expression of tau isoforms. Thus, we used mouse primary neuronal cells in the aim of analyzing the impact of direct changes of temperature on tau isoforms expression. Second, we used in vitro approaches to characterize the impact of temperature on tau exon 10 alternative splicing at both mRNA and proteins levels. Third, we have analyzed mechanisms involved in these changes. Our results show that temperature directly affects tau exon 10 alternative splicing at both mRNA and protein levels. For the first time, we show that hypothermia induces tau exon 10 exclusion whereas hyperthermia favors exon 10 exclusion. Moreover, we show that temperature is able to modulate the alternative splicing of human tau exon 10. Our results with primary neuronal cells show that temperature can influence the developmental pattern of expression of tau isoforms, suggesting that temperature is a strong modulator of tau exon 10 alternative splicing. Eventually, our results highlight the role of Muscle blind-like proteins (MBNL) as potential mechanisms involved in the regulation of tau exon 10 alternative splicing by the temperature. Interestingly, our work put in relief a new role of the temperature in the regulation of tau isoforms expression. As perspectives, it should be important to evaluate the functional impact of temperature-mediated changes of tau isoforms expression on brain.

Le profilage transcriptomique global des gènes humains a permis d'estimer que 95% des gènes subissent un épissage alternatif. L'épissage alternatif élargit la diversité de notre génome et le module par des mécanismes de régulation croisée. Les principales petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), à savoir U1, U2, U4, U6 et U5, catalysent l'excision des introns d'une manière concertée. Certains des modèles d'épissage prédominants par lesquels l'AS étend la diversité du génome incluent le saut d'exon, les exons mutuellement exclusifs, le site d'épissage alternatif 5' et la sélection du site d'épissage alternatif 3'. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de l´épissage alternatif en modulant le recrutement des snRNP aux niveaux des séquences cis-régulatrices; (« enhancer » et « silencer ») situées dans les exons ou les introns. L´objectif actuel dans le domaine de l´épissage est d´établir un « code d´épissage » pour chaque RBP afin de permettre la prédiction de son type d´activité en fonction de la région liée. Des applications récentes à l'échelle du génome, telles que les microréseaux et l'ARN-Seq, ont mis en lumière des modèles d'épissage souvent négligés, tels que la polyadénylation intronique et la rétention intron. La protéine de liaison à l'ARN, SAM68, module l'épissage alternatif de mTor - qui code mTOR, le régulateur principal de la croissance cellulaire et de l'homéostasie. SAM68 favorise l'épissage intron 5 normal de mTor. Des pré-adipocytes chez des souris déficientes en Sam68 ont montré des défauts de différenciation et une diminution de l'engagement dans la lignée adipocytaire. Ces souris étaient maigres et insensibles à l'obésité d'origine alimentaire. L'analyse à l'échelle d'une micropuce du tissu adipeux blanc de souris Sam68-null a permis d'identifier une régulation à la hausse d'une isoforme tronquée de mTor ; mTori5, qui se termine par transcription dans l'intron 5, en raison d'un manque d'épissage au site 5´ d´épissage. Cependant, le mécanisme par lequel SAM68 régule les événements d'épissage, en particulier dans le contexte de la reconnaissance du site d'épissage, n'a pas encore été caractérisé à ce jour. Dans cette thèse de doctorat, je décris une étude approfondie sur le rôle de SAM68 et des régions d'amplificateur intronique dans mTor intron 5 dans la reconnaissance de son site d'épissage 5' amont. Mes résultats mettent en évidence un nouveau rôle du SAM68 dans la modulation du recrutement du snRNP U1 snRNP sur des sites d'épissage de 5'. Je décris la caractérisation biochimique de l'interaction de SAM68 avec U1A, le composant central du snRNP U1 et le rôle de la phosphorylation de la tyrosine SAM68 dans la modulation de cette interaction. Je décris également comment SAM68 par son interaction avec U1 snRNP joue un rôle crucial dans le masquage des signaux de polyadénylation intronique cryptique dans un sous-ensemble de gènes. Collectivement, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des éléments introniques et du rôle de SAM68 dans les décisions cruciales en matière d'épissage. / Global transcriptome profiling of human genes have led to the estimation that 95% of genes undergo alternative splicing. Alternative splicing expands the diversity of our genome and modulates it by cross-regulatory mechanisms. Major small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) namely U1, U2, U4, U6 and U5 catalyzes intron excision in a concerted manner. Some of the predominant splicing patterns by which alternative splicing expands genome diversity includes include exon skipping, mutually exclusive exons, alternative 5´splice site and alternative 3´splice site selection. RNA binding proteins play a major role in the regulation of alternative splicing by modulating snRNP recruitment and they do so by binding directly to pre-mRNA sequences called splicing enhancers or silencers that are located in exons and/or introns. A current goal in the splicing field is to establish a ‘splicing code’ for each RBP, whereby its activity, as in splicing activation or repression can be predicted based on its binding region relative to splice sites. Recent genome wide applications such as microarray and RNA-Seq have shed light on the often overlooked splicing patterns such as intronic polyadenylation and intron retention. The RNA binding protein, SAM68, modulates the alternative splicing of mTor – that encodes mTOR, the master regulator of cell growth and homeostasis. SAM68 promotes normal intron 5 splicing of mTor. Pre-adipocytes of Sam68 deficient mice showed differentiation defects and decreased commitment to adipocyte lineage. These mice were lean and unresponsive to dietary induced obesity. Exon-wide microarray analysis of white adipose tissue from Sam68-null mice identified upregulation of a truncated isoform of mTor; mTori5 , that transcriptionally terminates within intron 5 due to lack of splicing at the upstream 5´splice sites. However, the mechanism by which SAM68 regulates splicing events, particularly in the context of splice site recognition, has not been characterized till date. In this doctoral thesis, I describe an in-depth study on the role of SAM68 and the intronic enhancer regions in mTor intron 5 in the recognition of its upstream 5´splice site. My results uncover a novel role of SAM68 in modulating U1 snRNP recruitment at 5´splice sites. I describe the biochemical characterization of SAM68 interaction with U1A, the core component of U1 snRNP and the role of SAM68 tyrosine phosphorylation in modulating this interaction. I also describe how SAM68 by its interaction with U1 snRNP plays a crucial role in masking cryptic intronic polyadenylation signals in a subset of genes. Collectively, this study will contribute to advanced understanding of intronic elements and the role of SAM68 in affecting crucial splicing decisions.

La voie de glucuronidation catalyse l’inactivation de nombreux métabolites endogènes, tels que la bilirubine ou les hormones stéroïdiennes, ainsi que des substances exogènes incluant notamment des médicaments et des carcinogènes. Ce processus enzymatique opéré par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT) entraîne généralement l’abolition de l’activité biologique ou pharmacologique des composés et en augmente la solubilité afin de favoriser leur élimination de l’organisme. Une importante variabilité dans l’expression et l’activité de la voie de glucuronidation est observée entre les individus, pouvant affecter l’exposition aux substrats de cette voie enzymatique. Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressé à l’influence des polymorphismes génétiques et de l’épissage alternatif sur la variabilité de la voie de glucuronidation et la réponse au traitement. La relation entre les variations génétiques et la réponse au traitement de chimiothérapie de première intention à base d’irinotécan a d’abord été étudiée chez des patients atteints du cancer colorectal métastatique (CCRm). De nouveaux marqueurs germinaux ont été associés à la survie des patients de deux cohortes indépendantes, notamment dans les gènes UGT1, CES1 (carboxylestérase 1), ABCC1 (multidrug resistance-associated protein 1), RPL28 (protéine ribosomique L28) et du facteur de transcription HNF1A (hepatocyte nuclear factor 1-alpha). D’autre part, nos travaux révèlent que les variants d’épissage d’UGT2B10 représentent plus de la moitié du transcriptome dérivé de ce gène dans le tissu hépatique. Les protéines alternatives codées par ces nouveaux transcrits affectent la capacité de glucuronidation d’agents pharmacologiques pris en charge par l’enzyme. L’exposition des cellules hépatiques à certains composés exogènes semble remodeler l’épissage du gène UGT2B10 au détriment de l’expression de l’enzyme. Les travaux présentés dans cette thèse supportent que la génétique du patient ainsi que les processus d’épissage alternatif au niveau tissulaire aient le potentiel d’affecter la capacité de glucuronidation et la réponse au traitement. Puisque ces deux mécanismes contribuent à la variabilité de la voie des UGT, ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs de réponse aux composés pris en charge par ces enzymes. / The UDP-glucuronosyltransferases enzymes (UGTs) are responsible for the conjugation of their co-substrate UDP-glucuronic acid to numerous endogenous and exogenous substrates, including many drugs. This metabolic reaction, called glucuronidation, generally results in substrate inactivation and leads to increased solubility, leading to its elimination through bile and urine. Along with other enzymatic conversions and transport pathways, glucuronidation is a determinant of drug response. However, an important interindividual variability in its expression and activity is observed in patients and may lead to variable bioavailability and response to drugs. During my thesis, my interests were to investigate the role of germline genetic variations and alternative splicing events as mechanisms involved in the interindividual variability of the UGT pathway. First, we investigated genetic polymorphisms of irinotecan-related pathways including UGTs, in relation to outcomes in 417 metastatic colorectal cancer patients treated with first-line irinotecan-based chemotherapy. We identified several markers of survival, namely polymorphisms in UGT1, CES1 (carboxylesterase 1), ABCC1 (multidrug resistance-associated protein 1), RPL28 (ribosomal protein L28) genes as well as in HNF1A (hepatocyte nuclear factor 1-alpha) transcription factor gene. Then, we demonstrated that alternative transcripts represent half of the UGT2B10 hepatic transcriptome. Alternative proteins arising from UGT2B10 splicing events alter enzymatic activity for UGT2B10 substrates. We also showed that pharmacological compounds may affect splicing events at the UGT2B10 locus. These studies support an impact of common genetic variations and post-transcriptional mechanisms on glucuronidation, drug exposure and possibly drug response. Germline variations and alternative splicing seem to significantly contribute to the high interindividual variability of the UGT pathway. They may be potential biomarkers of the response to drugs metabolized by this pathway.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Divers évènements d’épissage alternatif ont été identifiés pour certains gènes de la famille FANC, notamment pour FANCE. La voie de réparation de l’ADN FANC-BRCA nécessite l’intégrité de l’ensemble des protéines Fanconi afin d’assurer l’efficacité de la réparation des pontages inter-brins. Nous avons alors étudié l’impact de l’expression du variant d’épissage alternatif FANCE∆4 au niveau de la voie FANC-BRCA. Son expression exclusive dans des cellules déficientes en FANCE (EUFA130) n’est pas suffisante pour restaurer l’activation de la voie de réparation. À la suite d’un traitement avec un agent pontant (mitomycine C), les cellules EUFA130 complémentées avec FANCE∆4 demeurent bloquées en phase G2/M du cycle cellulaire, la viabilité n’est pas augmentée et la monoubiquitination de FANCD2 et FANCI est absente, contrairement aux cellules EUFA130 complémentées avec FANCE. Ce projet a particulièrement permis de déterminer que FANCE∆4 n’est pas en mesure de se substituer lors de la perte de FANCE. / Several alternative splicing events were identified for some genes of the FANC family, such as FANCE. The integrity of the proteins of the FANC-BRCA DNA repair pathway is necessary to maintain efficient ICL repair. We studied the impact of the expression of an alternative splicing isoform, FANCE∆4. Its exclusive expression in FANCE-deficient cells (EUFA130) is not sufficient to restore the activation of the pathway. Following treatment with crosslink agent (mitomycin C), EUFA130 cells complemented with FANCE∆4 are blocked in G2/M phase of the cell cycle, the viability is not increased and the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI is absent, in contrast to EUFA130 cells complemented with FANCE. This project highlights FANCE∆4 that cannot replace FANCE in regard to DNA repair.