Estudos envolvendo o emprego de novas técnicas de esterilização têm apresentado nítido crescimento nos últimos anos como alternativa aos processos convencionais. A grande possibilidade consiste no emprego do plasma como agente de esterilização. Essa tecnologia tem considerável potencial para desenvolver o meio mais eficiente e seguro de esterilização de artigos termossensíveis com ênfase para a indústria farmacêutica e médica e até mesmo em outras áreas industriais. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de alguns parâmetros de processos por plasma e correlacionar sua eficácia com processos por óxido de etileno. Neste trabalho, estudos foram realizados empregando tecnologia de esterilização por plasma usando reator Reactive Ion Etching (RIE). Os valores aplicados de potências de rádio-frequência, a 13,56 MHz foram 25 W, 50 W, 100 W e 150 W. Os gases testados foram oxigênio puro e misturas de oxigênio e peróxido de hidrogênio (190/10, 180/20 e 160/40 sccm) e fluxo constante de 200 sccm, pressão de 0,100 torr e temperatura abaixo de 60°C. Esterilizador por óxido de etileno foi empregado a 450 mg/L (Oxyfume 2002®), 55°C, 60% de umidade e -0,65 e 0,60 kgf/cm2 de pressão. Os indicadores biológicos empregados foram constituídos de esporos de Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372, inoculados em lamínulas de vidro de 18 x 18 mm e discos de papel de 13 mm de diâmetro em uma carga de 2,0 x 107 UFC/suporte. Os tempos de exposição aos processos por plasma foram de 3 a 120 minutos. Reduções progressivas da contagem inicial de microrganismos foram observadas nos valores D: 215,91,55,55,9,19 e 2,91 minutos para processos por plasma com oxigênio puro, a 25 W, 50 W, 100 W e 150 W, respectivamente. Misturas de oxigênio e peróxido de hidrogênio apresentaram os seguintes valores D: 190/10 sccm (6,41 min), 180/20 sccm (6,47 min) e 160/40 sccm (4,02 min), a 100 W e 190/10 sccm (1,47 min), 180/20 sccm (3,11 min) e 160/40 sccm (1,94 min), a 150 W. Processos empregando óxido de etileno apresentaram valor D de 2,86 minutos. Análises por Microscopia Eletrônica de Varredura demonstraram danos causados ao córtex dos esporos. Sistema empregando plasma como principal agente de esterilização apresentou-se efetivo em desafios com indicadores biológicos. Os processos por plasma provaram ser a mais apropriada tecnologia de esterilização de materias termossensíveis e com grande potencial para substituir os métodos convencionais de esterilização em futuro próximo. / Studies involving new sterilization techniques have increased in the past few years as alternatives to conventional processes. The great possibility consists in the use of plasma as sterilization agent. This technology has the enormous potential to develop a more efficient and safer means of sterilization at thermo-sensitive matters, focusing the pharmaceutical and medical industry - even though it can be applied to other industrial areas. The aim of the present study was to investigate the influence at some parameters of plasma processes and correlate the effectiveness plasma with ethylene oxide sterilizer. In this work, studies were performed taking into account a plasma sterilization technology using a Reactive Ion Etching (RIE) reactor. Power was applied at 13.56 MHz using a 6 inch diameter electrode. The gases tested were pure oxygen and oxygen-hydrogen peroxide mixtures (190/10, 180/20, and 160/40 sccm), and gas flow held constant 200 sccm, pressure at 0.100 torr and radio-frequency power at 25 W, 50 W, 100 W, and 150 W and temperature below 60°C. Ethylene oxide sterilizer were performed using 450 mg/L (Oxyfume 2002®) at 55°C, 60% humidity and -0.65 and 0.60 kgf/cm2 pressure. The biological indicator used was Bacillus subtilis var. niger ATCC 9372, witch was inoculated in glass carries (18 x 18 mm) and paper discs (13 mm diameter) in a load of 2.0 x 107 CFU/support. The exposition times were 3 to 120 minutes. Progressive reductions of the initial microbial count could be observed in the D values witch were 215.91, 55.55, 9.19, and 2.91 minutes for pure oxygen plasma at 25 W, 50 W, 100 W and 150 W, respectively. Oxygen-hydrogen peroxide mixtures plasma showed D values: 190/10 sccm (6.41 min), 180/20 sccm (6.47 min) and 160/40 sccm (4.02 min) at 100 W and 190/10 sccm (1.47 min), 180/20 sccm (3.11 min) and 160/40 sccm (1.94 min) at 150 W. Ethylene oxide processes showed D value to 2.86 minutes. Scanning Electron Microscopy analyses showed some damage on the spore cortex. Processes using plasma as main sterilization agent are presented effective in challenge with biological indicators. The plasma proved to be the most appropriate sterilization technology in thermosensitive matters and to have a great potential to replace conventional sterilization methods in the near future.

A Proteína Verde Fluorescente recombinante, GFPuv, é um sistema marcador atrativo pois, sua presença pode ser visualizada através da intensidade de fluorescência emitida, sem o uso de substratos ou meios complexos. Sendo uma molécula estável à presença de substâncias orgânicas, temperaturas acima de 70°C e ampla faixa de pH, é um potencial Indicador Biológico (IH) para diversas aplicações. A estabilidade térmica da GFPuv, foi avaliada pela medida da perda de intensidade de fluorescência, expressa em valores D (min), tempo de exposição necessário para redução de 90% da intensidade de fluorescência inicial da GFPuv. GFPuv (3,5-9,0 µg/mL), expressa por E. coli e isolada por extração de Partição em Três Fases (TPP) e purificação por Cromatografia de Interação Hidrofóbica (IDC), foi diluída nas soluções parenterais preparadas em tampão (10 mM cada: Tris-EDTA, pH 8; Fosfato, pH 6 e 7, e Acetato, pH 5) e em água para injeção, WFI; pH = 6,70±0,40), e expostas a temperaturas de 25°C e ao intervalo entre 80°C e 100°C. A 95°C, os valores D para a GFPuv em soluções de 1,5% a 50% de glicose variaram de: (i) 1,63 (±0,23) min em acetato pH 5; (ii) 2,64 ± 0,26 min em WFI; (iii) 2,50 ± 0,18 min em fosfato pH 6; (iv) 3,24 ± 0,28 min em fosfato pH 7 e, (v) 2,89 ± 0,44 min em Tris-EDTA pH 8. Cloreto de sódio associado aos tampões proporcionou influência positiva na estabilidade da GFPuv, sendo que em soluções de Tris-EDTA, a adição de 15-20% de NaCl dobrou a estabilidade térmica da GFPuv (valores D de 65,79 min e 18,12 min a 80 °C e 85°C) em relação à solução sem cloreto de sódio. Nos processos de esterilização por óxido de etileno (45°C-60°C), a GFPuv pode ser utilizada como IB para monitorar a distribuição de gás dentro da câmara, pois, apresentou variação na concentração remanescente de até 80%, após processamento, estabelecendo áreas distintas dentro da câmara. No tratamento em autoclave, a GFPuv em solução apresentou resistência térmica em solução de fosfato pH 7,0 (valor F = 2,53 min (± 0,12)). Quando expressa por esporos de Bacillus subtilis, a intensidade de fluorescência emitida por esporos sobreviventes se manteve. A estabilidade térmica da GFPuv atestou sua potencialidade como indicador biológico fluorescente da garantia da eficácia de tratamento de soluções e materiais expostos ao calor. / The recombinant Green Fluorescent Protein, GFPuv is an attractive system marker due to its ability to emit fluorescence when exposed to ultraviolet light, without use of substrates or complex environment. Being a stable molecule even in the presence of organic substances, temperatures above 70°C and wide range of pH, it is a potential Biological Indicator, BI, for many applications, including thermal processes. GFPuv thermal stability was evaluated by the loss of fluorescence intensity expressed in decimal reduction time (D-value, min), the exposure time required to reduce 90% of the GFPuv initial fluorescence intensity. GFPuv (3.5-9.0 µg/mL), expressed by E. coli and isolated by Three Phases Partitioning, TPP extraction with Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC, was diluted in buffered solutions (each 10 mM: Tris-EDTA, pH 8; phosphate, pH 6 and 7, and acetate, pH 5) and in water for injection, WFI; pH = 6.70 (± 0.40), and exposed to temperatures of 25°C and between 80°C and 95°C. At 95°C, the D-value for GFPuv in 1.5%-50% glucose, ranged from: (i) 1.63 ± 0.23 min in acetate pH 5; (ii) 2.64 ± 0.26 min in WFI; (iii) 2.50 ± 0.18 min in phosphate, pH 6; (iv) 3.24 ± 0.28 min in phosphate, pH 7, (v) 2.89 ± 0.44 min in Tris-EDTA, pH 8. Sodium cloride provided a positive influence over GFPuv stability. In Tris-EDTA solutions, the addition of 15% and 20% of NaCl doubled the thermal stability of GFPuv (D = 65.79 min and D = 18.12 min at 80°C, and 85°C, respectively, in relation to the solutions without NaCl. For ethylene oxide sterilization processes (45°C-60°C), GFPuv can be used as biological indicator to monitor gas distribution into the chamber. After processing, the protein concentration varied by 80%, showing distinct areas into the chamber. In autoclave, GFPuv in solution showed thermal resistance in phosphate pH 7.0 solution (F-value = 2.53 (± 0.12) min. When expressed by Bacillus subtilis spores, the fluorescence intensity was kept constant after thermal processing. The thermal stability of GFPuv provides the basis for its potential utility as a fluorescent biological indicator to assess the efficacy of the treatment of liquids and materials exposed to steam.

A Proteína Verde Fluorescente recombinante, GFPuv, é um sistema marcador atrativo pois, sua presença pode ser visualizada através da intensidade de fluorescência emitida, sem o uso de substratos ou meios complexos. Sendo uma molécula estável à presença de substâncias orgânicas, temperaturas acima de 70°C e ampla faixa de pH, é um potencial Indicador Biológico (IH) para diversas aplicações. A estabilidade térmica da GFPuv, foi avaliada pela medida da perda de intensidade de fluorescência, expressa em valores D (min), tempo de exposição necessário para redução de 90% da intensidade de fluorescência inicial da GFPuv. GFPuv (3,5-9,0 µg/mL), expressa por E. coli e isolada por extração de Partição em Três Fases (TPP) e purificação por Cromatografia de Interação Hidrofóbica (IDC), foi diluída nas soluções parenterais preparadas em tampão (10 mM cada: Tris-EDTA, pH 8; Fosfato, pH 6 e 7, e Acetato, pH 5) e em água para injeção, WFI; pH = 6,70±0,40), e expostas a temperaturas de 25°C e ao intervalo entre 80°C e 100°C. A 95°C, os valores D para a GFPuv em soluções de 1,5% a 50% de glicose variaram de: (i) 1,63 (±0,23) min em acetato pH 5; (ii) 2,64 ± 0,26 min em WFI; (iii) 2,50 ± 0,18 min em fosfato pH 6; (iv) 3,24 ± 0,28 min em fosfato pH 7 e, (v) 2,89 ± 0,44 min em Tris-EDTA pH 8. Cloreto de sódio associado aos tampões proporcionou influência positiva na estabilidade da GFPuv, sendo que em soluções de Tris-EDTA, a adição de 15-20% de NaCl dobrou a estabilidade térmica da GFPuv (valores D de 65,79 min e 18,12 min a 80 °C e 85°C) em relação à solução sem cloreto de sódio. Nos processos de esterilização por óxido de etileno (45°C-60°C), a GFPuv pode ser utilizada como IB para monitorar a distribuição de gás dentro da câmara, pois, apresentou variação na concentração remanescente de até 80%, após processamento, estabelecendo áreas distintas dentro da câmara. No tratamento em autoclave, a GFPuv em solução apresentou resistência térmica em solução de fosfato pH 7,0 (valor F = 2,53 min (± 0,12)). Quando expressa por esporos de Bacillus subtilis, a intensidade de fluorescência emitida por esporos sobreviventes se manteve. A estabilidade térmica da GFPuv atestou sua potencialidade como indicador biológico fluorescente da garantia da eficácia de tratamento de soluções e materiais expostos ao calor. / The recombinant Green Fluorescent Protein, GFPuv is an attractive system marker due to its ability to emit fluorescence when exposed to ultraviolet light, without use of substrates or complex environment. Being a stable molecule even in the presence of organic substances, temperatures above 70°C and wide range of pH, it is a potential Biological Indicator, BI, for many applications, including thermal processes. GFPuv thermal stability was evaluated by the loss of fluorescence intensity expressed in decimal reduction time (D-value, min), the exposure time required to reduce 90% of the GFPuv initial fluorescence intensity. GFPuv (3.5-9.0 µg/mL), expressed by E. coli and isolated by Three Phases Partitioning, TPP extraction with Hidrophobic Interaction Chromatography, HIC, was diluted in buffered solutions (each 10 mM: Tris-EDTA, pH 8; phosphate, pH 6 and 7, and acetate, pH 5) and in water for injection, WFI; pH = 6.70 (± 0.40), and exposed to temperatures of 25°C and between 80°C and 95°C. At 95°C, the D-value for GFPuv in 1.5%-50% glucose, ranged from: (i) 1.63 ± 0.23 min in acetate pH 5; (ii) 2.64 ± 0.26 min in WFI; (iii) 2.50 ± 0.18 min in phosphate, pH 6; (iv) 3.24 ± 0.28 min in phosphate, pH 7, (v) 2.89 ± 0.44 min in Tris-EDTA, pH 8. Sodium cloride provided a positive influence over GFPuv stability. In Tris-EDTA solutions, the addition of 15% and 20% of NaCl doubled the thermal stability of GFPuv (D = 65.79 min and D = 18.12 min at 80°C, and 85°C, respectively, in relation to the solutions without NaCl. For ethylene oxide sterilization processes (45°C-60°C), GFPuv can be used as biological indicator to monitor gas distribution into the chamber. After processing, the protein concentration varied by 80%, showing distinct areas into the chamber. In autoclave, GFPuv in solution showed thermal resistance in phosphate pH 7.0 solution (F-value = 2.53 (± 0.12) min. When expressed by Bacillus subtilis spores, the fluorescence intensity was kept constant after thermal processing. The thermal stability of GFPuv provides the basis for its potential utility as a fluorescent biological indicator to assess the efficacy of the treatment of liquids and materials exposed to steam.