Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Advances in biotechnology have provided possibilities to the performance of large-scale of biomolecules and therefore of their industrial applications. Escherichia coli stands out among microorganisms that act as host genes, functioning as a synthetic protein. The most useful vectors for the production of recombinant proteins in E. coli are based on the operon lac, where isopropyl β-D1-thiogalactopyroside (IPTG), analogous to lactose, is used to induce the production of proteins of interest. Studies in the literature have also observed the good performance of lactose as an inducer of recombinant E. coli in the expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and its advantages when compared to IPTG, such as lower cost and toxicity. EGFP becomes promising because it is monomeric and does not need to help the main agents for fluorescence activity. It has several uses in the biological field as an excellent biomarker of gene expression and biosensor. In bioprocesses, operated in conventional bioreactors, it is fundamental to study the interfering parameters in the cultures to optimize the expression of the desired product. Oxygenation in aerobically conducted processes is also a challenging task in conventional bioreactors, with control of the concentration of dissolved oxygen in the culture medium is essential, which may be limiting for growth and expression of the protein of interest. In processes of production of heterologous proteins, it is assumed that the productiv... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A avaliação da estabilidade dos medicamentos e sua correta utilização em diferentes veículos de infusão são fundamentais para garantir a manutenção das características terapêuticas do fármaco e para promover minimização de eventos adversos. Incompatibilidades entre as estruturas dos fármacos, em diferentes veículos de administração, podem gerar possíveis associações antagônicas ou sinérgicas, resultando em alterações das propriedades físico-químicas e, consequentemente, dos efeitos farmacológicos e das respostas clínicas esperadas. A proteína verde fluorescente (GFP) por apresentar propriedades de sensibilidade e especificidade, mostra-se promissora como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais de grande volume (SPGV), por apresentar sensibilidade a alterações das propriedades físico-químicas do meio. GFP é uma proteína compacta, globular e ácida, composta de um monômero de 27kDa, que vem sendo extensivamente utilizada como indicador biológico em processos de esterilização e desinfecção devido a sua estabilidade a altas temperaturas. O surgimento de métodos analíticos modernos e de alta precisão como a espectrofotometria de UV e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), alinhados a potencial utilização das proteínas fluorescentes como forma de avaliar as alterações da estabilidade de fármacos nas SPGV, vêm contribuir para a correta e racional utilização dos medicamentos no ambiente hospitalar. Diante disso a avaliação da estabilidade do coquetel de fármacos composto por furosemida e aminofilina em solução parenteral de 20% manitol e 0,9% NaCl foi sugerida. Amostras foram preparadas nas seguintes soluções (v/v): 20% manitol ou 0,9% NaCl na seguintes proporções utilizadas frequentemente na prática clínica: (i) 80% solução parenteral adicionada de 16% furosemida e 4% água para injeção (excipiente do fármaco aminofilina), (ii) 80% solução parenteral adicionada de 4% aminofilina e 16% água para injeção + NaOH (excipiente do fármaco furosemida), (iii) 80% solução parenteral, adicionada de 16% furosemida e 4% aminofilina (coquetel). As amostras foram avaliadas em espectrofotômetro imediatamente após o preparo e após um período 20h, em y=228nm e y=275nm para os fármacos furosemida e aminofilina, respectivamente. Para os fármacos individualmente associados às SPGV na faixa de pH 10-11, as concentrações finais obtidas foram correspondente ás inicialmente adicionadas e para o fármaco aminofilina foi estável até o período de 20h. Para avaliar a estabilidade dos fármacos associados à solução de 20% manitol a utilização de HPLC mostrou manutenção da estabilidade dos fármacos durante o período de infusão de até 20h. A proteína GFP adicionada as soluções das amostras na concentração 8?g/mL e determinada em espectrofluorímetro (yex=394nm, yem=509nm), mostrou resultados promissores quanto ao sua potencial utilização como biossensor da estabilidade dos fármacos furosemida e aminofilina nas soluções parenterais, mostrando comportamento de concentração e intensidade de fluorescência característicos e proporcionais a perda da estabilidade das soluções. A utilização de proteínas fluorescentes como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais é importante por fornecer parâmetros que garantam a eficácia dos medicamentos veiculados em soluções parenterais, racionalizando a sua utilização no ambiente hospitalar. / Parenteral solutions (PS) are used as vehicles in drugs administration to the organism. The development of analytical techniques that enables the detection of incompatibilities between drugs and PS is mandatory to guarantee their correct association with minimum adverse events. Incompatibilities of drugs in different infusion vehicles change according to physical-chemical properties of solutions, because of the molecular structure, chemical compounds used for preservation and stability of PS components. This fact can promote antagonic or synergic effects with loss of clinical response. The green fluorescent protein (GFP) is compact, globular, and acidic, with 27KDa and has been used as a biologic indicator of sterilization and disinfection process because it is easily detected using UV light, spectrofluorometry, with high thermal stability. GFP specificity and sensibility to physical-chemical changes in the media favors its use as a biosensor for drugs stability in parenteral solutions. The development of analytical methods such as spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) in association with the fluorescent properties of some proteins enable the detection of potential incompatibilities between drugs and parenteral solutions, promoting a rational utilization of drugs in hospital. The evaluation of a diuretic cocktail with furosemide and aminophylline administrated in parenteral solutions of 20% mannitol and 0.9% NaCl was studied. Samples were prepared either in 20% mannitol or 0.9 % NaCl (PS), as follows: (i) 80% parenteral solution added with 16% furosemide and 4% WFI (solvent for aminophylline), (ii) 80% parenteral solution 4% aminophylline and 16% WFI+NaOH (pH 9-10, solvent for furosemide), (iii) 80% parenteral solution, added with 16% furosemide and 4% aminophylline (cocktail). Samples were diluted and prepared in a pH range of 6.5-7.5 and pH 10-11 for aminophylline and furosemide, individually and associated. The samples were prepared with PS including the excipients used in the drugs formulations. The absorbance was determined immediately after preparation and after 20 hours at 25°C and y= 228 nm, 275 nm, respectively for furosemide and aminophylline. GFP stability was determined in a spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm) by adding 8 µg/mL of the purified protein in a 3.0mL sample (25°C) and the fluorescence intensity was evaluated after 20 hours. For both drugs in parenteral solutions (pH 10-11) the final concentrations observed were similar to the expected, aminophylline was also stable after 20h. When both drugs were associated in parenteral solutions of 20% mannitol, the use of HPLC showed stability for both drugs in the first 20h. The fluorescence intensity of GFP added to the samples was determined in spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm), showing that fluorescence intensity was proportional to the drugs stability loss. Therefore, the utilization of fluorescence proteins is important to assure the drugs effectiveness and rational utilization in hospital places.

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

A avaliação da estabilidade dos medicamentos e sua correta utilização em diferentes veículos de infusão são fundamentais para garantir a manutenção das características terapêuticas do fármaco e para promover minimização de eventos adversos. Incompatibilidades entre as estruturas dos fármacos, em diferentes veículos de administração, podem gerar possíveis associações antagônicas ou sinérgicas, resultando em alterações das propriedades físico-químicas e, consequentemente, dos efeitos farmacológicos e das respostas clínicas esperadas. A proteína verde fluorescente (GFP) por apresentar propriedades de sensibilidade e especificidade, mostra-se promissora como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais de grande volume (SPGV), por apresentar sensibilidade a alterações das propriedades físico-químicas do meio. GFP é uma proteína compacta, globular e ácida, composta de um monômero de 27kDa, que vem sendo extensivamente utilizada como indicador biológico em processos de esterilização e desinfecção devido a sua estabilidade a altas temperaturas. O surgimento de métodos analíticos modernos e de alta precisão como a espectrofotometria de UV e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), alinhados a potencial utilização das proteínas fluorescentes como forma de avaliar as alterações da estabilidade de fármacos nas SPGV, vêm contribuir para a correta e racional utilização dos medicamentos no ambiente hospitalar. Diante disso a avaliação da estabilidade do coquetel de fármacos composto por furosemida e aminofilina em solução parenteral de 20% manitol e 0,9% NaCl foi sugerida. Amostras foram preparadas nas seguintes soluções (v/v): 20% manitol ou 0,9% NaCl na seguintes proporções utilizadas frequentemente na prática clínica: (i) 80% solução parenteral adicionada de 16% furosemida e 4% água para injeção (excipiente do fármaco aminofilina), (ii) 80% solução parenteral adicionada de 4% aminofilina e 16% água para injeção + NaOH (excipiente do fármaco furosemida), (iii) 80% solução parenteral, adicionada de 16% furosemida e 4% aminofilina (coquetel). As amostras foram avaliadas em espectrofotômetro imediatamente após o preparo e após um período 20h, em y=228nm e y=275nm para os fármacos furosemida e aminofilina, respectivamente. Para os fármacos individualmente associados às SPGV na faixa de pH 10-11, as concentrações finais obtidas foram correspondente ás inicialmente adicionadas e para o fármaco aminofilina foi estável até o período de 20h. Para avaliar a estabilidade dos fármacos associados à solução de 20% manitol a utilização de HPLC mostrou manutenção da estabilidade dos fármacos durante o período de infusão de até 20h. A proteína GFP adicionada as soluções das amostras na concentração 8?g/mL e determinada em espectrofluorímetro (yex=394nm, yem=509nm), mostrou resultados promissores quanto ao sua potencial utilização como biossensor da estabilidade dos fármacos furosemida e aminofilina nas soluções parenterais, mostrando comportamento de concentração e intensidade de fluorescência característicos e proporcionais a perda da estabilidade das soluções. A utilização de proteínas fluorescentes como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais é importante por fornecer parâmetros que garantam a eficácia dos medicamentos veiculados em soluções parenterais, racionalizando a sua utilização no ambiente hospitalar. / Parenteral solutions (PS) are used as vehicles in drugs administration to the organism. The development of analytical techniques that enables the detection of incompatibilities between drugs and PS is mandatory to guarantee their correct association with minimum adverse events. Incompatibilities of drugs in different infusion vehicles change according to physical-chemical properties of solutions, because of the molecular structure, chemical compounds used for preservation and stability of PS components. This fact can promote antagonic or synergic effects with loss of clinical response. The green fluorescent protein (GFP) is compact, globular, and acidic, with 27KDa and has been used as a biologic indicator of sterilization and disinfection process because it is easily detected using UV light, spectrofluorometry, with high thermal stability. GFP specificity and sensibility to physical-chemical changes in the media favors its use as a biosensor for drugs stability in parenteral solutions. The development of analytical methods such as spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) in association with the fluorescent properties of some proteins enable the detection of potential incompatibilities between drugs and parenteral solutions, promoting a rational utilization of drugs in hospital. The evaluation of a diuretic cocktail with furosemide and aminophylline administrated in parenteral solutions of 20% mannitol and 0.9% NaCl was studied. Samples were prepared either in 20% mannitol or 0.9 % NaCl (PS), as follows: (i) 80% parenteral solution added with 16% furosemide and 4% WFI (solvent for aminophylline), (ii) 80% parenteral solution 4% aminophylline and 16% WFI+NaOH (pH 9-10, solvent for furosemide), (iii) 80% parenteral solution, added with 16% furosemide and 4% aminophylline (cocktail). Samples were diluted and prepared in a pH range of 6.5-7.5 and pH 10-11 for aminophylline and furosemide, individually and associated. The samples were prepared with PS including the excipients used in the drugs formulations. The absorbance was determined immediately after preparation and after 20 hours at 25°C and y= 228 nm, 275 nm, respectively for furosemide and aminophylline. GFP stability was determined in a spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm) by adding 8 µg/mL of the purified protein in a 3.0mL sample (25°C) and the fluorescence intensity was evaluated after 20 hours. For both drugs in parenteral solutions (pH 10-11) the final concentrations observed were similar to the expected, aminophylline was also stable after 20h. When both drugs were associated in parenteral solutions of 20% mannitol, the use of HPLC showed stability for both drugs in the first 20h. The fluorescence intensity of GFP added to the samples was determined in spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm), showing that fluorescence intensity was proportional to the drugs stability loss. Therefore, the utilization of fluorescence proteins is important to assure the drugs effectiveness and rational utilization in hospital places.

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

El aumento de la actividad minera en el Perú hace necesario el desarrollo de tecnologías rápidas y económicas de detección de contaminantes para su monitoreo y control. Implementando conocimientos de biología molecular y de la regulación génica podemos construir un circuito genético sintético que posibilite el monitoreo de sustancia toxicas que generen estrés oxidativo como son los compuestos cianurados. El objetivo de esta investigación es desarrollar un circuito genético sintético conformado por el promotor de la proteína del shock por fagos (psp) de Escherichia coli y las secuencia codificante del gen de la proteína verde fluorescente (GFP). La construcción de dicho circuito se logró usando estrategias de clonamiento por topoisomerasas y clonamiento clásico con enzimas de restricción, se usó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar que todos los segmentos del circuito estén presentes en el vector. Los estudios preliminares de la actividad del nuevo circuito se realizaron transformando genéticamente células competentes de E. coli. La observación de dichas bacterias muestra una expresión de GFP continua, lo que indica que el circuito sintético está siendo activado sin estar en presencia de agentes de estrés oxidativo, lo que suponía una posible interacción con otros sistemas de regulación de estrés en la célula. Due to the increase of mining activity in Peru new technologies that can detect and monitor hazardous pollutants in a faster and cheaper way must be developed. Implementing molecular biology knowledge about genetic regulation we are able to construct a synthetic genetic circuit that can allow the monitoring of toxic substances that generate oxidative stress such us cyanide compounds. The objective of this research is to develop a synthetic genetic circuit from the promoter of the phage shock protein operon from E. coli and the complementary DNA of the green fluorescent gene (GFP). The construction of the circuit was achieved using classic cloning strategies with restriction enzymes and also more advanced strategies such us topoisomerase cloning, the polymerase chain reaction (PCR) was used to confirm the presence of all the desire segments in the vector. Preliminary studies of the circuit activity were carried out by genetically transforming competent E. coli cells. The observation of the bacteria shows a continuous expression of GFP without any inducer, this indicates that the synthetic circuit is being activated through a possible interaction with other stress response pathway.

Em 1978, o trabalho realizado por Stephenson e Zamecnik demonstrou a capacidade de um oligonucleotídeo de impedir a expressão de uma proteína específica. Atualmente, duas tecnologias são mais utilizadas para este propósito: os oligodeoxiribonucleotídeos antisense e o RNA de interferência (siRNA), que se aproveitam da capacidade de anelação entre as fitas complementares. A maior diferença entre as duas técnicas é a maquinaria proteica recrutada, isso é, o complexo RISC atua no funcionamento do siRNA, e a protease RNase H atua na clivagem da fita de RNA quando hibridizada com DNA. Apesar da grande aplicabilidade destas tecnologias, tanto para doenças metabólicas quanto para canceres, o veículo de entrega e proteção dessas sequências é de fundamental importância, visto que a aplicação desses oligonucleotídeos livres está sujeita à rápida degradação e ineficiência. A modificação das bases é uma das estratégias para conferir maior estabilidade às sequências, porém estas tem sido relacionadas a um aumento da toxicidade. Nessa dissertação, a quitosana, um polissacarídeo catiônico é utilizado para síntese de nanopartículas e encapsulamento dos oligodeoxiribonucleotídeos antisense (ASO). Para isso, foram realizadas modificações na quitosana comercial como despolimerização, trimetilação ou conjugação com PEG, seguida da síntese das nanopartículas com a adição de tripolifosfato de sódio (TPP) pelo método de gelatinização ionotrópica. A estabilidade das nanopartículas foi medida em função do tempo, da variação de temperatura e da diferença de pH. Além disso, a toxicidade dessas nanopartículas foi analisada através da viabilidade celular em diferentes linhagens, NB-4, HepaRG, HTC e BHK-570. A expressão da proteína verde fluorescente (GFP) na célula NB-4 foi utilizada para avaliar a entrega do ASO desenhado, sendo sua fluorescência monitorada por microscopia confocal. Os resultados demonstram que as nanopartículas se mantiveram estáveis durante o período de tempo analisado, assim como com a temperatura variando de 22 a 45°C e em pH ácido. Cada linhagem celular respondeu de forma diferente ao tratamento com as nanopartículas sem ASO, sendo a linhagem saudável BHK-570 com a maior resistência. Ademais, todas as células apresentaram viabilidade reduzida quando tratadas com concentrações na ordem de 1011 nanopartículas/mL a base de quitosana trimetilada. A fluorescência das células NB-4 quando tratada com as nanopartículas com ASO diminuiu consideravelmente nas 18 primeiras horas, seguida de um aumento após 42 horas. Dessa forma, pode-se concluir que as nanopartículas de quitosana propostas nessa dissertação apresentaram uma excelente alternativa para a entrega de material genético, principalmente para o trato gastro-intestinal, devido à sua estabilidade em pH ácido. / The property of an oligonucleotide to interfere in the expression of a protein was observed in 1978 by Stephenson and Zamecnik. To perform such interference, there are today, two main techniques being explored: antisense oligodeoxyribonucleotides and interference RNA. In both cases, the particularity of their chemical structure is taken into account as soon as they can bind in a complementary manner to the messenger RNA and inhibit its translation. The great difference between these techniques is related to the proteases involved in the process, while for interference RNA the RISC machinery acts, for antisense oligodeoxyribonucleotides RNase H cleaves the RNA in the duplex DNA-RNA. Although these tools to edit the translation process are relevant to the treatment and even cure of metabolic disorders and cancers, it is still not effective when employed without a coating to protect the sequences before it reaches the destiny in vivo. Efforts have been made in developing modified bases to be more stable, but they show some toxicity. In this dissertation, chitosan, a natural cationic polyssacharide, is used to produce nanoparticles to protect the antisense oligodeoxyribonucleotide (ASO). For this reason, the commercial chitosan was modified, depolymerized, trimetilated or PEGlated and the nanoparticles were synthesized with sodium tripolyphosphate (TPP) by ionotropic gelation method. The stability along time, in different pHs and temperatures was assessed. The toxicity of nanoparticles without ASO was quantified by MTT tests in NB-4, HepaRG, HTC and BHK-570 cell lines. A green fluorescent protein (GFP) expressed by NB-4 cells was the target to evaluate the delivery efficiency of the ASO, and its fluorescence was measured by confocal microscopy. Results showed that nanoparticles were stable over time as well as in temperatures ranging from 22 to 45°C and in acidic pH. Each cell line responded in a different manner to the treatment, with the health cell BHK-570 showing higher resistance. Furthermore, all of them presented lower viability when treated with trimetilated chitosan nanoparticles in the highest concentrations (ca 1011 nanoparticles/mL). NB-4 cells presented a decrease in fluorescence in 18 hours of treatment followed by an increase after 42 hours. We conclude that chitosan nanoparticles are a good alternative to the delivery of genetic material even more in the gastro intestinal tract due to its great stability in acid pH values.

Em 1978, o trabalho realizado por Stephenson e Zamecnik demonstrou a capacidade de um oligonucleotídeo de impedir a expressão de uma proteína específica. Atualmente, duas tecnologias são mais utilizadas para este propósito: os oligodeoxiribonucleotídeos antisense e o RNA de interferência (siRNA), que se aproveitam da capacidade de anelação entre as fitas complementares. A maior diferença entre as duas técnicas é a maquinaria proteica recrutada, isso é, o complexo RISC atua no funcionamento do siRNA, e a protease RNase H atua na clivagem da fita de RNA quando hibridizada com DNA. Apesar da grande aplicabilidade destas tecnologias, tanto para doenças metabólicas quanto para canceres, o veículo de entrega e proteção dessas sequências é de fundamental importância, visto que a aplicação desses oligonucleotídeos livres está sujeita à rápida degradação e ineficiência. A modificação das bases é uma das estratégias para conferir maior estabilidade às sequências, porém estas tem sido relacionadas a um aumento da toxicidade. Nessa dissertação, a quitosana, um polissacarídeo catiônico é utilizado para síntese de nanopartículas e encapsulamento dos oligodeoxiribonucleotídeos antisense (ASO). Para isso, foram realizadas modificações na quitosana comercial como despolimerização, trimetilação ou conjugação com PEG, seguida da síntese das nanopartículas com a adição de tripolifosfato de sódio (TPP) pelo método de gelatinização ionotrópica. A estabilidade das nanopartículas foi medida em função do tempo, da variação de temperatura e da diferença de pH. Além disso, a toxicidade dessas nanopartículas foi analisada através da viabilidade celular em diferentes linhagens, NB-4, HepaRG, HTC e BHK-570. A expressão da proteína verde fluorescente (GFP) na célula NB-4 foi utilizada para avaliar a entrega do ASO desenhado, sendo sua fluorescência monitorada por microscopia confocal. Os resultados demonstram que as nanopartículas se mantiveram estáveis durante o período de tempo analisado, assim como com a temperatura variando de 22 a 45°C e em pH ácido. Cada linhagem celular respondeu de forma diferente ao tratamento com as nanopartículas sem ASO, sendo a linhagem saudável BHK-570 com a maior resistência. Ademais, todas as células apresentaram viabilidade reduzida quando tratadas com concentrações na ordem de 1011 nanopartículas/mL a base de quitosana trimetilada. A fluorescência das células NB-4 quando tratada com as nanopartículas com ASO diminuiu consideravelmente nas 18 primeiras horas, seguida de um aumento após 42 horas. Dessa forma, pode-se concluir que as nanopartículas de quitosana propostas nessa dissertação apresentaram uma excelente alternativa para a entrega de material genético, principalmente para o trato gastro-intestinal, devido à sua estabilidade em pH ácido. / The property of an oligonucleotide to interfere in the expression of a protein was observed in 1978 by Stephenson and Zamecnik. To perform such interference, there are today, two main techniques being explored: antisense oligodeoxyribonucleotides and interference RNA. In both cases, the particularity of their chemical structure is taken into account as soon as they can bind in a complementary manner to the messenger RNA and inhibit its translation. The great difference between these techniques is related to the proteases involved in the process, while for interference RNA the RISC machinery acts, for antisense oligodeoxyribonucleotides RNase H cleaves the RNA in the duplex DNA-RNA. Although these tools to edit the translation process are relevant to the treatment and even cure of metabolic disorders and cancers, it is still not effective when employed without a coating to protect the sequences before it reaches the destiny in vivo. Efforts have been made in developing modified bases to be more stable, but they show some toxicity. In this dissertation, chitosan, a natural cationic polyssacharide, is used to produce nanoparticles to protect the antisense oligodeoxyribonucleotide (ASO). For this reason, the commercial chitosan was modified, depolymerized, trimetilated or PEGlated and the nanoparticles were synthesized with sodium tripolyphosphate (TPP) by ionotropic gelation method. The stability along time, in different pHs and temperatures was assessed. The toxicity of nanoparticles without ASO was quantified by MTT tests in NB-4, HepaRG, HTC and BHK-570 cell lines. A green fluorescent protein (GFP) expressed by NB-4 cells was the target to evaluate the delivery efficiency of the ASO, and its fluorescence was measured by confocal microscopy. Results showed that nanoparticles were stable over time as well as in temperatures ranging from 22 to 45°C and in acidic pH. Each cell line responded in a different manner to the treatment, with the health cell BHK-570 showing higher resistance. Furthermore, all of them presented lower viability when treated with trimetilated chitosan nanoparticles in the highest concentrations (ca 1011 nanoparticles/mL). NB-4 cells presented a decrease in fluorescence in 18 hours of treatment followed by an increase after 42 hours. We conclude that chitosan nanoparticles are a good alternative to the delivery of genetic material even more in the gastro intestinal tract due to its great stability in acid pH values.

Devido ao número crescente de surtos de infecção hospitalar, torna-se proeminente o estabelecimento de um programa de sanitização que liste os agentes químicos a serem empregados e o modo de aplicação mais efetivo. Processos de desinfecção também são relevantes em sistemas de tratamento de água (em indústrias farmacêuticas e centros de saúde) para que a qualidade da água seja assegurada e atenda os parâmetros estabelecidos, evitando proliferação microbiana. Validação da eficácia de descontaminação é uma tarefa ao mesmo tempo importante e desafiadora. Indicadores biológicos são sistemas ou moléculas que detectam atividade biológica, permitindo a validação de processos de descontaminação ou desinfecção. O indicador biológico pode ser uma suspensão de microrganismos específicos (sistema biológico) com resistência definida a um determinado processo de descontaminação. Enzimas e proteínas também têm sido empregadas como indicadores biológicos para avaliar a eficácia de processos industriais. A proteína verde fluorescente (GFP) tem sido sugerida como potencial indicador biológico para tratamentos de desinfecção, devido facilidade de sua detecção por espectrofluorimetria ou por inspeção visual. Para estudar e comparar o comportamento dos microrganismos selecionados e da GFP foram realizados ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) e tempo de redução decimal (valor D). A CIM capaz de reduzir o bioburden inicial (>8log10) foi: 59 - 156 mg/L- 3250 mg/mL de glutaraldeído, 39 - 246 mg/L de formaldeído, 43750 - 87500 mg/L de álcool etílico 1250 - 6250 mg/L de polivinilpirrolidona iodo, 150 - 4491 mg/L de compostos liberadores de cloro, 469 -2500 mg/L de peróxido de hidrogênio e 2310 - 18500 mg/L de ácido peracético. A. calcoaceticus apresentou resistência à maioria dos agentes químicos testados, seguido de E. cloacae e S. marcescens. No sistema de purificação de água os resultados para Pseudomonas aeruginosa foram: (i) 0,5% de ácido cítrico, D = 3,8 min; (ii) 0,5% de ácido clorídrico, D = 6,9 min; (iii) 70% álcool etílico, D = 9,7 min; (iv) 0,5% bissulfito de sódio, D = 5,3 min; (v) 0,4% de hidróxido de sódio, D = 14,2 min; (vi) 0,5% de hipoclorito de sódio, D = 7,9 min; (vii) mistura de peróxido de hidrogênio (2,2%) e ácido peracético (0,45%), D = 5,5 min. GFP testada frente a soluções cloradas (com diferentes valores de pH e concentração) resultou em diminuição da fluorescência, sendo mais evidente em concentrações de cloro maiores que 150 ppm, com valores D entre 1,3 - 1,7 min. Em soluções de cloro em tampão fosfato (pH=7,15±0,08), a proteína manteve sua estrutura em contato com soluções 52-94 ppm de cloro. Frente a 110 ppm de cloro a estabilidade da proteína foi reduzida 10 vezes. A proteína GFP se mostrou um marcador fluorescente apropriado para monitorar eficácia de desinfecção. Para ser empregada como indicador biológico a proteína deve ser purificada através de um método de fácil ampliação de escala e com boa relação custo benefício, com este intuito o sistema micelar de duas fases aquosas foi estudado, e a proteína GFP foi parcialmente recuperada do homogeneizado celular de E. coli, outros contaminantes presentes no meio foram removidos na mesma etapa. A demonstração de que é possível se extrair uma biomolécula alvo utilizando ligantes de afinidade representa um passo importante no desenvolvimento de um método eficaz de separação que poderá ser utilizado na purificação de outras biomoléculas. / Due to the growing number of outbreaks of infection in hospital and nurseries, it becomes essential to set up a sanitation program that indicates that the appropriate chemical agent was chosen for application in the most effective way. Disinfection processes are also relevant in water purification systems (in pharmaceutical industries and in health environments) to assure water quality, meeting ionic and organic chemical standards, and avoiding microbial proliferation. Validating the effectiveness of decontamination and disinfection is an important and often challenging task. A biological indicator is a system or a molecule that enables the detection of biological activity, and as such, permits the validation of decontamination or disinfection treatments. The biological indicator can be a specific microorganism suspension (microbiological test system) with a defined resistance to a particular decontamination treatment. Enzymes and proteins have also been used as biological indicators to evaluate the immediate efficacy of industrial procedures, such as blanching, pasteurization, and disinfection treatments, as well as to monitor the satisfactory preservation of a product subjected to disinfection or sterilization. Green fluorescent protein (GFP) has been proposed as an ideal choice for a protein-based biological indicator for use in the validation of decontamination or disinfection treatments. In order to study and compare microorganism (in hospital infections outbreaks and isolated from the water purification system) and protein behavior, microorganisms were submitted to minimal inhibitory concentration (CIM) and decimal reduction time determination (D value). The CIM intervals, which reduced bacteria populations over 8log10, were: 59 to 156 mg/L of quaternarium ammonium compounds (QACs); 63 to 10000 mg/L of chlorhexidine; 1375 to 3250 mg/L of glutaraldehyde; 39 to 246 mg/L of formaldehyde; 43750 to 87500 mg/L of ethanol; 1250 to 6250 mg/L of iodine in polyvinyl-pyrolidone complexes, 150 to 4491 mg/L of chlorine-releasing-agents (CRAs); 469 to 2500 mg/L of hydrogen peroxide; and, 2310 to 18500 mg/L of peracetic acid. Chlorhexidine showed non inhibitory activity over germinating spores. A. calcoaceticus showed resistance to the majority of the agents tested, followed by E. cloacae and S. marcescens. In the water purification system the results were for P. aeruginosa into: (i) 0.5% citric acid, D = 3.8 min; (ii) 0.5% hydrochloric acid, D = 6.9 min; (iii) 70% ethanol, D = 9.7 min; (iv) 0.5% sodium bisulfite, D = 5.3 min; (v) 0.4% sodium hydroxide, D = 14.2 min; (vi) 0.5% sodium hypochlorite, D = 7.9 min; (vii) mixture of hydrogen peroxide (2.2%) plus peracetic acid (0.45%), D = 5.5 min. GFP was challenged with chlorine solutions (different pH and chlorine concentrations) and its fluorescence decreased abruptly on contact with chlorine in concentrations greater than 150 ppm, with D-values between 1.3 min (147 ppm chlorine) and 1.7 min (183 ppm chlorine). In phosphate buffered chlorine solutions (pH=7.15±0.08), GFP maintained its structure between 52-94 ppm of chlorine, but protein stability decreased 10-fold when exposed to 110 ppm chlorine. GFP performed as a suitable fluorescent marker for monitoring disinfection effectiveness. To be used as a biological indicator GFP has to be purified through a potentially scalable and cost-effective way to purify the recombinant protein, produced by E. coli. The method studied was two-phase aqueous micellar system, and GFP was partially recovered from a clarified E. coli cell lysate. Other contaminating proteins were simultaneously removed. The demonstration of proof-ofprinciple of the direct affinity-enhanced extraction of CBM9-GFP from the cell lysate represents an important first step towards developing a cost-effective separation method for GFP, and more generally, for other proteins of interest.

Devido ao número crescente de surtos de infecção hospitalar, torna-se proeminente o estabelecimento de um programa de sanitização que liste os agentes químicos a serem empregados e o modo de aplicação mais efetivo. Processos de desinfecção também são relevantes em sistemas de tratamento de água (em indústrias farmacêuticas e centros de saúde) para que a qualidade da água seja assegurada e atenda os parâmetros estabelecidos, evitando proliferação microbiana. Validação da eficácia de descontaminação é uma tarefa ao mesmo tempo importante e desafiadora. Indicadores biológicos são sistemas ou moléculas que detectam atividade biológica, permitindo a validação de processos de descontaminação ou desinfecção. O indicador biológico pode ser uma suspensão de microrganismos específicos (sistema biológico) com resistência definida a um determinado processo de descontaminação. Enzimas e proteínas também têm sido empregadas como indicadores biológicos para avaliar a eficácia de processos industriais. A proteína verde fluorescente (GFP) tem sido sugerida como potencial indicador biológico para tratamentos de desinfecção, devido facilidade de sua detecção por espectrofluorimetria ou por inspeção visual. Para estudar e comparar o comportamento dos microrganismos selecionados e da GFP foram realizados ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) e tempo de redução decimal (valor D). A CIM capaz de reduzir o bioburden inicial (>8log10) foi: 59 - 156 mg/L- 3250 mg/mL de glutaraldeído, 39 - 246 mg/L de formaldeído, 43750 - 87500 mg/L de álcool etílico 1250 - 6250 mg/L de polivinilpirrolidona iodo, 150 - 4491 mg/L de compostos liberadores de cloro, 469 -2500 mg/L de peróxido de hidrogênio e 2310 - 18500 mg/L de ácido peracético. A. calcoaceticus apresentou resistência à maioria dos agentes químicos testados, seguido de E. cloacae e S. marcescens. No sistema de purificação de água os resultados para Pseudomonas aeruginosa foram: (i) 0,5% de ácido cítrico, D = 3,8 min; (ii) 0,5% de ácido clorídrico, D = 6,9 min; (iii) 70% álcool etílico, D = 9,7 min; (iv) 0,5% bissulfito de sódio, D = 5,3 min; (v) 0,4% de hidróxido de sódio, D = 14,2 min; (vi) 0,5% de hipoclorito de sódio, D = 7,9 min; (vii) mistura de peróxido de hidrogênio (2,2%) e ácido peracético (0,45%), D = 5,5 min. GFP testada frente a soluções cloradas (com diferentes valores de pH e concentração) resultou em diminuição da fluorescência, sendo mais evidente em concentrações de cloro maiores que 150 ppm, com valores D entre 1,3 - 1,7 min. Em soluções de cloro em tampão fosfato (pH=7,15±0,08), a proteína manteve sua estrutura em contato com soluções 52-94 ppm de cloro. Frente a 110 ppm de cloro a estabilidade da proteína foi reduzida 10 vezes. A proteína GFP se mostrou um marcador fluorescente apropriado para monitorar eficácia de desinfecção. Para ser empregada como indicador biológico a proteína deve ser purificada através de um método de fácil ampliação de escala e com boa relação custo benefício, com este intuito o sistema micelar de duas fases aquosas foi estudado, e a proteína GFP foi parcialmente recuperada do homogeneizado celular de E. coli, outros contaminantes presentes no meio foram removidos na mesma etapa. A demonstração de que é possível se extrair uma biomolécula alvo utilizando ligantes de afinidade representa um passo importante no desenvolvimento de um método eficaz de separação que poderá ser utilizado na purificação de outras biomoléculas. / Due to the growing number of outbreaks of infection in hospital and nurseries, it becomes essential to set up a sanitation program that indicates that the appropriate chemical agent was chosen for application in the most effective way. Disinfection processes are also relevant in water purification systems (in pharmaceutical industries and in health environments) to assure water quality, meeting ionic and organic chemical standards, and avoiding microbial proliferation. Validating the effectiveness of decontamination and disinfection is an important and often challenging task. A biological indicator is a system or a molecule that enables the detection of biological activity, and as such, permits the validation of decontamination or disinfection treatments. The biological indicator can be a specific microorganism suspension (microbiological test system) with a defined resistance to a particular decontamination treatment. Enzymes and proteins have also been used as biological indicators to evaluate the immediate efficacy of industrial procedures, such as blanching, pasteurization, and disinfection treatments, as well as to monitor the satisfactory preservation of a product subjected to disinfection or sterilization. Green fluorescent protein (GFP) has been proposed as an ideal choice for a protein-based biological indicator for use in the validation of decontamination or disinfection treatments. In order to study and compare microorganism (in hospital infections outbreaks and isolated from the water purification system) and protein behavior, microorganisms were submitted to minimal inhibitory concentration (CIM) and decimal reduction time determination (D value). The CIM intervals, which reduced bacteria populations over 8log10, were: 59 to 156 mg/L of quaternarium ammonium compounds (QACs); 63 to 10000 mg/L of chlorhexidine; 1375 to 3250 mg/L of glutaraldehyde; 39 to 246 mg/L of formaldehyde; 43750 to 87500 mg/L of ethanol; 1250 to 6250 mg/L of iodine in polyvinyl-pyrolidone complexes, 150 to 4491 mg/L of chlorine-releasing-agents (CRAs); 469 to 2500 mg/L of hydrogen peroxide; and, 2310 to 18500 mg/L of peracetic acid. Chlorhexidine showed non inhibitory activity over germinating spores. A. calcoaceticus showed resistance to the majority of the agents tested, followed by E. cloacae and S. marcescens. In the water purification system the results were for P. aeruginosa into: (i) 0.5% citric acid, D = 3.8 min; (ii) 0.5% hydrochloric acid, D = 6.9 min; (iii) 70% ethanol, D = 9.7 min; (iv) 0.5% sodium bisulfite, D = 5.3 min; (v) 0.4% sodium hydroxide, D = 14.2 min; (vi) 0.5% sodium hypochlorite, D = 7.9 min; (vii) mixture of hydrogen peroxide (2.2%) plus peracetic acid (0.45%), D = 5.5 min. GFP was challenged with chlorine solutions (different pH and chlorine concentrations) and its fluorescence decreased abruptly on contact with chlorine in concentrations greater than 150 ppm, with D-values between 1.3 min (147 ppm chlorine) and 1.7 min (183 ppm chlorine). In phosphate buffered chlorine solutions (pH=7.15±0.08), GFP maintained its structure between 52-94 ppm of chlorine, but protein stability decreased 10-fold when exposed to 110 ppm chlorine. GFP performed as a suitable fluorescent marker for monitoring disinfection effectiveness. To be used as a biological indicator GFP has to be purified through a potentially scalable and cost-effective way to purify the recombinant protein, produced by E. coli. The method studied was two-phase aqueous micellar system, and GFP was partially recovered from a clarified E. coli cell lysate. Other contaminating proteins were simultaneously removed. The demonstration of proof-ofprinciple of the direct affinity-enhanced extraction of CBM9-GFP from the cell lysate represents an important first step towards developing a cost-effective separation method for GFP, and more generally, for other proteins of interest.