The visualization of energy functions is based on the possibility of separating different degrees of freedom. The most important one is the Born-Oppenheimer-approximation, which separates nucleus and electron movements. This allows the illustration of the potential energy as a function of the nuclei coordinates. Minima of the surface correspond to stable points like isomers or conformers. They are important for predicting the stability or thermodynamical of a system. Stationary points of first order correspond to transition points. They describe phase transitions, chemical reaction, or conformational changes. Furthermore, the partition function connects the potential hypersurface to the free energy of the system. The aim of the present work is the development and application of new approaches for the efficient exploration of multidimensional hypersurfaces. Initially, the Conformational Analysis and Search Tool (CAST) program was developed to create a basis for the new methods and algorithms. The development of CAST in object oriented C++ included, among other things, the implementation of a force field, different interfaces to external programs, analysis tools, and optimization libraries. Descriptions of an energy landscape require knowledge about the most stable minima. The Gradient Only Tabu Search (GOTS) has been shown to be very efficient in the optimization of mathematical test functions. Therefore, GOTS was taken as a starting point. Tabu-Search is based on the steepest descent - modest ascent strategy. The steepest descent is used for finding local minima, while the modest ascent is taken for leaving a minimum quickly. Furthermore, Tabu-Search is combined with an adaptive memory design to avoid cycling or returning. The highly accurate exploration of the phase space by Tabu-Search is often too expensive for complex optimization problems. Therefore, an algorithm for diversification of the search is required. After exploration of the proximity of the search space, the algorithm would guide the search to new and hopefully promising parts of the phase space. First application of GOTS to conformational search revealed weaknesses in the diversification search and the modest ascent part. On the one hand, the original methodology for diversification is insufficiently diverse. The algorithm is considerably improved by combining the more local GOTS with the wider searching Basin Hopping (BH) approach. The second weak point is a too inaccurate and inefficient modest ascent strategy. Analysis of common transition state search algorithms lead to the adaption of the Dimer-method to the Tabu-Search approach. The Dimer-method only requires the first derivatives for locating the closest transition state. For conformational search, dihedral angles are usually the most flexible degrees of freedom. Therefore, only those are used in the Dimer-method for leaving a local minimum. Furthermore, the exact localization of the reaction pathway and the transition state is not necessary as the local minimum position should only be departed as fast as possible. This allows for larger step sizes during the Dimer-search. In the following optimization step, all coordinates are relaxed to remove possible strains in the system. The new Tabu-Search method with Dimer-search delivers more and improved minima. Furthermore, the approach is faster for larger systems. For a system with approximately 1200 atoms, an acceleration of 40 was measured. The new approach was compared to Molecular Dynamics with optimization (MD), Simulated Annealing (SA), and BH with the help of conformational search problems of bio-organic systems. In all cases, a better performance was found. A comparison to the Monte Carlo Multiple Minima/Low Mode Sampling (MCMM/LM) method proved the outstanding performance of the new Tabu-Search approach. The solvation of the chignolin protein further revealed the possibility of uncovering discrepancies between the employed theoretical model and the experimental starting structure. Ligand optimization for improvement of x-ray structures was one further new application field. Besides the global optimization, the search for transition states and reaction pathways is also of paramount importance. These points describe different transitions of stable states. Therefore, a new approach for the exploration of such cases was developed. The new approach is based on a global minimization of a hyperplane being perpendicular to the reaction coordinate. Minima of this reduced phase space belong to traces of transition states between reactant and product states on the unchanged hypersurface. Optimization to the closest transition state using the Dimer-method delivers paths lying between the initial and the final state. An iterative approach finally yields complex reaction pathways with many intermediate local minima. The PathOpt algorithm was tested by means of rearrangements of argon clusters showing very promising results. / Die visuelle Darstellung von Energiefunktionen basiert auf der Möglichkeit, verschiedene Freiheitsgrade zu separieren. Die wichtigste Näherung ist dabei die Born-Oppenheimer-Näherung. Sie erlaubt damit die Darstellung der potentiellen Energie als Funktion der Kernkoordinaten. Die daraus entstehende mehrdimensionale Hyperfläche entspricht der Summenformel eines beliebigen Systems. Minima der Fläche entsprechen stabilen Punkten wie Isomeren oder Konformeren. Diese sind wichtig für Aussagen über die Stabilität oder die Thermodynamik eines Systems. Stationäre Punkte erster Ordnung entsprechen Übergangsstrukturen und beschreiben Phasenübergänge, chemische Reaktionen aber auch Konformationsänderungen. Über die Zustandssumme ist die Hyperfläche zudem mit der freien Energie verknüpft. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden zur effizienten Untersuchung mehrdimensionaler Hyperflächen. Dabei wurde zunächst das Conformational Analysis and Search Tool (CAST)-Programm entwickelt. Die Entwicklung des CAST-Programms in objektorientiertem C++ beinhaltete unter anderem die Implementierung eines Kraftfeldes, verschiedene Schnittstellen zu externen Programmen, Analysealgorithmen und verschiedene Optimierungsmodule. Um Aussagen über eine Energielandschaft treffen zu können, müssen zuerst die stabilsten Minima gefunden werden. Der Gradient Only Tabu Search (GOTS) hat sich als sehr effizient in der Optimierung von mathematischen Funktionen erwiesen. Daher wurde GOTS als Startpunkt verwendet. Tabu-Search basiert auf dem steepest descent – modest ascent Prinzip. Zum Finden neuer Minima wird der steilste Abstieg (steepest descent) verwendet, ein Minimum wird auf dem Weg des geringsten Anstiegs (modest ascent) wieder verlassen. Tabu-Search ist zudem mit einem lernfähigen Speicherdesign kombiniert, wodurch ein Zurück- und im Kreis laufen vermieden wird. Der Phasenraum wird von Tabu-Search sehr genau untersucht, was für komplexere Probleme zu aufwendig wird. Daher bedarf es eines Diversifizierungsschritts, welcher nach Absuchen eines Teils des Phasenraums, die Suche in neue vielversprechende Bereiche bringt. Erste Anwendungen auf Konformationssuchen zeigten, dass GOTS Schwächen im Diversifizierungsschritt und der modest ascent Strategie besitzt. Zum einen ist die ursprünglich verwendete Methodik für die Diversifizierung zu wenig divers. Eine Kombination des mehr lokalen GOTS mit der weiträumiger suchenden Basin Hopping (BH) Methode brachte eine erhebliche Verbesserung. Der zweite Schwachpunkt besteht aus einer zu ungenauen und ineffizienten modest ascent Methode. Daher wurde die Dimer-Methode für Tabu-Search adaptiert. Diese benötigt lediglich die erste Ableitung, um zum Übergangszustand erster Ordnung zu konvergieren. Dabei werden in der Dimer-Methode nur Diederwinkel variiert. Zudem muss der Reaktionspfad und der Übergangszustand nicht exakt getroffen werden, da das Minimum nur möglichst schnell verlassen werden soll. Dies erlaubt größere Schrittweiten in der Dimer-Suche. Im nachfolgenden Optimierungsschritt werden alle Koordinaten relaxiert. Die neue Tabu-Search-Methode mit Dimer-Suche liefert mehr und deutlich verbesserte Minima. Zudem ist sie für größere Systeme deutlich schneller. Für ein System mit circa 1200 Atomen wurde eine Beschleunigung um den Faktor 40 erzielt. Die neue Methode wurde am Beispiel der Konformationssuche von bio-organischen Systemen mit Molekulardynamik mit Optimierung (MD), Simulated Annealing (SA) und BH verglichen, wobei sich in allen Fällen eine bessere Effizienz zeigte. Ein Vergleich zur Monte Carlo Multiple Minima/Low Mode Sampling Methode anhand der Optimierung von peptidischen Ligand-Rezeptor-Komplexen belegte ebenfalls die hervorragende Effizienz des neuen Ansatzes. Die Solvatisierung des Chignolin-Proteins mit Tabu-Search deckte die Möglichkeit auf, Differenzen zwischen der verwendeten theoretischen Methode und der experimentellen Startstruktur aufzudecken. Als weiterer neuer Anwendungsbereich wurde die Optimierung von Ligand-Enzym-Komplexen zur Verbesserung von Röntgenstrukturen untersucht. Neben der globalen Optimierung ist auch die Suche nach Übergangszuständen und Reaktionspfaden von größter Wichtigkeit. Diese beschreiben verschiedene Übergänge zwischen stabilen Zuständen. Daher wurde ein neuer Ansatz zur Untersuchung dieser Fragestellungen entwickelt. Dieser basiert auf einer globalen Minimierung einer Hyperfläche, welche senkrecht zum Reaktionspfad steht. Die Minima des reduzierten Phasenraums gehören zu Spuren zu Übergangszuständen zwischen dem Edukt und dem Produkt. Durch Optimierung dieser Punkte mittels der Dimer-Methode werden also Pfade gefunden, die zwischen Anfangs- und Endpunkt liegen. Ein iteratives Vorgehen liefert letztendlich komplexe Reaktionspfade. PathOpt wurde an Umlagerungen von Argon-Clustern evaluiert, welche sehr vielversprechende Ergebnisse lieferten.

Die kovalente Bindung von elektrophilen körperfremden Stoffen an nukleophile Zentren in Peptiden und Proteinen ist der initiierende molekulare Schritt einer Vielzahl von Erkrankungen und toxischen Prozessen. Für a,b-ungesättigte Aldehyde, Ketone und Ester, die sogenannten Michael-Akzeptoren, spielt dabei die Reaktion mit endogenen Thiolen eine entscheidende Rolle. Für diese Stoffklasse ermöglicht die Quantifizierung der Thiolreaktivität (als logaritmische Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung der Reaktion des Michael-Akzeptors mit dem Tripeptid Glutathion (GSH), log kGSH) eine Vorhersage der akuten aquatischen Toxizität gegenüber den Ciliaten Tetrahymena Pyriformis (quantifiziert als logaritmische 50%-Effekt-Konzentration (effect-concentration, EC) der Wachstumsinhibition, log EC50). Zum besseren Verständnis der an diesen Prozessen beteiligten Reaktionen wurden in dieser Arbeit mehrere mögliche Mechanismen der Addition von Methylthiol an a,b-ungesättigte Carbonylverbindungen quantenchemisch anhand ihrer Übergangszustände untersucht. Dabei lag der Fokus unter anderem auf der Identifikation einer Modellreaktion, deren Barriere eine quantitative Vorhersage der Thiolreaktivität ermöglicht. Entsprechende Regressionsmodelle wurde an experimentelle Daten angepasst. Auf der Basis der berechneten elektrophilen Reaktivität log kGSH und der Hydrophobie (quantifiziert als logarithmischer Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, log Kow) wurden Stoffklassenspezifische Regressionsmodelle zur Toxizitätsvorhersage entwickelt und für die Untergruppe der Ester eine Modell-Suite etabliert.

Die kovalente Bindung von elektrophilen körperfremden Stoffen an nukleophile Zentren in Peptiden und Proteinen ist der initiierende molekulare Schritt einer Vielzahl von Erkrankungen und toxischen Prozessen. Für a,b-ungesättigte Aldehyde, Ketone und Ester, die sogenannten Michael-Akzeptoren, spielt dabei die Reaktion mit endogenen Thiolen eine entscheidende Rolle. Für diese Stoffklasse ermöglicht die Quantifizierung der Thiolreaktivität (als logaritmische Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung der Reaktion des Michael-Akzeptors mit dem Tripeptid Glutathion (GSH), log kGSH) eine Vorhersage der akuten aquatischen Toxizität gegenüber den Ciliaten Tetrahymena Pyriformis (quantifiziert als logaritmische 50%-Effekt-Konzentration (effect-concentration, EC) der Wachstumsinhibition, log EC50). Zum besseren Verständnis der an diesen Prozessen beteiligten Reaktionen wurden in dieser Arbeit mehrere mögliche Mechanismen der Addition von Methylthiol an a,b-ungesättigte Carbonylverbindungen quantenchemisch anhand ihrer Übergangszustände untersucht. Dabei lag der Fokus unter anderem auf der Identifikation einer Modellreaktion, deren Barriere eine quantitative Vorhersage der Thiolreaktivität ermöglicht. Entsprechende Regressionsmodelle wurde an experimentelle Daten angepasst. Auf der Basis der berechneten elektrophilen Reaktivität log kGSH und der Hydrophobie (quantifiziert als logarithmischer Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, log Kow) wurden Stoffklassenspezifische Regressionsmodelle zur Toxizitätsvorhersage entwickelt und für die Untergruppe der Ester eine Modell-Suite etabliert.

Proteins are chain molecules built from amino acids. The precise sequence of the 20 different types of amino acids in a protein chain defines into which structure a protein folds, and the three-dimensional structure in turn specifies the biological function of the protein. The reliable folding of proteins is a prerequisite for their robust function. Misfolding can lead to protein aggregates that cause severe diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's, or the variant Creutzfeldt-Jakob disease. Small single-domain proteins often fold without experimentally detectable metastable intermediate states. The folding dynamics of these proteins is thought to be governed by a single transition-state barrier between the unfolded and the folded state. The transition state is highly instable and cannot be observed directly. However, mutations in which a single amino acid of the protein is substituted by another one can provide indirect access. The mutations slightly change the transition-state barrier and, thus, the folding and unfolding times of the protein. The central question is how to reconstruct the transition state from the observed changes in folding times. In this habilitation thesis, a novel method to extract structural information on transition states from mutational data is presented. The method is based on (i) the cooperativity of structural elements such as alpha-helices and beta-hairpins, and (ii) on splitting up mutation-induced free-energy changes into components for these elements. By fitting few parameters, the method reveals the degree of structure formation of alpha-helices and beta-hairpins in the transition state. In addition, it is shown in this thesis that the folding routes of small single-domain proteins are dominated by loop-closure dependencies between the structural elements. / Proteine sind Kettenmoleküle, die aus einzelnen Aminosäuren aufgebaut sind. Die genaue Sequenz der 20 verschiedenartigen Aminosäuren innerhalb der Proteinkette bestimmt dabei, in welche spezielle Struktur sich ein Protein faltet. Die dreidimensionale Struktur bestimmt wiederum die Funktion der Proteine. Doch nur korrekt gefaltet kann ein Protein seine Funktion erfüllen. Fehler bei der Faltung können zu Proteinaggregaten führen, die schwere Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder das Creutzfeldt-Jakob-Syndrom hervorrufen. Viele kleine Proteine falten ohne experimentell beobachtbare metastabile Zwischenzustände. Entscheidend für die Faltungsdynamik dieser Proteine ist der Übergangszustand zwischen dem ungefalteten und gefalteten Zustand. Der Übergangszustand ist instabil und kann nicht direkt beobachtet werden. Einen indirekten Zugang ermöglichen jedoch Mutationen eines Proteins, bei denen einzelne Aminosäuren ausgetauscht werden. Die Mutationen verändern geringfügig die Übergangszustandsbarriere, und damit die Faltungs- und Entfaltungszeiten des Proteins. Die zentrale Frage ist, wie sich der Übergangszustand aus den beobachteten Änderungen der Faltungszeit rekonstruieren lässt. In dieser Habilitationsschrift wird eine neuartige Methode zur Rekonstruktion von Übergangszuständen aus Mutationsdaten vorgestellt. Die Methode beruht auf (i) der Kooperativität von Strukturelementen wie alpha-Helizes und beta-Haarnadeln, und (ii) der Aufspaltung von mutationsinduzierten Veränderungen der freien Energie in Komponenten für diese Strukturelemente. Die Modellierung der experimentellen Daten verrät, in welchem Grad alpha-Helizes and beta-Haarnadeln im Übergangszustand strukturiert sind. Zudem wird in dieser Habilitationsschrift gezeigt, dass die Faltungswege vieler kleiner Proteine durch Schleifenschließungsbeziehungen zwischen den Strukturelementen dominiert werden.

In der vorliegenden Arbeit wird bei tiefen Temperaturen die bimolekulare Reaktion C2H2+ + H2 -- C2H3+ + H in einem HF 22-Pol-Ionenspeicher untersucht. %weist eine Aktivierungsenergie von ca. 50 meV auf. Dreikörper- und Strahlungsratenkoeffizienten der Assoziationsreaktion C2H2+ + H2 -- C2H4+ werden bestimmt, sowie ihre Temperaturabhängigkeit. Durch Anregung der infrarot-aktiven antisymmetrischen C--H-Streckschwingung nu3 des C2H2+-Ions wird die Aktivierungsenergie der bimolekularen Reaktion überwunden. Zunächst wird ein Nd:YAG-Laser gepumpter Farbstofflaser mit Differenzfrequenzmischung und dann ein schmalbandiger cw-betriebener Bleisalzdiodenlaser zur Induzierung der Reaktion eingesetzt. Der Nachweis des Produkts C2H3+ dient als Hinweis auf den Anregungszustand der C2H2+-Ionen ( chemical probing) und somit lassen sich die P-, Q- und R-Zweige der Normalschwingung nu3 von C2H2+ aufzeichnen. Die empfindliche untergrundfreie Spektroskopie der Prim¨arionen wird demonstriert. Die hohe spektrale Auflösung des Experiments ermöglicht die Schwingungs-, Rotations-, Feinstruktur- und Kernspinszustandspezifische Anregung der C2H2+-Ionen. %Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen Rotationseffekte. Es wird gezeigt, dass eine grössere Rotationsquantenzahl des C2H2+-Ions zur Behinderung der Reaktion führt. Mit der Messung der C2H3+-Ionenzahl als Funktion der Speicherzeit und der H2-Dichte werden die Ratenkoeffizienten der laserinduzierten Reaktion und der Reaktion schwingungsangeregter Primärionen bestimmt. Es wird vermutet, dass die Energie nicht unmittelbar in der Reaktionskoordinate vorhanden ist, sondern einen Sto¨skomplex \mbox{\glqq erhitzt\grqq}. Die von einer Barriere im Eingangskanal behinderte Komplexbildung kann die vorgestellten Ergebnisse erklären. Der Ratenkoeffizient der stossinduzierten Schwingungsrelaxation wird ermittelt. Die experimentelle Bestimmung des Einstein-Koeffizienten der spontanen Emission ermöglicht es, die Lebensdauer des angeregten Zustandes sowie das Dipolmatrixelement und die Schwingungsintensität von nu3 abzuschätzen.

Background: Subtilin is a peptide antibiotic (lantibiotic) natively produced by Bacillus subtilis ATCC6633. It is encoded in a gene cluster spaBTCSIFEGRK (spa-locus) consisting of four transcriptional units: spaS (subtilin pre-peptide), spaBTC (modification and export), spaIFEG (immunity) and spaRK (regulation). Despite the pioneer understanding on subtilin biosynthesis, a robust platform to facilitate subtilin research and improve subtilin production is still a poorly explored spot. Results: In this work, the intact spa-locus was successfully integrated into the chromosome of Bacillus subtilis W168, which is the by far best-characterized Gram-positive model organism with powerful genetics and many advantages in industrial use. Through systematic analysis of spa-promoter activities in B. subtilis W168 wild type and mutant strains, our work demonstrates that subtilin is basally expressed in B. subtilis W168, and the transition state regulator AbrB strongly represses subtilin biosynthesis in a growth phase-dependent manner. The deletion of AbrB remarkably enhanced subtilin gene expression, resulting in comparable yield of bioactive subtilin production as for B. subtilis ATCC6633. However, while in B. subtilis ATCC6633 AbrB regulates subtilin gene expression via SigH, which in turn activates spaRK, AbrB of B. subtilis W168 controls subtilin gene expression in SigH-independent manner, except for the regulation of spaBTC. Furthermore, the work shows that subtilin biosynthesis in B. subtilis W168 is regulated by the two-component regulatory system SpaRK and strictly relies on subtilin itself as inducer to fulfill the autoregulatory circuit. In addition, by incorporating the subtilin-producing system (spa-locus) and subtilin-reporting system (PpsdA-lux) together, we developed “online” reporter strains to efficiently monitor the dynamics of subtilin biosynthesis. Conclusions: Within this study, the model organism B. subtilis W168 was successfully established as a novel platform for subtilin biosynthesis and the underlying regulatory mechanism was comprehensively characterized. This work will not only facilitate genetic (engineering) studies on subtilin, but also pave the way for its industrial production. More broadly, this work will shed new light on the heterologous production of other lantibiotics.

In der vorliegenden Arbeit wird bei tiefen Temperaturen die bimolekulare Reaktion C2H2+ + H2 -- C2H3+ + H in einem HF 22-Pol-Ionenspeicher untersucht. %weist eine Aktivierungsenergie von ca. 50 meV auf. Dreikörper- und Strahlungsratenkoeffizienten der Assoziationsreaktion C2H2+ + H2 -- C2H4+ werden bestimmt, sowie ihre Temperaturabhängigkeit. Durch Anregung der infrarot-aktiven antisymmetrischen C--H-Streckschwingung nu3 des C2H2+-Ions wird die Aktivierungsenergie der bimolekularen Reaktion überwunden. Zunächst wird ein Nd:YAG-Laser gepumpter Farbstofflaser mit Differenzfrequenzmischung und dann ein schmalbandiger cw-betriebener Bleisalzdiodenlaser zur Induzierung der Reaktion eingesetzt. Der Nachweis des Produkts C2H3+ dient als Hinweis auf den Anregungszustand der C2H2+-Ionen ( chemical probing) und somit lassen sich die P-, Q- und R-Zweige der Normalschwingung nu3 von C2H2+ aufzeichnen. Die empfindliche untergrundfreie Spektroskopie der Prim¨arionen wird demonstriert. Die hohe spektrale Auflösung des Experiments ermöglicht die Schwingungs-, Rotations-, Feinstruktur- und Kernspinszustandspezifische Anregung der C2H2+-Ionen. %Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen Rotationseffekte. Es wird gezeigt, dass eine grössere Rotationsquantenzahl des C2H2+-Ions zur Behinderung der Reaktion führt. Mit der Messung der C2H3+-Ionenzahl als Funktion der Speicherzeit und der H2-Dichte werden die Ratenkoeffizienten der laserinduzierten Reaktion und der Reaktion schwingungsangeregter Primärionen bestimmt. Es wird vermutet, dass die Energie nicht unmittelbar in der Reaktionskoordinate vorhanden ist, sondern einen Sto¨skomplex \mbox{\glqq erhitzt\grqq}. Die von einer Barriere im Eingangskanal behinderte Komplexbildung kann die vorgestellten Ergebnisse erklären. Der Ratenkoeffizient der stossinduzierten Schwingungsrelaxation wird ermittelt. Die experimentelle Bestimmung des Einstein-Koeffizienten der spontanen Emission ermöglicht es, die Lebensdauer des angeregten Zustandes sowie das Dipolmatrixelement und die Schwingungsintensität von nu3 abzuschätzen.