Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-17T17:10:52Z No. of bitstreams: 1 Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T17:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq e FAPESP / Fundação Oswaldo Cruz. Pavilhão Hélio Peggy e Pereira. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia duodenalis (G. duodenalis) é um protozoário entérico patogênico distribuído mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mamíferos, incluindo humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade genética, apresentando sete genótipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os genótipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial zoonótico do parasito. Análise das sequências de amplicons de determinados marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G. duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima málica (ME) comparando os resultados obtidos com o gene da β-giardina (βg) usando a PCR convencional seguida de sequenciamento para detecção e genotipagem de amostras clínicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar, quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes. Foram usadas 100 amostras clínicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo exame parasitológico e imunológico. A N - PCR convencional - βg amplificou 61% destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como genótipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16 humanos e três caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao genótipo A, sendo seis humanas (quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo indeterminado) e três caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por ambos marcadores, observou-se concordância na identificação do genótipo. A comparação do limite de detecção da PCR convencional ME com a PCR em Tempo Real - ME demonstrou que esta última foi aproximadamente 10 4 vezes mais sensível. Análise estatística dos resultados obtidos com as réplicas da curva-padrão indicou reprodutibilidade do método e determinou que amostras negativas são aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras clínicas (71%) foram positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62 (87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantificação relativa de DNA de G. duodenalis nas amostras clínicas com a PCR em Tempo Real - ME, demonstrou que a concentração de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21 ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME apresentou maior sensibilidade em relação à N - PCR convencional - ME, indicando a necessidade de utilização de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se em regiões polimórficas, como demonstrado pela análise das sequências de ME. Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos estudos de epidemiologia molecular da giardíase. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite found worldwide in various mammalian hosts, including humans. G. duodenalis isolates display high genetic diversity with seven genotypes (A-G) and subtypes. However, only A and B assemblages have been detected in humans. The subtype A1 parasite presents the strongest zoonotic potential. Discordant genotyping and detection results of G. duodenalis isolates have been previously reported using amplicon sequence analysis from certain molecular markers. Therefore, this leads to the search of novel ones. The purpose of this work was to compare conventional PCR, followed by sequencing, using malic enzyme (ME) and β-giardin gene (βg) as molecular markers for the detection and genotyping of the parasite found in faecal samples. Likewise, an approach involving Real Time PCR - ME for detecting, quantifying and genotyping G. duodenalis isolates was developed. We collected 100 positive faecal samples (83 humans and 17 canines) according to parasitological exam and immunoassays. N - PCR - βg detected 61 positive samples (61%) from which 52 were human and seven were canine. All those samples were characterized as genotype A. Subtype A1 and A2 were determined in 42 (38 humans/4 canines) and 19 (16 humans/3 canines) samples, respectively. However N - PCR - ME analyses revealed that only nine faecal samples (9%) were positive (6 humans/3 canines) for genotype A. Six human samples were subtyped as A1 (4), A2 (1) and one not-determined, and the three canine samples were subtype A2. However, when correlating the sample genotyping using both markers, we have observed an agreement in the identification of the genotypes. The comparison of the detection limit between the N - PCR - ME and the Real Time PCR - ME showed that the latter one was approximately 104-fold more sensitive. The statistical analysis of the data from the standard curve replicates indicated reproducibility of the method. Furthermore, Ct values > 37 were established as an indicative for negative samples. Therefore, Real Time PCR - ME analysis revealed that 71 samples (71%) were positive for subtype A1 from which 62 (87.3%) and nine (13.4%) samples were humans and canines, respectively. The relative quantification of G. duodenalis DNA in the clinical samples using Real Time PCR - ME varied from 4.21 ng to 204.0 fg corresponding to 22.000 and one cyst, respectively. Overall, Real Time PCR – ME analysis showed to be more sensitive than N - PCR - ME. It, thus, suggest the need to design different primers, because the ones used were within a polymorphic region of the ME sequence. Although more investigation is yet to be done, the results achieved in this work indicate that Real Time PCR - ME has a great potential in the applicability for molecular epidemiological studies of giardiasis.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 233114 bytes, checksum: c512aebdda22870fd45ba41c414294f0 (MD5) Previous issue date: 2007-10-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aluminum effects on malic acid exudation and root elongation were evaluated in two maize genotypes: UFVM 100 e UFVM 200, selected from a group of six genotypes developed by the Agronomy Department of the Federal University of Viçosa, Viçosa, MG, Brazil. Five days-old seedlings of the six genotypes were exposed to Al 50 µM in 0.4 mM CaCl2, pH 4.0, for 24 h and, based on growth inhibition of the main root, they were classified into two categories: a) Al sensitive (≥ 68% inhibition): UFVM 8 and UFVM 100; and b) Al tolerant (≤ 64% inhibition): UFVM 6, UFVM 7, UFVM 9 and UFVM 200. The genotypes: UFVM 100 and UFVM 200 were selected for the following experiments. Seedlings of both genotypes were treated with different Al concentrations and different time of exposition to the metal and then the Al effect on root elongation was evaluated. The elongation of the main root decreased with increasing Al concentration in both genotypes, especially in the UFVM 100 genotype. Differences between cultivar were higher at lower concentration but decreased as Al concentration was increased in the growth medium. Inhibition in the elongation of the main root was evident from the beginning of Al treatment and increased linearly with the time of exposition to Al. The UFVM 200 genotype always showed higher Al tolerance than the UFVM 100 genotype and the differences between them were bigger at Al concentration between 25 and 50 µM. Aluminum contents in leaves were always low in comparison with the roots, but the UFVM 200 genotype showed higher Al contents than the UFVM 100 genotype. In the roots Al contents increased with increasing Al concentration in the growth medium and they were always higher in the UFVM 100 genotype. The activity of the malate dehydrogenase (MDH) was higher in roots, but it increased with Al treatment only in leaves of the tolerant genotype. Malic acid exudation to the growth medium was observed in control plants of both genotypes. In Al-treated plants of both genotypes malic acid exudation increased with increasing Al concentration in the growth medium but UFVM 200 genotype always showed higher exudation at all Al concentrations. Maximum malic exudation occurred at estimated Al concentration of 133 and 197 µM for the genotypes UFVM 200 e UFVM 100, respectively. Although, both genotypes have exudated malic acid to the growth medium, in none of them the amount of malic acid was enough to detoxify the Al in the nutrient solution. / Os efeitos do alumínio sobre o alongamento radicular e a exsudação de ácido málico foram avaliados em dois genótipos de milho: UFVM 100 e UFVM 200, selecionados de um grupo de seis genótipos desenvolvidos pelo Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil. Plântulas, com cinco dias de idade, dos seis genótipos foram expostas a Al 50 µM em solução de CaCl2 0,4 mM, por 24 horas e, baseado na inibição do alongamento radicular, foram classificados em duas categorias: a) sensíveis ao Al (≥ 68% de inibição): UFVM 8 e UFVM 100; e b) tolerantes ao Al (≤ 64% de inibição): UFVM 6, UFVM 7, UFVM 9 e UFVM 200. Os genótipos UFVM 100 e UFVM 200 foram selecionados para os demais experimentos. Plântulas dos dois genótipos foram expostas a diferentes concentrações de Al e diferentes tempos de exposição e, então, o efeito do Al sobre o alongamento da raiz principal foi avaliado. O alongamento da raiz principal decresceu com o incremento na concentração de Al nos dois genótipos, especialmente no genótipo UFVM 100. Diferenças entre os genótipos foram maiores em baixas concentrações de Al e decresceram à medida que a concentração de alumínio foi aumentando no meio de cultivo. Inibições no crescimento da raiz principal foram evidentes desde o início da aplicação do tratamento e aumentaram linearmente com o tempo de exposição ao Al. O genótipo UFVM 200 mostrou sempre maior tolerância ao Al que o genótipo UFVM 100, tendo as maiores diferenças entre eles ocorrido entre 25 e 50 µM de Al. Os teores de Al nas folhas foram sempre baixas em comparação aos teores nas raízes, mas o genótipo UFVM 200 apresentou teores mais elevados que o genótipo UFVM 100. Nas raízes, os teores de Al aumentaram com a elevação na concentração de Al na solução de cultivo e foram sempre mais elevados no genótipo UFVM 100. A atividade da enzima desidrogenase malato (MDH) foi maior nas raízes, mas só foi modificada pelo tratamento com Al nas folhas do genótipo tolerante. Exsudação de ácido málico para o meio de cultivo ocorreu nas plantas controle dos dois genótipos. A exposição das plantas ao Al resultou em aumento na exsudação de ácido málico para o meio de cultivo, tendo o genótipo UFVM 200 apresentado maior exsudação deste ácido em todas as concentrações de Al. A exsudação máxima de ácido málico ocorreu nas concentrações estimadas de Al de 133 e 197 µM para os genótipos UFVM 200 e UFVM 100, respectivamente. Embora, os dois genótipos tenham exsudado ácido málico para o meio de cultivo, em nenhum deles a quantidade de ácido málico foi suficiente para eliminar a toxidez do Al na solução nutritiva.

El objetivo general de este trabajo es revelar por primera vez los cambios en la expresión génica que se producen durante el desarrollo y la maduración de la pulpa de los frutos cítricos, y en particular aquellos asociados a los mecanismos de regulación de la acidez, identificando el conjunto de genes inducidos y reprimidos que regulan la síntesis y la degradación del ácido cítrico durante la maduración interna de los frutos cítricos. Desde un punto de vista metabólico se ha estudiado la evolución de los principales ácidos de los frutos en cuatro variedades que presentan diferencias en su periodo de maduración, con la intención de determinar los correspondientes patrones de acumulación y degradación. Por otra parte, atendiendo a la expresión de los principales genes implicados en el metabolismo de los ácidos se incide sobre los mecanismos de regulación de su síntesis durante las fases I y II del desarrollo del fruto, y de su degradación en las fases II y III de maduración del fruto. De este modo se ha comprobado que el ácido cítrico se metaboliza vía 2-oxoglutarato a glutamina y a succinato, en la ruta de derivación del GABA, por lo que esta ruta parece ser una vía prioritaria de catabolismo del ácido cítrico. Además, se ha comprobado que la acumulación de ácido cítrico en los frutos se encuentra directamente relacionada con una disminución del nivel de transcrito de la ATP citrato liasa, la cual reduce la degradación de citrato en el citosol quedando más cantidad de citrato disponible para ser almacenado en la vacuola. / Soler Fayos, G. (2009). Cambios en la expresión génica asociados a la maduración interna del fruto de los cítricos: identificación de rutas metabólicas implicadas en la acumulación y eliminación de ácidos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6068 / Palancia

Made available in DSpace on 2017-07-21T18:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mary Dias Queji.pdf: 909281 bytes, checksum: 0364cd27c13b09019850a0944168a898 (MD5) Previous issue date: 2008-04-05 / The agro industry of the apple generates, during the processing, the pomace which is considered the main by-product. Studies show that of the total amount of fruit that is processed to obtain the apple juice, 20 to 40 correspond to this by-product, which, is usually destined as a complement in animal feed or delivered onto the soil as organic fertilizer. The chemical composition, in moist base, is constituted by moisture (80), fibers (5) and soluble solids (14) represented, mainly, by fructose, glucose and sucrose, as well as, by organic acids, represented, in the most part by malic acid. The apple pomace also presents phenolic compounds that are target nutrients of great sensory and nutritional importance. Therefore, the quantification of its constituents represents an important source of data in the characterization of apple pomace for biotechnological purposes, seeking to attribute an appropriate use for this by-product. The conventional methodologies used for the quantification of sugars, organic acids and total phenols, although being part of the routine analyses in the quality control laboratories, are onerous, time consuming and generate residues. The aim of this study was to develop a fast, versatile analytical technique, of low cost and no pollutant, using the diffuse reflectance infrared spectroscopy (DRIFTS) allied to methods of multivariate calibration (PLSR). For the construction of the multivariate models, the averages of the concentrations of the simple sugars, malic acid and total phenols were used, obtained by the conventional methodologies, as well as the data in the medium infrared spectroscopy (MID) and near (NIR), obtained in duplicate, and of the 52 spectra obtained for the samples of apple pomace, 47 made part of the set calibration and 5 of the set validation. The regression models for the prediction of the concentration of fructose, sucrose, total phenols and malic acid obtained better results in MID, with averages of relative standard errors of 3.9 (with 5 Latents Variable), 6.6 (with 5 Latents Variable), 6.4 (with 4 Latents Variable) and 5.9 (with 5 Latents Variable), respectively. Already the best capacity prediction for glucose concentration was obtained by NIR, in which the average of relative standard error was 7.4 (with 6 Latents Variable). The obtained results demonstrate the good capacity of prediction of the multivariate models based in infrared spectroscopy and characteristic advantages of the association DRIFTPLSR. / A agroindústria da maçã gera, durante o processamento, o bagaço que é considerado o principal subproduto deste setor. Levantamentos mostram que da quantidade total de fruta que é processada para a obtenção do suco de maçã, 20 a 40 correspondem a este subproduto, que, normalmente, é destinado como complemento na alimentação animal ou dispensado no solo como adubo orgânico. Sua composição química, em base úmida, é constituída por umidade (80), fibras (5) e sólidos solúveis (14), estes últimos representados, principalmente, por frutose, glucose e sacarose, bem como, ácidos orgânicos, representados, majoritariamente pelo ácido málico. O bagaço da maçã também apresenta compostos fenólicos, que são fito-nutrientes de grande importância sensorial e nutricional. Portanto, a quantificação desses constituintes representa uma importante fonte de dados na caracterização do bagaço de maçã para finalidades biotecnológicas, visando atribuir um fim mais nobre a este subproduto. As metodologias convencionais empregadas para a quantificação de açúcares, ácidos orgânicos e fenóis totais, embora façam parte das análises de rotina nos laboratórios de controle de qualidade, são onerosas, demoradas e geram resíduos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica analítica rápida, versátil, de baixo custo e não poluente. Para tal, utilizou-se a espectroscopia no infravermelho por refletância difusa (DRIFTS) aliada a métodos de calibração multivariada (Regressão de Mínimos Quadrados Parciais - PLSR). Para a construção dos modelos multivariados, foram utilizadas as médias das concentrações dos açúcares simples, ácido málico e fenóis totais, obtidas pelas metodologias convencionais, bem como, os dados de espectroscopia no infravermelho médio (MID) e próximo (NIR). Os espectros foram obtidos em duplicata, sendo que dos 52 espectros das amostras de bagaço de maçã, 47 fizeram parte do conjunto de calibração e 5 do conjunto de validação externa. Os modelos de regressão para a previsão da concentração de frutose, sacarose, fenóis totais e ácido málico obtiveram melhores resultados no MID, com médias de erro padrão relativo de 3.9 (com 5 Variáveis Latentes), 6.6 (com 5 Variáveis Latentes), 6.4 (com 4 Variáveis Latentes) e 5.9 (com 5 Variáveis Latentes), respectivamente. Já a melhor capacidade de previsão para a concentração de glucose foi obtida pelo NIR, na qual a média de erro padrão relativo foi de 7.4 (com 6 Variáveis Latentes). Os resultados obtidos demonstram a boa capacidade de previsão dos modelos multivariados fundamentados em espectroscopia no infravermelho e vantagens características da associação DRIFT-PLSR.