O desenvolvimento e a otimização de terapias visando a reposição da função neuronal dependem largamente da melhor compreensão dos mecanismos moleculares por trás da diferenciação de células neurogênicas em neurônios maduros. O ácido retinoico (AR) promove diferenciação neuronal de diversos tipos celulares por meio de reprogramação gênica e de vias de sinalização citoplasmáticas. Os receptores nucleares RXRs são mediadores moleculares fundamentais para os efeitos celulares do AR; no entanto, o papel isolado de cada uma de suas três isoformas na diferenciação neuronal permanece pouco claro. Tendo isso em mente, foi investigada a diferenciação induzida pelo AR na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y. A caracterização dos parâmetros induzidos pelo AR nessas células demonstrou parada no ciclo celular e adoção de características típicas de neurônios maduros. Os perfis de expressão das isoformas presentes nas células SH-SY5Y, RXRα e RXRβ, mostraram-se variavelmente regulados ao longo da diferenciação neuronal, tanto a nível de transcritos quanto de proteína. Por fim, o silenciamento transitório e isolado de RXRα e RXRβ durante as primeiras etapas da diferenciação com AR afetou de forma distinta os fenômenos celulares induzidos pelo composto: enquanto RXRα mostra-se fundamental para efeitos genômicos e não genômicos na diferenciação, RXRβ modula negativamente a extensão de neuritos nas células SH-SY5Y. Assim, o trabalho indica a presença de funções distintas para as isoformas de RXR durante as primeiras etapas da diferenciação neuronal induzida pelo AR em neuroblastoma, e traz novas perspectivas para o estudo de RXRs como alvos moleculares nas abordagens clínicas de reposição neuronal. / Developing and optimizing therapies aiming at restoring neuronal function depend on better understanding the molecular mechanisms behind differentiation of neurogenic cells into mature neurons. Retinoic acid (RA) promotes neuronal differentiation in multiple cell types through gene reprogramming and cytosolic signaling pathways. The nuclear RXR receptors are main molecular mediators of RA cellular effects. However, little is known about specific roles of distinct RXR isoforms in neuronal differentiation. In view of this, the RA-mediated differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cell line was investigated. Analysis of RA-induced parameters in SH-SY5Y cells showed cell cycle arrest and adoption of neuronal hallmarks. The expression profiles of RXR isoforms detected in SH-SY5Y cells, RXRα e RXRβ, were found varyingly modulated along neuronal differentiation both at transcript and protein levels. Finally, transitory silencing of RXRα and RXRβ single isoforms during the first stages of RA-mediated differentiation distinctly affected cellular phenomena induced by RA: whereas RXRα is required for genomic and non-genomic effects during differentiation, RXRβ negatively regulate neurite extension in SH-SY5Y cells. Results thus indicate distinct functions for RXR isoforms during the first stages of RA-dependent neuronal differentiation of neuroblastoma, and reveal new perspectives for studying RXRs as molecular targets in neuronal replacement therapies.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:25:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1103_1.pdf: 3465063 bytes, checksum: 5cc26568ca0f5b05dfcf73d83acd47b9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / O ácido retinóico (AR) tem sido largamente utilizado em formulações dermatológicas para o tratamento de acne, distúrbios de queratinização como psoríase e também em formulações cosméticas com a finalidade de reduzir os efeitos do fotoenvelhecimento, celulite e estrias. Entretanto, apesar de seus efeitos benéficos provoca irritação local manifestada na forma de eritema, queimação, coceira, secura e descamação da pele, além de ser instável na presença de ar e luz e pobremente solúvel na água. Para resolver estes problemas, microcápsulas (MC) de alginato/quitosana contendo AR e óleo de babacu, foram preparadas com o propósito de proteger e promover uma liberação sustentada do AR e o óleo de babaçu foi acrescentado para evitar o ressecamento causado pelo AR. Devido ao alto tempo de retenção encontrado na literatura e a sensibilidade do AR à luz e ao calor na primeira parte deste trabalho um método rápido e sensível para o doseamento do AR em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em gel natrosol® foi desenvolvido e validado por cromatografia líquida de alta eficiência associada à espectroscopia UV. Este método foi utilizado para quantificar o AR de forma específica em cinéticas de liberação in vitro. As análises foram realizadas em modo isocrático, comprimento de onda de 350 nm e foi utilizado coluna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm (5μm). A fase móvel foi constituída de metanol e ácido acético 1% (85:15 v/v) e o fluxo foi de 1,8 mL/minuto. A faixa de linearidade do estudo foi de 0,5 a 60 μg/mL (r2 = 0,999). O método validado mostrou-se sensível, específico, exato, preciso, de baixo custo e o tempo de retenção do AR foi de 5,8 ± 0,4 minutos sendo, desta forma, mais rápido do que os relatados na literatura. A segunda parte do trabalho foi desenvolver e caracterizar as MC, estudar a interação fármaco-polímero-óleo e o perfil de liberação in vitro. As MC foram obtidas utilizando a técnica de coacervação complexa, apresentaram forma esférica, diâmetro em torno de 400 μm e taxa de encapsulação afetada pela concentração de AR, quitosana e solvente utilizado. A taxa de encapsulação do AR (0,1 e 0,5%) variou de 8% a 44% para concentrações de quitosana de 0,05 e 0,1%, respectivamente, utilizando etanol como solvente. No entanto, utilizando clorofórmio como solvente, a taxa de encapsulação foi de 78% No estudo de interação fármaco-polímero-óleo, na mistura física óleo-AR, alterações e deslocamentos das bandas nas regiões entre 1310 e 1046 cm-1 foram observadas. A banda 758 cm-1 (estiramento =C-H) presente na mistura física resultou da fusão de várias bandas tanto do AR quanto do óleo de babaçu, indicando, portanto, uma interação e/ou solubilização do fármaco no óleo de babaçu. Os resultados da cinética de liberação in vitro mostraram que aproximadamente 67% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas preparadas com quitosana a 0,05% e em torno de 45% daquelas preparadas com quitosana a 0,1% ao final de 48 h do ensaio. O desenvolvimento das MC mostrou-se simples, rápido e economicamente viável além de utilizar quitosana e alginato que são polímeros biocompatíveis e o óleo de babaçu um componente de interesse econômico do nordeste do país podendo ser, desta forma, uma alternativa para driblar a baixa solubilidade, a foto-instabilidade e a toxicidade do AR. Sendo consideradas boas candidatas para sistemas de liberação sustentada do AR na pele melhorando e deixando mais segura a terapia tópica com o AR

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-03Bitstream added on 2014-06-13T21:03:36Z : No. of bitstreams: 1 soriano_ea_dr_botfm.pdf: 647792 bytes, checksum: 79d79539da26ced280a53e44963905dc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O 13-cis-ácido retinóico (isotretinoína) é eficaz no tratamento da acne. Sua utilização de forma terapêutica pode apresentar manisfestações metabólicas e nos diferentes órgãos e sistemas, como pele, ossos, fígado e alterações no metabolismo dos lípides. Na pele e mucosas podem ocorrer ressecamento e descamação. No osso ocorre aumento de atividade osteoclástica, com provável afinamento ósseo e hipercalcemia e no fígado ocorre acúmulo de vitamina A nas células estreladas, com hiperplasia e hipertrofia dessas células e fibrose perisinusoidal. Podem ocorrer aumento do colesterol total (CT), triglicériedes (TG) e diminuição da lipoproteína de alta densidade (HDL). A influência da vitamina A sobre o coração é bastante relevante, ocorrendo durante... / 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) is effective in acne treatments. its therapeutic use may present manifestations in metabolism as well as in different organs and systems, such as the skin, bones and liver. It may also show alterations in lipid metabolism. Overdrying and scaling may occur in the skin and mucosas. Increased osteoclastic activity occurs in bones, and bone thinning and hypercalcemia are likely. Vitamin-A accumulation occurs in liver star cells, leading... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-16Bitstream added on 2014-06-13T19:42:37Z : No. of bitstreams: 1 freire_cmm_dr_botfm.pdf: 388273 bytes, checksum: 9c831a245404da97a807b7720aa9ae7a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Devido à escassez de trabalhos sobre a influência do todo-trans-ácido retinóico (ATRA) no coração de ratos normais, foi realizado experimento com ratos jovens adultos, que receberam diferentes doses de ATRA. O objetivo deste estudo foi verificar se as alterações causadas pelo ATRA no coração dos ratos, são fisiológicas ou patológicas e se apresentam relação dose-dependente. Para este estudo, foram utilizados 72 ratos Wistar, distribuídos em 4 grupos: 1) grupo com 18 animais que receberam a dieta sem ATRA (controle), 2) grupo com 18 animais que receberam 0,3 mg de ATRA / kg de dieta/dia (AR 0,3), 3) grupo com 18 animais que receberam 10 mg de ATRA /kg de dieta/dia (AR 10), 4) grupo com 18 animais que receberam 50 mg de ATRA /kg de dieta/dia (AR 50). Após 4 semanas de tratamento, os animais foram avaliados pelo ecocardiograma e após eutanásia, as amostras de sangue, do fígado e do coração, foram coletadas. As amostras dos ventrículos esquerdos (VE) foram separadas para a avaliação do teor de água, da hipertrofia, da fibrose, da conexina 43, das enzimas do metabolismo energético cardíaco e para a realização das dosagens de vitamina A total e ATRA. No fígado, foram feitas as dosagens da vitamina A total e do ATRA. No sangue, foram realizadas as quantificações de retinol, triglicerídeos e colesterol total. Neste trabalho, foi observado, por meio do ecocardiograma, que os animais que receberam 50 mg de ATRA apresentaram hipertrofia cardíaca caracterizada pelo aumento proporcional entre a espessura da parede do ventrículo esquerdo e o diâmetro da sua cavidade (EPVE/DDVE), sem o aparecimento de fibrose. A função sistólica melhorou e a função diastólica permaneceu normal. O teste de tendência linear mostrou aumento gradual nas seguintes variáveis: diâmetro do átrio esquerdo (DAE), diâmetro diastólico do ventrículo... / In the current medical bibliography there are only a few papers concerning the influence of all-trans-retinoic acid (ATRA) on the hearts of normal rats. To supply this lack was carried out a study with young adult rats, that received different doses of ATRA. The aim of this work was to evaluate if the cardiac alterations caused by ATRA are physiological or pathological and if these alterations are dose-dependent. In this research were used 72 Wistar rats allocated in 4 groups: 1) group with 18 animals that received a diet without ATRA (control), 2) group with animals that received 0,3mg of ATRA/ kg of the diet (RA 0,3), 3) group with animals that received 10mg of ATRA/ kg of the diet (RA 10) and 4) group with animals that received 50 mg of ATRA/ kg of the diet (RA 50). After 4 weeks, the animals were evaluated by echocardiography exam and in the next day, the rats were euthanasiated and the samples of blood, liver and heart were collected. The left ventricle (LV) samples were separated for evaluation of water content, hypertrophy, fibrosis, connexin 43, enzymes of energetic metabolism and for dosages of total vitamin A and ATRA. In the livers were determined the total vitamin A and ATRA and in the blood were carried out the dosages of the retinol, triglycerides and total cholesterol. In was observed ,by echocardiogram, that the animals which received 50mg of ATRA presented cardiac hypertrophy with proportional increase in the wall thickness of the left ventricle in relation to its diameter (LVWT/LVDD), but it was observed fibrosis. The systolic function increased and diastolic function was normal. In relation to the trend test was observed gradual increase in the left atrium diameter (LAD), left ventricle diastolic diameter (LVDD), left ventricle systolic diameter (LVDS)... (Complete abstract click electronic access below)

O ácido retinóico (AR) é sintetizado a partir de oxidações sucessivas do retinol. A última etapa de oxidação é catalisada pelas enzimas RALDHs. O estabelecimento da polaridade ântero-posterior (AP) do coração é crítico para a demarcação das regiões de efluxo (ventrículos) e de influxo (átrios). Nosso grupo propõe que uma onda caudo-rostral (CR) de RALDH2 seja o mecanismo responsável por esta padronização em vertebrados. Para testar o papel da sinalização pelo AR na padronização AP do peixe zebra, manipulamos sua via com o inibidor das enzimas RALDHs, DEAB, com AR e com um inibidor da enzima CYP26 (IC), que cataboliza o AR. Os tratamentos com DEAB durante o período da onda de RALDH2 produziram átrios reduzidos, enquanto que os tratados com AR e com IC apresentam o domínio atrial expandido. Animais tratados com DEAB e AR em um estágio posterior a onda não mostraram diferença significativa ao controle. Estes dados sugerem uma forte correlação entre o evento da onda e a padronização das câmaras cardíacas, semelhante ao que ocorre nos demais amniotos. / The retinoic acid (RA) is synthetized by successive oxidations of retinol. The last oxidation step is catalyzed by the RALDHs enzymes. The establishment of the anteroposterior (AP) polarity is critical for the demarcation of outflow (ventricle) and inflow (atrium) regions. Our group proposes that a caudorostral (CR) wave of RALDH2 is the mechanism responsible for this patterning in vertebrates. In order to test the role of the RA signaling in zebrafish AP patterning, we manipulated its pathway with a RALDH enzymatic inhibitor, DEAB, with RA and with a CYP26 (IC) enzymatic inhibitor, that catabolises the RA. The DEAB treatments during the manifestation of the RALDH wave produced reduced atriums; meanwhile, the treatments with RA and IC presented an atrium expansion. Animals treated with DEAB and RA during a stage posterior to the wave did not present any significant difference. These data suggest a strong correlation between the wave event and the cardiac chamber patterning, similar to the mechanism observed in others amniotes.

Os gliomas representam o tipo de tumor primário mais comum do sistema nervoso central. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e de radioterapia e nos protocolos de quimioterapia, não há tratamento eficiente disponível. O ácido retinóico na forma all-trans (atRA) é um agente anti-proliferativo utilizado para o tratamento de alguns tipos de lesões pré-malígnas e tumores, como a leucemia promielocítica. Entretanto, sua utilização no tratamento clínico de tumores sólidos, incluindo os gliomas, é limitada, devido ao rápido desenvolvimento de resistência aos efeitos anti-tumorais do atRA. Para endereçar este problema, foi proposto: a) clonar e analisar a função de cyp26b1 de rato, uma enzima da família dos citocromos P450 envolvida na metabolização de ácido retinóico, previamente descrito em nosso laboratório como potencialmente envolvido na resposta de células de glioma ao tratamento com atRA; b) gerar e caracterizar uma variante da linhagem celular C6 de glioma de rato resistente aos efeitos anti proliferativos de atRA. O cDNA de cyp26b1 de rato, até então desconhecido, foi amplificado, clonado e seqüenciado com sucesso. A seqüência protéica correspondente é conservada e agrupa-se no dendrograma com outras proteínas Cyp26B1, mesmo de organismos distantes como zebrafish, em detrimento de outras proteínas parálogas da família Cyp26. Cyp26b1 é fortemente induzida por atRA em células de glioma de rato e humano, de forma dose-dependente. Embora seja expresso em amostras de cérebros humanos normais e de glioma, não foram encontradas diferenças significativas entre os diferentes graus de matlignidade tumoral, ou em comparação com cérebro normal. A super-expressão de cyp26b1 de rato através de transfecção estável de células de glioma de rato e humano, bem como de células P19 de teratocarcinoma de camundongo, não alterou significativamente as características de crescimento celular, tanto em substrato sólido quanto em substrato semi-sólido. O tratamento prolongado de células C6 de glioma de rato com atRA levou à obtenção de uma população policlonal resistente aos efeitos anti-proliferativos de atRA, a partir da qual uma linhagem celular clonal resistente foi isolada com sucesso. Esta variante clonal, denominada linhagem celular C6R, apresenta inibição de crescimento por atRA diminuída, quando comparada com a linhagem celular C6 parental e com a variante ST1. Além disso, esta variante também mostrou uma tendência, embora não significativa estatisticamente, de gerar tumores maiores quando injetados no subcutâneo de camundongos do tipo nude. A expressão de genes previamente descritos como induzidos pelo tratamento com atRA em células ST1 é fortemente inibida na linhagem celular C6R. Além disso, menor expressão de RARβ, RARγ e CRABP-1 foi também observada em células C6R, enquanto que expressão muito maior de RXRγ e CRABP-2 foi encontrada nas células resistentes a atRA, em comparação com as células C6 parentais. Como conclusões gerais deste trabalho, foi proposto que cyp26b1 parece estar envolvido no metabolismo e detoxificação de atRA e parece não ser efetor da inibição de crescimento induzida por atRA, nem estar relacionado com a resistência de células de glioma ao tratamento com atRA. Por outro lado, o isolamento e caracterização de uma linhagem celular resistente ao tratamento com atRA sugere que a resistência está relacionada à expressão diferencial de receptores de retinóides e de proteínas de ligação ao ácido retinóico. / Gliomas are among the most common primary tumors of the central nervous system. Despite the advances in surgical and radiotherapy procedures and chemotherapy protocols, efficient treatment is still not available. Retinoic acid is a anti-proliferative agent used for treatment of a number of pre-malignant lesions and tumors, as promyelocytic leukemia. However, its clinical use in treatment of solid tumors, including gliomas, is impaired by the rapid development of resistance to the anti-tumoral effects of atRA. In order to address this problem, we proposed: a) to clone and analyze the role of rat cyp26b1, a member of cytochrome P450 superfamily envolved in the metabolization of retinoic acid, which has previously been described by our group as being potentially involved in the response of glioma cells to retinoic acid treatment; b) to generate and characterize a variant of rat C6 glioma cell line resistant to anti proliferative effects of atRA. The previously unknown cDNA of rat cyp26b1 was successfully amplified, cloned and sequenced. The protein is conserved and clustered in dendrograms with other cyp26b1 proteins, even from distant organisms as zebrafish, in detriment of other cyp26 paralogs. Cyp26b1 is strongly induced by atRA in rat and human glioma cells, in a dose-dependent fashion. Although expressed in human normal brains and glioma samples, no significant differences were found among different tumor grades nor comparing to normal brain. Stable-transfection and overexpression of rat cyp26b1 in rat and human glioma cell lines, as well as P19 mouse teratocarcinoma cell line, did not significantly modified cell growth properties, either on solid or semi-solid substrates. Prolonged treatment of C6 rat glioma cell line with atRA leads to isolation of an atRA-resistant polyclonal cell population, from which a resistant clonal cell line was successfully isolated. This clonal variant, named C6R cell line, displayed diminished growth inhibition by atRA compared to the parental C6 cell line and the variant ST1 cell line. In addition, this variant also showed a trend, although not quite statistically significant, to generate larger tumors when xenografted s.c. into nude mice. Expression of genes previously described as being induced by atRA-treatment in ST1 cells is strongly impaired in the C6R resistant cell line. In addition, lower expression of RARβ, RAR&#947 and CRABP-1 was also observed in C6R cells, whereas a much higher expression of RXRγ and CRABP-2 was found in the resistant cells when compared to the parental C6 cells. As general conclusions of this work, we found that cyp26b1 is more likely to be involved in primary atRA metabolism and detoxification and does not seem to be an effector of atRA-induced cell growth arrest nor to be related to the resistance of glioma cells to atRA treatment. On the other hand, isolation and characterization of an atRA-resistant cell line suggests that atRA resistance is more likely to be due to differential expression of retinoid receptors and retinoic acid binding proteins.

Os gliomas representam o tipo de tumor primário mais comum do sistema nervoso central. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e de radioterapia e nos protocolos de quimioterapia, não há tratamento eficiente disponível. O ácido retinóico na forma all-trans (atRA) é um agente anti-proliferativo utilizado para o tratamento de alguns tipos de lesões pré-malígnas e tumores, como a leucemia promielocítica. Entretanto, sua utilização no tratamento clínico de tumores sólidos, incluindo os gliomas, é limitada, devido ao rápido desenvolvimento de resistência aos efeitos anti-tumorais do atRA. Para endereçar este problema, foi proposto: a) clonar e analisar a função de cyp26b1 de rato, uma enzima da família dos citocromos P450 envolvida na metabolização de ácido retinóico, previamente descrito em nosso laboratório como potencialmente envolvido na resposta de células de glioma ao tratamento com atRA; b) gerar e caracterizar uma variante da linhagem celular C6 de glioma de rato resistente aos efeitos anti proliferativos de atRA. O cDNA de cyp26b1 de rato, até então desconhecido, foi amplificado, clonado e seqüenciado com sucesso. A seqüência protéica correspondente é conservada e agrupa-se no dendrograma com outras proteínas Cyp26B1, mesmo de organismos distantes como zebrafish, em detrimento de outras proteínas parálogas da família Cyp26. Cyp26b1 é fortemente induzida por atRA em células de glioma de rato e humano, de forma dose-dependente. Embora seja expresso em amostras de cérebros humanos normais e de glioma, não foram encontradas diferenças significativas entre os diferentes graus de matlignidade tumoral, ou em comparação com cérebro normal. A super-expressão de cyp26b1 de rato através de transfecção estável de células de glioma de rato e humano, bem como de células P19 de teratocarcinoma de camundongo, não alterou significativamente as características de crescimento celular, tanto em substrato sólido quanto em substrato semi-sólido. O tratamento prolongado de células C6 de glioma de rato com atRA levou à obtenção de uma população policlonal resistente aos efeitos anti-proliferativos de atRA, a partir da qual uma linhagem celular clonal resistente foi isolada com sucesso. Esta variante clonal, denominada linhagem celular C6R, apresenta inibição de crescimento por atRA diminuída, quando comparada com a linhagem celular C6 parental e com a variante ST1. Além disso, esta variante também mostrou uma tendência, embora não significativa estatisticamente, de gerar tumores maiores quando injetados no subcutâneo de camundongos do tipo nude. A expressão de genes previamente descritos como induzidos pelo tratamento com atRA em células ST1 é fortemente inibida na linhagem celular C6R. Além disso, menor expressão de RARβ, RARγ e CRABP-1 foi também observada em células C6R, enquanto que expressão muito maior de RXRγ e CRABP-2 foi encontrada nas células resistentes a atRA, em comparação com as células C6 parentais. Como conclusões gerais deste trabalho, foi proposto que cyp26b1 parece estar envolvido no metabolismo e detoxificação de atRA e parece não ser efetor da inibição de crescimento induzida por atRA, nem estar relacionado com a resistência de células de glioma ao tratamento com atRA. Por outro lado, o isolamento e caracterização de uma linhagem celular resistente ao tratamento com atRA sugere que a resistência está relacionada à expressão diferencial de receptores de retinóides e de proteínas de ligação ao ácido retinóico. / Gliomas are among the most common primary tumors of the central nervous system. Despite the advances in surgical and radiotherapy procedures and chemotherapy protocols, efficient treatment is still not available. Retinoic acid is a anti-proliferative agent used for treatment of a number of pre-malignant lesions and tumors, as promyelocytic leukemia. However, its clinical use in treatment of solid tumors, including gliomas, is impaired by the rapid development of resistance to the anti-tumoral effects of atRA. In order to address this problem, we proposed: a) to clone and analyze the role of rat cyp26b1, a member of cytochrome P450 superfamily envolved in the metabolization of retinoic acid, which has previously been described by our group as being potentially involved in the response of glioma cells to retinoic acid treatment; b) to generate and characterize a variant of rat C6 glioma cell line resistant to anti proliferative effects of atRA. The previously unknown cDNA of rat cyp26b1 was successfully amplified, cloned and sequenced. The protein is conserved and clustered in dendrograms with other cyp26b1 proteins, even from distant organisms as zebrafish, in detriment of other cyp26 paralogs. Cyp26b1 is strongly induced by atRA in rat and human glioma cells, in a dose-dependent fashion. Although expressed in human normal brains and glioma samples, no significant differences were found among different tumor grades nor comparing to normal brain. Stable-transfection and overexpression of rat cyp26b1 in rat and human glioma cell lines, as well as P19 mouse teratocarcinoma cell line, did not significantly modified cell growth properties, either on solid or semi-solid substrates. Prolonged treatment of C6 rat glioma cell line with atRA leads to isolation of an atRA-resistant polyclonal cell population, from which a resistant clonal cell line was successfully isolated. This clonal variant, named C6R cell line, displayed diminished growth inhibition by atRA compared to the parental C6 cell line and the variant ST1 cell line. In addition, this variant also showed a trend, although not quite statistically significant, to generate larger tumors when xenografted s.c. into nude mice. Expression of genes previously described as being induced by atRA-treatment in ST1 cells is strongly impaired in the C6R resistant cell line. In addition, lower expression of RARβ, RAR&#947 and CRABP-1 was also observed in C6R cells, whereas a much higher expression of RXRγ and CRABP-2 was found in the resistant cells when compared to the parental C6 cells. As general conclusions of this work, we found that cyp26b1 is more likely to be involved in primary atRA metabolism and detoxification and does not seem to be an effector of atRA-induced cell growth arrest nor to be related to the resistance of glioma cells to atRA treatment. On the other hand, isolation and characterization of an atRA-resistant cell line suggests that atRA resistance is more likely to be due to differential expression of retinoid receptors and retinoic acid binding proteins.

O ácido retinóico (AR) é sintetizado a partir de oxidações sucessivas do retinol. A última etapa de oxidação é catalisada pelas enzimas RALDHs. O estabelecimento da polaridade ântero-posterior (AP) do coração é crítico para a demarcação das regiões de efluxo (ventrículos) e de influxo (átrios). Nosso grupo propõe que uma onda caudo-rostral (CR) de RALDH2 seja o mecanismo responsável por esta padronização em vertebrados. Para testar o papel da sinalização pelo AR na padronização AP do peixe zebra, manipulamos sua via com o inibidor das enzimas RALDHs, DEAB, com AR e com um inibidor da enzima CYP26 (IC), que cataboliza o AR. Os tratamentos com DEAB durante o período da onda de RALDH2 produziram átrios reduzidos, enquanto que os tratados com AR e com IC apresentam o domínio atrial expandido. Animais tratados com DEAB e AR em um estágio posterior a onda não mostraram diferença significativa ao controle. Estes dados sugerem uma forte correlação entre o evento da onda e a padronização das câmaras cardíacas, semelhante ao que ocorre nos demais amniotos. / The retinoic acid (RA) is synthetized by successive oxidations of retinol. The last oxidation step is catalyzed by the RALDHs enzymes. The establishment of the anteroposterior (AP) polarity is critical for the demarcation of outflow (ventricle) and inflow (atrium) regions. Our group proposes that a caudorostral (CR) wave of RALDH2 is the mechanism responsible for this patterning in vertebrates. In order to test the role of the RA signaling in zebrafish AP patterning, we manipulated its pathway with a RALDH enzymatic inhibitor, DEAB, with RA and with a CYP26 (IC) enzymatic inhibitor, that catabolises the RA. The DEAB treatments during the manifestation of the RALDH wave produced reduced atriums; meanwhile, the treatments with RA and IC presented an atrium expansion. Animals treated with DEAB and RA during a stage posterior to the wave did not present any significant difference. These data suggest a strong correlation between the wave event and the cardiac chamber patterning, similar to the mechanism observed in others amniotes.

A deterioração oxidativa de alimentos é o fator determinante na qualidade sensorial e nutricional do produto, podendo ocorrer em alimentos complexos tanto na fase contínua como na fase dispersa. Em geral, a formação de radicais e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio é o evento primário que ocorre priori ao progresso da oxidação de componentes e estruturas sensíveis e está comumente associado a eventos na fase aquosa. A oxidação de lipídeos é frequentemente investigada em alimentos e em meio biológico separadamente dos eventos no meio aquoso e a proteção antioxidante somente avaliada na fase dispersa. Entretanto, a oxidação de proteínas e eventos na fase contínua vêm despertando considerável interesse e aparentemente antioxidantes eficientes na fase dispersa não protegem de forma eficaz as proteínas e os componentes na fase contínua. Um futuro progresso na proteção antioxidante de alimentos e sistemas biológicos origina de uma abordagem holística dos processos redox envolvidos em ambas as fases dispersa e contínua, bem como o uso combinado de espécies antioxidantes e antiredutoras para um superior efeito antiradical global. Neste sentido, foram preparados três novos compostos antiradicais de dupla função (antioxidante e antiredutor) com adequado balanço hidrofílico-lipofílico e aprimorada propriedade antiradical global. Os antiradicais diferulato de astaxantina, retinoato de quercetina e retinoato de epicatequina se mostraram melhores antioxidantes e antiredutores do que seus precursores isoladamente ou em misturas, apresentando superior eficiência na desativação do oxigênio singlete excitado, captação do radical 1-hidroxietila, menor efeito pró-oxidante em sistemas de oxidação catalisados por íons de ferro, e eficiência na redução do reativo estado triplete da safranina (E1/2 = 1,48 V vs. NHE). / The oxidative deterioration of foods is the determining factor in the sensory and nutritional quality of the product, which may occur in complex food both at the continuous and the dispersed phases. In general, the formation of radicals and reactive oxygen and nitrogen species is the primary event that occurs prior to the progress of oxidation of components and sensitive structures and is commonly associated with events in the aqueous phase. The oxidation of lipids is often investigated in food and biological media separately from the events in the aqueous phase and the measurement of the antioxidant protection is only evaluated in the dispersed phase. However, the oxidation of proteins and the events in the continuous phase have attracted considerable interest and apparently, efficient antioxidants in dispersed phase do not effectively protect proteins and components in the continuous phase. A further progress in the antioxidant protection of food and biological systems arise from a holistic approach of the redox processes involved in both the dispersed and continuous phases as well as the combined use of antioxidant and antireductant species for a superior overall antiradical effect. In this sense three new antiradical compounds with dual function (antioxidant and antireductant) were prepared with proper hydrophilic-lipophilic balance and global antiradical properties. The antiradicals astaxanthin diferulate, epicatechin retinoate, and quercetin retinoate are shown to be better antioxidant and antireductant than their precursors, isolated or in mixture, exhibiting enhanced singlet excited oxygen deactivation, 1-hydroxyethyl radical scavenging, lower pro-oxidative effect in the oxidative system catalysed by iron ions and an efficient reduction of the reactive triplet state of safranine (E1 / 2 = 1.48 V vs. NHE).

Este trabalho propôe o desenvolvimento de micropartículas para veiculação deste fármaco na pele, aumentando a estabilidade da molécula e proporcionando uma liberação sustentada, o que resulta na otimização da terapia, visto que ocorre a redução dos efeitos colaterais. As micropartículas foram produzidas por três métodos diferentes, os dois primeiros utilizando a quitosana como polímero e o último utilizando uma associação de alginato com quitosana. As micropartículas de quitosana resultaram em interação do fármaco veiculado com o polímero e desta forma a sua utilização como sistema de liberação para veiculação do fármaco estudado foi descartada. As micropartículas de alginato/quitosana encapsularam efetivamente o fármaco, resultando em partículas irregulares com diâmetro médio de 148m. Elas apresentaram liberação sustentada do ácido retinóico por um período compatível com sua utilização tópica e por isso, parecem ser adequados para garantir estabilidade ao fármaco. Além disso, elas diminuíram a retenção do fármaco no estrato córneo quando comparado ao fármaco livre, mantendo seus níveis nas outras camadas mais profundas da pele. Esse direcionamento sítio-específico poderia diminuir a sua irritação dérmica, possibilitando, dessa forma, juntamente com o aumento de sua estabilidade, a obtenção de efeitos terapêuticos com a utilização de doses menores. Também não foram observadas interações entre o fármaco e o polímero demonstrando que a matriz de alginato foi capaz de proteger o fármaco do contato e da interação com a quitosana. Além disso, o método utilizado mostrou ser simples e rápido, realizado em condições amenas, sem o inconveniente da utilização de agentes cross-linking químicos tóxicos, como o glutaraldeído. / This study proposes the development of microparticles for drug delivery into the skin, thus increasing molecule stability and providing sustained release that results in therapy optimization as a result of reduction in side-effects. The microparticles were produced by three different methods. The two first methods used chitosan as a polymer, and the third utilized a chitosanalginate association. The chitosan microparticles resulted in the interaction of the delivered drug with the polymer; hence, its use as a release system for delivery of the studied drug was disregarded. The alginate/chitosan microparticles effectively encapsulated the drug, resulting in irregular particles with a mean diameter of 148m. They exhibited sustained release of retinoic acid for a period of time that was compatible with topical application and, therefore, seem to be suitable to ensure drug stability. Additionally, the microparticles decreased drug retention in the stratum corneum as compared to the free drug, thus keeping its levels in other deeper layers of the skin. Such site-specific direction could reduce dermal irritation, consequently enabling, conjointly with stability increase, the achievement of therapeutic effects with the use of smaller doses. Drug-polymer interactions were also not observed, showing that the alginate matrix was capable of protecting the drug from the contact and interaction with chitosan. Besides, the applied method proved to be simple and fast. It can be performed in mild conditions without the inconvenience of using toxic cross-linking chemical agents, such as glutaraldehyde.