Ce travail porte sur l'étude de la microencapsulation d'huile de lin par coacervation complexe des protéines du lactosérum et de la gomme d'acacia. Il se focalise sur la coacervation des protéines du lactosérum et de la gomme d'acacia en milieu aqueux ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la formation des microcapsules par coacervation complexe. La coacervation complexe est un phénomène de séparation de phase associative induit par des interactions électrostatiques entre deux polymères. Le couple de polymères le plus utilisé en coacervation complexe est le système gélatine/gomme d'acacia. Cependant, pour des raisons sanitaires et religieuses, l'utilisation de la gélatine devient controversée pour les applications alimentaires. Un substituant intéressant à la gélatine est constitué par les protéines du lactosérum ainsi que leur composant majoritaire, la bêta-lactoglobuline. L'étude de la composition du coacervat du système protéines du lactosérum/gomme d'acacia a été réalisée lors de ce travail. L'électrophorèse capillaire sur gel a été employée afin de quantifier la bêtalactoglobuline et l'alpha-lactalbumine dans le coacervat. L'influence du ratio protéine/polysaccharide et du pH sur la composition du coacervat a été étudiée. Bien que le procédé d'encapsulation par coacervation complexe soit connu depuis de nombreuses années, les mécanismes conduisant à la formation des microcapsules restent peu décrits. Le procédé d'encapsulation par coacervation complexe conduisant à la formation des microcapsules est composé de plusieurs étapes nécessitant chacune d'être examinée. L'étape d'émulsification a lieu en régime d'écoulement intermédiaire. La modélisation en régime turbulent rend compte des résultats expérimentaux et pourrait être utilisée pour une transposition d'échelle. Le suivi in situ du procédé d'encapsulation par coacervation complexe a été réalisé pour la première fois lors de cette étude. Il a été réalisé au moyen d'une sonde vidéo immergée dans le réacteur agité. Cette technique a permis de relever quatre étapes successives induites par l'abaissement du pH. Les influences des paramètres physico-chimiques (ratio protéine/polysaccharide et concentration totale en biopolymères) et des paramètres liés à l'étape de coacervation sur la formation des microcapsules ont aussi été étudiées au moyen de la sonde vidéo. Coacervation complexe, encapsulation, protéines du lactosérum, électrophorèse capillaire, suivi in situ, émulsification / This work deals with the study of linseed oil microencapsulation by complex coacervation of whey proteins and acacia gum. It focuses on the coacervation of whey proteins and acacia gum in aqueous medium as well as the mechanisms involved in the formation of microcapsules by complex coacervation. Complex coacervation is an associative phase separation phenomenon induced by electrostatic interactions between two polymers. The most widely used pair of polymers in complex coacervation is the system gelatin / acacia gum. However, the use of gelatin is a matter of controversy for food applications. An interesting alternative to gelatin consists of whey proteins and their major component, beta-lactoglobulin. An investigation of the composition of the coacervate system whey protein / acacia gum was carried out during this work. Capillary gel electrophoresis was used to quantify beta-lactoglobulin and alphalactalbumin in the coacervate. The influence of protein / polysaccharide ratio and pH on the composition of the coacervate was studied. Although the encapsulation process by complex coacervation has been known for many years, the mechanisms leading to the formation of microcapsules are not so much described. The encapsulation process by complex coacervation leading to the formation of microcapsules includes several stages that were examined. The emulsification step takes place in the intermediate flow regime. The modeling in turbulent regime accounted for experimental results and might be used for scaling-up the process. In situ monitoring of the encapsulation process by complex coacervation was performed for the first time in this study. It was carried out using a video probe immersed in a stirred reactor. This technique identified four successive steps induced by lowering the pH: the emulsification of the oil, the formation of the coacervate, the adsorption of the coacervate on the oil droplets, the formation of an encapsulation shell. The influence of physico-chemical parameters (protein / polysaccharide ratio and total concentration of biopolymers) and parameters related to the coacervation step on the formation of microcapsules were also studied by using the video probe

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative liée à l’oligomérisation et à la fibrillation du peptide bêta amyloïde, avec Abêta 1-42 étant le plus agrégeant et neurotoxique. La cause exacte de la maladie d'Alzheimer n’est pas encore connue et donc il n'y a pas de traitement efficace contre cette maladie.Une stratégie prometteuse pourrait être l'inhibition de l'oligomérisation de monomères solubles d'Abêta;, en stabilisant la conformation non structurée native du peptide, à travers l’utilisation de composés capables d'empêcher la formation de feuillets bêta. En effet, les peu d'études structurales des espèces oligomériques et des fibrilles ont révélé que l'agrégation implique des structures en feuillet bêta.De nombreuses petites molécules ont été proposées pour leur capacité à inhiber ou moduler l'agrégation de Abêta 1-42 et sa toxicité. Cependant, le processus d'agrégation est très complexe et difficile à contrôler. Des études récentes indiquent que les oligomères solubles transitoires précédant la formation de fibrilles sont les espèces les plus toxiques. Ainsi, le développement d'inhibiteurs ciblant à la fois l’oligomérisation et la fibrillation reste difficile en dépit de son importance thérapeutique. Les peptides sont des alternatives raisonnables aux autres produits pharmaceutiques chimiques. En particulier, l'inhibition de l'agrégation de Abêta; a été ciblée en utilisant des éléments d'auto-reconnaissance (SRE), qui sont des séquences d'acides aminés clés impliqués dans les différentes espèces agrégées. À notre connaissance, l'utilisation de petites "bêta-hairpins" acycliques a été très rarement explorée comme ligands de feuillets-bêta et comme inhibiteurs de l'agrégation.Comme l’agrégation de Abêta est un processus dynamique et complexe, nous avons supposé que les "bêta-hairpins" flexibles pourraient mieux s'adapter dans l'interaction avec les différentes conformations de Abêta 1-42 présents pendant le processus d'agrégation, et en particulier dans les premiers stades de l'oligomérisation. Nous avons conçu des mimes de feuillets bêta acycliques basés sur un squelette semi-rigide de type pipéridine-pyrrolidine comme inducteur flexible de coude bêta, et sur différents SREs de Abêta 1-42. Le choix des SREs a été basée sur les structures d'oligomères et fibrilles.La capacité de tous les composés a été évaluée par spectroscopie de fluorescence à la thioflavine-T pour déterminer l'activité inhibitrice. Les résultats obtenus ont été complétés par microscopie à transmission électronique. Les composés les plus prometteurs ont également été étudiés par électrophorèse capillaire (EC) pour suivre les étapes très précoces du processus d'oligomérisation. Les meilleurs inhibiteurs ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à réduire la toxicité de Abêta 1-42 sur des cellules de neuroblastome SH-SY5Y.Nous rapportons également dans cette thèse les études conformationnelles, effectuées par RMN et réalisées pour étudier et confirmer la capacité de composés de se structurer en solution comme des "bêta-hairpins".Enfin, nous avons développé une voie de synthèse pour obtenir de nouvelles chaînes peptidomimétiques composées par des résidus aza-aminoacides. Dans la littérature, seules des séquences peptidiques comportant un seul résidu aza-aminoacide au milieu, sont connues, mais les propriétés de liaison hydrogène d’un 2:1 [aza/alpha]-tripeptide ne sont pas encore, à notre connaissance, étudiées ni exploitées dans la conception d’inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Nous présentons dans cette thèse les études conformationelles réalisées par RMN, cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire.On peut conclure que les éléments structurels décrits dans cette thèse fournissent des indications précieuses dans la compréhension du processus d'agrégation du peptide Abêta 1-42 et dans la conception de nouveaux " bêta-hairpins" acycliques ciblant des protéines amyloïdes. / Amyloidosis is the generic word to name a group of diseases that are caused by the misfolding and extracellular accumulation of various proteins. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder linked to oligomerization and fibrillization of amyloid β peptides, with Aβ 1-42 being the most aggregative and neurotoxic one. To date, the exactly cause of the Alzheimer's disease is not still known and so there is no effective treatment of the disease.An attractive strategy for treating AD could be the inhibition of the oligomerization of soluble Aβ monomers, by stabilizing the native unstructured conformation of the peptide, using compounds able to prevent the formation of β-sheets. Indeed, few structural studies of oligomeric species and fibrils revealed that the aggregation involves β-sheet structures.A large number of small molecules have been proposed for their ability to inhibit or modulate Aβ1-42 aggregation and toxicity. However, the aggregation process is highly complex, and extremely difficult to control. Recent studies indicate that soluble transient oligomers preceding fibril formation are highly toxic species. Thus, the development of inhibitors targeting both oligomerization and fibrillization remains challenging despite its therapeutic significance. Peptides are today reasonable alternatives to small molecule pharmaceuticals. In particular, inhibition of Aβ-aggregation has been targeted using self-recognition elements (SREs), which are key amino acid sequences involved in the different aggregated species. To our knowledge, the use of small acyclic β-hairpins has been very rarely explored as β-sheet binders and inhibitors of aggregation.As Aβ-aggregation is a dynamic and complex process, we hypothesized that flexible β-hairpins could adapt themselves in the interaction with the different Aβ1-42 conformations present during the aggregation process, and in particular in the early stages of oligomerization. We designed acyclic β-hairpin mimics based on a piperidine-pyrrolidine semi-rigid scaffold developed recently as a flexible β-turn inducer, and on different SREs of Aβ1-42. The choice of the SREs was based on oligomer and fibril structures.The ability of all compounds to influence the Aβ 1-42 fibrillization process was evaluated by thioflavin-T fluorescence spectroscopy, used as an evaluation tool to define the inhibitory activity. The obtained results were successively supplemented by transmission electron microscopy. The most promising compounds were also studied by Capillary Electrophoresis (CE) using a method we recently proposed to monitor the very early steps of the oligomerization process overtime. The best inhibitors were investigated to determine their ability to reduce the toxicity of aggregated Aβ1-42 to SH-SY5Y neuroblastoma cells.Together with the evaluation of these molecules, we report in this thesis the conformational studies performed by NMR. These structure investigations were performed to investigate and confirm the β-hairpin conformational preference of the compounds in solution.Finally, we performed a practical synthetic pathway to obtain new peptidomimetic chains composed by aza-amino acid residues. In the literature only peptide sequence, with just one aza-amino acid residue in the middle, are known, but the hydrogen-bonding properties of 2:1 [Aza/α]-tripeptides have not yet, to our knowledge, been exploited in the design of the inhibition of protein-protein interactions. We present in this thesis the conformational studies of the 2:1 [Aza/α]-tripeptide sequence by NMR analyses, X-ray crystallography and molecular modelling.In conclusion, the structural elements made in this thesis provide valuable insights in the understanding of the aggregation process of Aβ 1-42 peptide and to explore the design of novel acyclic β-hairpin targeting amyloid-forming proteins.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.

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La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique. / Proteomics is a field of growing interest because the study of protein function and structure is essential to understand how an organism operates. This project is concerned with structural studies, or more precisely the primary amino acid sequence for identification of proteins. Protein determination starts with a protein extract obtained from tissue or a biological fluid, which can contain more than 1000 distinct proteins. Analytical techniques like two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-SDS-PAGE), which separates proteins based on their isoelectric point and molar mass, are then used to isolate the different proteins and permit their identification by liquid chromatography and mass spectrometry (MS) typically. This project, inspired by the fractionation of a protein extract by 2D-SDS-PAGE, proposes to support or to replace it with multiple fractionations by capillary electrophoresis (CE) in a quasi-multidimensional scheme. The individual fractions, containing a single protein or a mixture of proteins much less complex than the original extract, would then be analyzed to identify the proteins by peptide mapping and by protein mass mapping using analytical separation techniques and MS. To obtain a peptide map of proteins isolated in a fraction, enzymatic or chemical proteolysis is carried out and the peptide fragments in the digest are separated. The generated peptide map is either compared to a second sample to reveal changes, or the exact masses of the peptides are submitted to search engine like MASCOT™, which permits the identification of proteins by interrogation of genomic data bases. The exploitable advantages of CE compared to 2D-SDS-PAGE are its high separation efficiency, its rapid analysis and its easy automation. The challenge to overcome is its small quantity of mass available after CE fractionation due in part to protein adsorption on the capillary walls, but due mainly to the tiny sample volumes used in CE. To increase mass, a 75 µm ID capillary was used in this study. Also, the volume into which each fraction is collected was decreased from 1000 to 100 µL and each fraction was collected 10 times; in other words 10 injections of the protein mixture were made. On the other hand, protein adsorption leads to variations in peak area and migration time of a given protein which influences the repeatability of CE separations, a very important aspect since 10 cumulative separations are needed for fraction collection. There are numerous approaches to reduce this problem (e.g. using pH extremes for the background electrolyte, using dynamic or permanent capillary coatings, etc.) but in this project, studies focused on didodecyldimethylammonium bromide (DDAB), a surfactant that forms a semi-permanent wall coating in the capillary. The majority of work presented here was aimed at obtaining a reproducible CE separation of a standard protein mixture prepared in house (containing bovine serum albumin, carbonic anhydrase, α-lactalbumin and β-lactoglobulin) while using the DDAB coating. Studies of this particular coating material revealed that it was necessary to regenerate the DDAB coating between each injection of the protein mixture under the studied conditions: collection of 5 fractions of 6 min each across a 30-min separation that followed the DDAB regeneration, repeated 10 times. However, CE-UV and HPLC-MS analyses of the collected fractions showed none of the expected proteins present; they seemed to be below the instrument detection limits. In addition, the MS analyses revealed that DDAB had accumulated in the collected fractions due to its desorption from the capillary walls. To confirm that our efforts to collect a certain protein mass were sufficient, CE coupled to laser-induced fluorescence detection (CE-LIF) was used to separate and then collect the protein albumin labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) without the DDAB coating in the capillary. Analyses demonstrated that albumin-FITC was, in fact, present in the collected fraction. Peptide mapping was then successfully carried out using the enzyme chymotrypsin for digestion and CE-LIF for peptide mapping.

Réalisé en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort. / L’objectif principal de ce projet de recherche est d’étudier l’efficacité de la microencapsulation, technique d’immobilisation d’enzymes utilisée pour la réalisation des nouveaux biocapteurs électrochimiques. Généralement, l’analyte d’intérêt produit ou consomme des électrons, et la réponse électrochimique est mesurée, afin d’identifier ou quantifier l’analyte. Dans le développement d’un biocapteur, il est désirable de quantifier la conversion du substrat (analyte) et/ou la formation de produit de réaction enzymatique. Les similarités structurales entre le substrat et le produit de réaction dans les réactions redox demandent que la technique utilisée pour les identifier soit très sélective. Le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse capillaire (EC) pour des séparations rapides de produits similaires en fait une méthode de choix, spécialement quand le substrat et le produit peuvent être suivis pendant et après la réaction catalysée par l’enzyme immobilisée. Un choix judicieux du substrat, compte tenu de son comportement en EC peut fournir des informations autant sur l’activité de l’enzyme que sur l’efficacité de la microencapsulation. Pour cette raison, nous avons choisi le substrat o-phenylènediamine qui est oxydé par la laccase, pour former le produit 2,3-diaminophenazine, tout en réduisant l’oxygène en eau. Pour commencer, nous avons préparé les microcapsules et évalué l’impact de la microencapsulation sur le comportement de l’enzyme. Ensuite, nous avons développé une méthode de séparation en EC afin de quantifier la conversion de l’OPD en DAP par la laccase libre. La même méthode d’analyse a été utilisée pour caractériser la laccase immobilisée dans les microcapsules. Par la suite, afin de suivre la réaction enzymatique, un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée a été couplé hors ligne au système d’EC. Finalement, nous avons essayé l’implémentation du système en ligne et les résultats préliminaires seront présentés. / The principal objective of this research project is to study the efficiency of microencapsulation, technique used for enzyme immobilization in order to create new types of electrochemical biosensors. Generally, the target analyte involved either produces or consumes electrons and the electrochemical response is measured to identify or quantify the analyte. In the development of a biosensor, it is desirable to quantify the conversion of substrate (analyte) and/or the formation of product of the enzymatic reaction. The structural similarity between substrate and product in redox reactions means that the technique used to determine these species must be very selective. The high resolving power of capillary electrophoresis (CE) for rapidly separating similar compounds is thus an attractive method, particularly if substrate and product can both be monitored during or following the reaction catalyzed by microencapsulated enzyme. A judicious choice of substrate with respect to its behaviour in CE separations can help provide information on enzyme activity as well as microencapsulation efficiency. To achieve this, we chose the substrate o-phenylenediamine (OPD), which is oxidized by laccase to form the product 2,3-diaminophenazine (DAP) concomitant with the reduction of molecular oxygen to water. We firstly prepared the microcapsules and evaluate the impact of microencapsulation on the behaviour of the enzyme. After that, we developed a CE based separation method to quantify the conversion of OPD to DAP by free laccase. We also used the CE method to characterize laccase immobilized in microcapsules. Subsequent, the microencapsulated laccase was packed into a microreactor format permitting its off-line coupling with CE as a means to follow the enzymatic reaction. Finally, we tried to implement the on-line system and the preliminaries results are presented.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Une partie des recherches actuelles dans le domaine de l’analyse chimique concerne la miniaturisation et l’intégration d’étapes analytiques afin de répondre, entre autres, à des besoins de portabilité, d’automatisation mais aussi d’apporter des solutions pour analyser des échantillons de plus en plus petits. Le développement et la mise en œuvre de colonnes monolithiques d’affinité boronate (µBAMC) couplées « in-line » à des techniques séparatives miniaturisées s’inscrit dans cette démarche. Ce travail de thèse s’est focalisé sur (1) une compréhension des mécanismes de rétention en chromatographie d’affinité boronate (interactions spécifiques avec les composés cis-diols, conditions de reconnaissance, interactions secondaires), (2) le développement de supports monolithiques d’affinité boronate miniaturisés et (3) leur couplage «in-line» avec une séparation électrocinétique et détection conventionnelle dans un format capillaire. Différentes voies d’élaboration de colonnes monolithiques ont été comparées (en termes d’affinité, de nombre de sites boronate actifs et de stabilité). La faisabilité du couplage en ligne de ces supports µBAMC avec une étape de séparation électrophorétique (par CZE et CIEF) a été démontrée vis-à-vis de la purification/préconcentration et séparation de 3 catécholamines contenant des groupements cis-diols (Adrénaline, Noradrénaline et Dopamine) dans l’urine. Les couplages ont été optimisés avec succès permettant l’analyse automatisée et miniaturisée de ces neurotransmetteurs dans l’urine (volume échantillon < 10 µL) avec des limites de détection de l’ordre de la dizaine de ppb et des taux de récupération proches de 100 % / Part of the current research in the field of chemical analysis concerns the miniaturization and the integration of analytical steps in order to meet, among other things, the need of portability and automation but also to provide solutions for analyzing small samples. The development and implementation of monolithic boronate affinity columns (µBAMC) in-line coupled to miniaturized separation techniques is part of this approach. This thesis work focused on (1) an understanding of the retention mechanisms in boronate affinity chromatography (specific interactions with cis-diol compounds, recognition conditions and secondary interactions), (2) the development of miniaturized boronate affinity monolithic supports and (3) their in-line coupling with electrokinetic separation and conventional detection in a capillary format. Different ways of elaboration of monolithic columns were compared (in terms of affinity, number of actives sites and stability). The feasibility of in-line coupling of these µBAMC supports with an electrophoretic separation step (by CZE and CIEF) has been demonstrated in terms of purification / preconcentration and separation of 3 catecholamines containing cis-diol groups (adrenaline, noradrenaline and dopamine) in urine. The couplings have been successfully optimized allowing the automated and miniaturized analysis of these neurotransmitters in urine (sample volume <10 µl) with limits of detection of about the tens of ppb and recovery yields close to 100 %

L’objectif principal de ce projet de recherche est d’étudier l’efficacité de la microencapsulation, technique d’immobilisation d’enzymes utilisée pour la réalisation des nouveaux biocapteurs électrochimiques. Généralement, l’analyte d’intérêt produit ou consomme des électrons, et la réponse électrochimique est mesurée, afin d’identifier ou quantifier l’analyte. Dans le développement d’un biocapteur, il est désirable de quantifier la conversion du substrat (analyte) et/ou la formation de produit de réaction enzymatique. Les similarités structurales entre le substrat et le produit de réaction dans les réactions redox demandent que la technique utilisée pour les identifier soit très sélective. Le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse capillaire (EC) pour des séparations rapides de produits similaires en fait une méthode de choix, spécialement quand le substrat et le produit peuvent être suivis pendant et après la réaction catalysée par l’enzyme immobilisée. Un choix judicieux du substrat, compte tenu de son comportement en EC peut fournir des informations autant sur l’activité de l’enzyme que sur l’efficacité de la microencapsulation. Pour cette raison, nous avons choisi le substrat o-phenylènediamine qui est oxydé par la laccase, pour former le produit 2,3-diaminophenazine, tout en réduisant l’oxygène en eau. Pour commencer, nous avons préparé les microcapsules et évalué l’impact de la microencapsulation sur le comportement de l’enzyme. Ensuite, nous avons développé une méthode de séparation en EC afin de quantifier la conversion de l’OPD en DAP par la laccase libre. La même méthode d’analyse a été utilisée pour caractériser la laccase immobilisée dans les microcapsules. Par la suite, afin de suivre la réaction enzymatique, un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée a été couplé hors ligne au système d’EC. Finalement, nous avons essayé l’implémentation du système en ligne et les résultats préliminaires seront présentés. / The principal objective of this research project is to study the efficiency of microencapsulation, technique used for enzyme immobilization in order to create new types of electrochemical biosensors. Generally, the target analyte involved either produces or consumes electrons and the electrochemical response is measured to identify or quantify the analyte. In the development of a biosensor, it is desirable to quantify the conversion of substrate (analyte) and/or the formation of product of the enzymatic reaction. The structural similarity between substrate and product in redox reactions means that the technique used to determine these species must be very selective. The high resolving power of capillary electrophoresis (CE) for rapidly separating similar compounds is thus an attractive method, particularly if substrate and product can both be monitored during or following the reaction catalyzed by microencapsulated enzyme. A judicious choice of substrate with respect to its behaviour in CE separations can help provide information on enzyme activity as well as microencapsulation efficiency. To achieve this, we chose the substrate o-phenylenediamine (OPD), which is oxidized by laccase to form the product 2,3-diaminophenazine (DAP) concomitant with the reduction of molecular oxygen to water. We firstly prepared the microcapsules and evaluate the impact of microencapsulation on the behaviour of the enzyme. After that, we developed a CE based separation method to quantify the conversion of OPD to DAP by free laccase. We also used the CE method to characterize laccase immobilized in microcapsules. Subsequent, the microencapsulated laccase was packed into a microreactor format permitting its off-line coupling with CE as a means to follow the enzymatic reaction. Finally, we tried to implement the on-line system and the preliminaries results are presented. / Réalisé en codirection avec Karen C. Waldron et Dominic Rochefort.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal