Le développement du rein est un exemple intriguant d’un équilibre délicat entre la prolifération des cellules progénitrices, la différentiation et l’apoptose. Le gène Wt1 est indispensable pour la survie des cellules progénitrices. Le but de cette thèse a été de définir les voies de signalisation activées par Wt1 pendant le développement du rein. En utilisant les souris Wt1 KO, nous avons démontré que WT1 coordonne l’action de deux voies de signalisation opposées : Fgf et Bmp/Smad intervenant dans la survie des cellules progénitrices rénales. Dans une deuxième étude, nous avons analysé le rôle du modificateur épigénétique, le gène Phf19 pendant le développement du rein. Nous avons démontré que l’expression de ce gène est Wt1-dependant et il est exclusivement exprimé dans les cellules progénitrices rénales au cours du développement et que son inactivation dans le rein embryonnaire en culture, conduit à l’apoptose des cellules progénitrices. Nous avons généré des souris knockout de Phf19 par l’approche de CRISPR/Cas9. Dans le cas d’une létalité précoce des embryons homozygotes, nous opterons pour la production du model animal knockout conditionnel et procéderons à la caractérisation de leur profile épigénétique. Cette thèse a permis d’une part, de découvrir deux voies de signalisation antagonistes, régulées par le Wt1et impliquées dans le contrôle de la survie des cellules progénitrices rénales et d’autre part de nous orienter vers le contrôle de la survie et la prolifération de ces cellules par modifications épigénétiques. Ceci nous permettra de contribuer à la connaissance de l’étiologie d’une grande proportion des malformations rénales restant à ce jour inconnues. / Kidney organogenesis requires the tight control of proliferation, differentiation and apoptosis of renal progenitor cells. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is required for renal progenitor survival. The aim of this thesis was to elucidate the molecular cause for renal agenesis in Wt1 mutant mouse. Here we demonstrate that lack of Wt1 abolishes FGF and induces BMP/pSMAD signaling within the metanephric mesenchyme. We further show that recombinant BMP4, but not BMP7, induces an apoptotic response within the early kidney that can be suppressed by simultaneous addition of FGFs. These data reveal an unknown sensitivity of early renal progenitors to pSMAD signalling, establishes FGF and pSMAD signalling as antagonistic forces in early kidney development and places WT1 as a key regulator of pro-survival FGF signalling pathway genes. In a second study, we demonstrated, that Phf19, an epigenetic modifier, is essential both for maintaining Wt1 expression in renal progenitor cells and their survival in an ex-vivo culture. We further generated a Phf19 knockout mouse by CRISPR/Cas9. The homozygous embryos will be analyzed to further decipher the contribution of Phf19 to potential kidney malformations and the epigenetic profile of renal progenitor cells will be characterized. Overall, the new insights into the molecular mechanisms controlling the survival of renal progenitor cells, reported in this thesis, provide one more step in our understanding of renal malformations. In addition, our results conducted us toward the epigenetique modifications that could open up promising new avenue of understanding the etiology of an important proportion of renal malformation that remains unknown.

La protéine UHRF1 est impliquée dans le maintien et la transmission des modifications épigénétiques. Lors du processus de réplication, elle recrute la méthyltransférase de l’ADN Dnmt1 au niveau des sites CpG hémi-méthylés via son domaine SRA (SET and RING Associated), favorisant la duplication des profils de méthylation. La structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN révèle que la protéine induit un basculement de la méthylcytosine qui permet un ancrage spécifique de la protéine sur les sites hémim éthylés, facilitant le recrutement de la Dnmt1 au niveau de ces positions stratégiques. Dans ce contexte, notre projet vise à comprendre les mécanismes d’interaction du domaine SRA de UHRF1 avec l’ADN hémi-méthylé. Des oligonucléotides doubles brins ont été marqués à la 2-aminopurine, un analogue nucléosidique fluorescent sensible à l’environnement, à différentes positions au voisinage d’un unique site de reconnaissance CpG hémi-méthylé. Les mesures de spectroscopie de fluorescence à l’état stationnaire et résolues en temps de ces duplexes liés au domaine SRA nous ont permis de caractériser de manière site spécifique les changements conformationnels induits par la liaison du domaine SRA. En accord avec la structure tridimensionnelle du complexe SRA/ADN, nos données suggèrent que le domaine SRA est capable de basculer la méthylcytosine tout en préservant la structure des autres bases dans le duplexe. Le domaine SRA semble se lier selon le même mécanisme aux duplexes hémi-méthylés, bi-méthylés et non-méthylés. La protéine UHRF1 jouerait ainsi un rôle de “lecteur“ capable de scanner la séquence d’ADN à la recherche de sites hémi-méthylés. / The UHRF1 protein plays a key role in the maintenance and transmission of epigenetic modifications. Duringthe replication process, it recruits the DNA methyltransferase Dnmt1 to hemi-methylated CpG sites via itsSRA (SET and RING Associated) domain, promoting the duplication of the methylation profiles. Thetridimensional structure of the SRA/DNA complex revealed that the protein induces a base-flipping of themethylcytosine that enables a specific anchoring of the protein to hemi-methylated sites facilitating therecruitment of Dnmt1 to this strategic position. In this context, our project was aimed to further understand themechanism of interaction of the SRA domain with hemi-methylated DNA. To this end, oligonucleotideduplexes were labeled by 2-aminopurine, a fluorescent nucleoside analogue sensitive to environment, atvarious positions close to the single hemi-methylated CpG recognition site. Steady-state and time-resolvedfluorescence spectroscopy measurements of these duplexes bound to the SRA domain enabled us to sitespecificallycharacterize the conformational changes induced by the binding of this domain. In agreement withthe tridimensional structure of the SRA/DNA complex, our data suggest that the SRA domain is able to flip themethylcytosine while preserving the structure of the surrounding bases in the duplex. The SRA domain wasshown to bind with the same mechanism to hemi-methylated, fully-methylated and non-methylated duplexes.Our data suggest the UHRF1 protein plays a role of “reader” that scans the DNA sequence for hemimethylatedsites.

Le principal intérêt de nos études présentées dans ce manuscrit, correspond à la compréhension des évènements, reliés aux acylations d’histones au niveau des lysines (Ks) dans les cellules germinales post méiotiques, qui régulent spécifiquement l’expression des gènes à l’échelle du génome entier.Dans la première partie de mon travail, nous avons élaboré une stratégie afin d’analyser le rôle des « histones acetyl transférases » (HATs), Cbp et p300, dans les cellules germinales post méiotiques. Pour ce faire, nous avons généré une lignée de souris conditionnellement et partiellement invalidée pour les gènes Cbp et p300 dans les cellules post méiotiques. Bien que les souris mâles sont fertiles et que la spermatogénèse semble se dérouler normalement, une analyse transcriptomique des cellules germinales haploïdes post méiotiques précoces et tardives nous a permis d’identifier une série de gènes dont l’expression est augmentée dans les cellules spermatogéniques tardives et qui sont sensibles à la diminution des niveaux de Cbp et p300. Ces résultats ont permis de révéler un programme spécifique d’expression de gènes dans les cellules germinales post méiotiques dépendant des HATs correspondantes.Prenant en compte qu’il existe une variété d’acylations des histones au niveau des lysines, nous avons étendu nos études à une modification à « quatre-carbone », la butyrylation. Nous avons alors initié une analyse comparative de l’acétylation et de la butyrylation de l’histone H₄ en positions K5 et K8 dans les cellules germinales mâles en différentiation. Nous avons cartographié à l’échelle du génome les marques H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac, et H4K8bu au niveau de deux étapes développementales critiques avec les cellules méiotiques et les cellules post méiotiques haploïdes. Cette cartographie montre que la majorité des gènes exprimés fortement, à la fois dans les cellules méiotiques et les spermatides précoces rondes haploïdes, qu’au niveau des sites d’initiation de la transcription (TSSs) l’acétylation et la butyrylation sont interchangeables. De façon intéressante, beaucoup de ces promoteurs correspondants sont aussi reconnus par un régulateur essentiel de l’expression des gènes lors de la spermatogénèse, le factor à bromodomaine, Brdt. Une étude détaillée, des capacités de liaison du facteur Brdt sur les parties N-terminales de l’histone H4 portant des combinaisons variées d’acétylation et/ou de butyrylation en position K5 et K8, montre que la marque H4K5bu inhibe fortement la liaison du facteur Brdt. Nos résultats suggèrent qu’en addition à la fonction activatrice de Brdt vis-à-vis du programme d’expression de gènes méiotiques et post méiotiques, l’échange (« turnover ») induit par la butyrylation d’H4K5 est également important. Ce travail montre comment une interconnexion entre deux différentes acylations d’une même lysine peut jouer un rôle régulateur essentiel en augmentant la dynamique de liaison de la chromatine par un lecteur de lysine acétylé, Brdt.Enfin, au cours d’un travail collaboratif portant sur des approches structurales, nous avons montré, malgré le fait que p300 soit répertoriée comme une acétylase robuste, que son activité est réduite lorsque la longueur des chaines acyl augmente. Ces résultats suggèrent qu’in vivo, p300 puisse utiliser un co-facteur spécifique pour assurer des acylations d’histones autre qu’une acétylation.Ces investigations mettent en lumière comment la programmation du génome mâle est guidée par diverses acylations d’histone et révèlent pour la première fois l’existence d’un réseau moléculaire qui régule ces acylations et transmet un impact fonctionnel. / The main focus of the investigations reported in this manuscript is the understanding of the regulatory events that are based on histone lysine modifications in post-meiotic male germ cells, where specific and chromosome-wide regulations of gene expression occur. In the first part of my work we designed a strategy to specifically investigate the role of the histone acetyl-transferases (HATs), Cbp and p300, in post-meiotic male germ cells.Accordingly, we generated double Cbp and p300 conditional knock-out mice resulting in a partial depletion of Cbp and p300 in post-meiotic cells. Although the mice were fertile and spermatogenesis seemed to take place normally, a transcriptomic analysis of early and late post-meiotic germ cells led to the identification of a specific subset of genes with an increased expression in late spermatogenic cells that is highly sensitive to the decreased amounts of Cbp and p300. In conclusion, these results have revealed an interesting new gene expression program specific to post-meiotic male germ cells that are specifically regulated by the considered HATs.Taking into account the occurrence of a variety of histone lysine acylations, we extended these investigations to a four-carbon histone lysine modification, butyrylation. Accordingly, we have undertaken a comprehensive comparative analysis of histone H4 acetylation and butyrylation on its K5 and K8 positions in differentiating male germ cells. Genome-wide mapping of H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac and H4K8bu at two critical developmental stages, meiotic and post-meiotic haploid cells, shows an interchangeable use of acetylation and butyrylation in the Transcriptional Start Sites (TSSs) of the most highly expressed genes in both meiotic and haploid round spermatids. Interestingly, many of these promoters are also bound by the essential regulator of spermatogenic gene expression, the BET bromodomain-containing factor, Brdt. A detailed analysis of Brdt binding capacity of H4 tails bearing various combinations of K5 and K8 acetylation and butyrylation showed that H4K5 butyrylation severely interferes with Brdt-binding. Our results therefore indicate that not only Brdt is required for the activation of a meiotic and post-meiotic gene expression program, but also its turnover induced by H4K5 butyrylation is equally important. This work hence highlights how an interplay between two different acylations occurring on the same lysines can play an essential regulatory role by increasing the chromatin binding dynamics of a critical lysine acetyl-reader, Brdt.Finally, in a collaborative work with structural biologists we showed that while p300 is a robust acetylase, its activity gets weaker with increasing acyl chain length. These results suggest that in vivo, p300 would use a specific co-factor to ensure non-acetyl histone acylations.Overall, these investigations shed an important light on how the male genome programming is guided by histone acylations and revealed for the first time a molecular network that regulates histone acylations and mediates its functional impact.

Des études chez les animaux ont montré que ZRF1 a une fonction lectrice au niveau de H2Aub1 dans la dérépression de gènes réprimés par polycomb. Deux gènes homologues au gène humain ZRF1 ont été identifiés dans le génome d'Arabidopsis, et ont par la suite été appelés AtZRF1 a etAtZRF1 b. La caractérisation fonctionnelle de ces gènes n'a pas encore été rapportée. Ma première objective était d'obtenir des connaissances générales sur AtZRF1 a et AtZRF1 b. Tous les deux sont exprimés dans des plantes d'Arabidopsis et la protéine AtZRF1 b est localisée dans le noyau et dans le cytoplasme. En plus, nous avons trouvé que la protéine AtZRF1 b lie H2Aub1 avec les mêmes caractéristiques que la protéine ZRF1 humaine. J'ai utilisé les outils génétiques puissants disponibles pour Arabidopsis pour étudier la fonction d'AtZRF1 a et AtZRF1 b. Plusieurs lignées d'insertion de T-DNA indépendantes ont été identifiées. A cause d'une rédondance fonctionelle,des mutants simples n'ont pas de défauts de développement évidents. C'est pourquoi j'ai étudié un mutant double qui montrent une perte de fonction pour les deux gènes AtZRF1 a et AtZRF1 b. Ce double mutant révèle des rôles importants pour ces gènes dans la croissance et le développement,qui vont de la prolifération cellulaire et la différenciation jusqu'au contrôle du temps de floraison. J'ai ensuite étudié les rôles d'AtZRF1 a et AtZRF1 b dans la régulation de la transcription et j'ai constaté que AtZRF1 a et AtZRF1 b ont une fonction similaire a PRC1. Finalement, j'ai étudié les niveaux de H3K4me3, H3K27me3 et H2Aub1 dans la chromatine de certains gènes dont l'expression est perturbée dans les doubles mutants. Les résultats montrent que la déubiquitination de H2Aubi1 n'est pas un événement majeur dans la régulation de la transcription chez Arabidopsis. / Studies in animais show that ZRF1 can read the histone H2AK119ub1 modification in the derepression of polycomb-repressed genes. Two homologs of human ZRF1 have been identified in the Arabidopsis genome, and here in after are named AtZRF1 a and AtZRF1 b. So far, their functional characterization had not been reported. My first objective was to acquire basic knowledge about AtZRF1 a and AtZRF1 b. Both are broadly expressed in Arabidopsis plants and the AtZRF1 b protein is localized in the nucleus and thecytoplasm. Moreover, we found that AtZRF1 b binds H2Aub1 with characteristics similar to those previously reported for the human ZRF1 protein. I subsequently used the powerful genetic tools available in Arabidopsis to investigate the AtZRF1 a and AtZRF1b function. Several independent T-DNA insertion Arabidopsis mutant lines were identified. Because of functional redundancy, single mutants have no obvious developmental defects. I therefore focused on double mutants displaying loss of function of both AtZRF1a and AtZRF1 b. The study of a double mutant revealed important roles for these genes in plant growth and development ranging from cell proliferation and differentiation to flowering time control.I then investigated the roles of AtZRF1 a and AtZRF1 b in gene transcription regulation and found that AtZRF1a and AtZRF1 b function in a way that is partially similar to PRC1 function. Lastly, I investigated H3K4me3, H3K27me3 and H2Aub1 levels in the chromatin regions of some expression-perturbed genes in double mutants. The results show that ZRF1-mediated deubiquitination of H2Aub1 is not a major event in transcription regulation in Arabidopsis.

Le cancer gastrique (CG) est traité par résection chirurgicale combinée à une chimiothérapie à base de composés de platine. La résistance croissante aux chimiothérapies renforce la nécessité d’identifier des marqueurs moléculaires robustes pour adapter le traitement et développer des thérapies ciblées. Durant ma thèse, j’ai montré l’importance des voies de l’épigénétique dans le mode d’action de drogues anti-cancéreuses dans le CG. Notamment, j’ai identifié le rôle d’une histone déacétylase, HDAC4, et de plusieurs miRNAs, dont miR-140, dans la réponse au cisplatine. De plus, j’ai démontré que des composés à base de ruthénium ayant des propriétés redox agissent indépendant de l’ADN et de p53 mais affectent certaines régulations épigénétiques. Ceci m’a donc conduit à étudier l’intérêt thérapeutique et les mécanismes sous-jacents d’un traitement combiné associant le cisplatine et des inhibiteurs de HDAC. L’ensemble de ces résultats permet d’ouvrir de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes d’action des drogues anticancéreuses dans le CG et dans l’identification de marqueurs pronostiques ou de thérapie innovante plus adaptée. / Gastric cancer (GC) is treated by surgical resection combined with chemotherapy based on platinum compounds. The increase in chemotherapy resistance reinforces the need to identify robust molecular markers to tailor treatment and develop targeted therapies. During my PhD, I examined the importance of the epigenetic pathways in the mode of action of anticancer drugs in gastric cancer. In particular, I have identified the role of one histone deacetylase, HDAC4, and several miRNAs, including miR-140, in response to cisplatin. Moreover, I have shown that ruthenium compounds having redox properties act independently of DNA and p53 but affect some epigenetic regulations. This then led me to investigate the therapeutic value and the underlying mechanisms of a combined therapy associating cisplatin and HDAC inhibitors. All these results will open new perspectives in the understanding of the mechanisms of action of anticancer drugs in gastric cancer and in the identification of prognostic markers or more appropriate advanced therapy.

Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l’agrégation intracérébrale de protéines tau anormales. Cependant ces maladies sont très hétérogènes sur le plan clinique, anatomopathologique mais aussi biochimique avec l'agrégation de différentes isoformes de protéines tau. De nombreux axes de recherche existent à ce jour afin de mieux comprendre ces maladies incurables. Au cours de cette thèse d'université, nous avons étudié les modifications de l’épigénome qui constituent une piste nouvelle et très prometteuse dans la recherche sur les maladies neurodégénératives. L'épigénétique est un processus dynamique et réversible qui peut être modifié par de nombreux facteurs génétiques ou environnementaux et qui joue un rôle très important dans la régulation des gènes. De nombreuses études rapportent une association entre certaines marques épigénétiques et les maladies neurodégénératives. Par exemple, dans la maladie d’Alzheimer, il a été observé une hyperméthylation de l'ADN, au niveau du promoteur du gène MAPT qui code les protéines tau.Dans ce contexte, nos objectifs étaient de déterminer si des variations de l'épigénome impliquant le gène MAPT contribuent à l'expression différentielle des protéines tau qui est observée dans les différentes classes de tauopathies. Nous avons donc constitué et caractérisé une banque de prélèvements cérébraux de témoins et de patients atteints de différentes tauopathies. Puis nous avons analysé la méthylation de l'ADN dans 3 tauopathies : la maladie d'Alzheimer, la paralysie supranucléaire progressive et la DCB. Notre étude a permis de mettre en évidence chez les patients atteints de PSP une hypométhylation dans l’inton 0 du gène MAPT. Cette hypométhylation ne concernait que le cortex frontal, affecté par la pathologie tau, mais pas le cortex occipital qui est épargné par la pathologie tau. De plus, nous avons également mis en évidence dans le tissu cérébral des patients atteints de PSP une hyperexpression des ARNm de MAPT par rapport aux témoins. Nous démontrons avec ce travail que l’hypométhylation de l'ADN de l’intron 0 de MAPT constitue une signature épigénétique spécifique de la PSP. Cette première étude nous a conduits à suspecter l'existence d'un promoteur alternatif du gène MAPT situé dans cette région de l'intron 0. Nous avons donc testé in vitro l'activité de ce promoteur et cloné des transcrits issu de ce promoteur alternatif. Nous avons ensuite confirmé ces analyses par la mesure de l'expression des ARNm par qPCR. Au total, ces expériences prouvent l'existence et la fonctionnalité de ce promoteur alternatif dans le cerveau humain. De plus, l'activation de ce promoteur alternatif aboutit à la transcription d'ARNm plus courts codant pour de nouvelles protéines tau qui pourraient être impliquées dans la survenue des tauopathies. / Tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by intracerebral aggregation of abnormal tau proteins. However, these diseases are heterogeneous clinically, pathologically but also biochemically with the aggregation of different isoforms of tau protein. Many lines of research exist to date to better understand these incurable diseases. During this university thesis, we studied the changes in the epigenome that constitute a new and very promising approach in research on neurodegenerative diseases. Epigenetics is a dynamic and reversible process which can be modified by numerous genetic or environmental factors and plays a very important role in gene regulation. Many studies report an association between some epigenetic marks and neurodegenerative diseases. For example, in Alzheimer\'s disease, it has been observed hypermethylation of DNA in the promoter of the MAPT gene which encodes the tau protein.In this context, our objective was to determine if changes in epigenomic involving MAPT gene contribute to the differential expression of tau protein which is observed in the different classes of tauopathies. So we have established and characterized a human brainbank of controls and patients with different tauopathies. Then we analyzed the DNA methylation in 3 tauopathies: Alzheimer\'s disease, progressive supranuclear palsy, and CBD. Our study highlighted in PSP patients hypomethylation in intron 0 of MAPT gene. This hypomethylation concerned only the frontal cortex, affected by the tau-pathology but not the occipital cortex which is spared by tau-pathology. In addition, we also shown in the brain tissue of patients with PSP an overexpression of mRNA of MAPT compared to controls. We demonstrate in this work that hypomethylation of DNA in intron 0 of MAPT is a specific epigenetic signature of PSP. This first study has led us to suspect the existence of an alternative promoter of the MAPT gene located in this region of intron 0. We tested the in vitro activity of this promoter and cloned transcripts derived from this alternative promoter. We then confirmed this analysis by measuring mRNA expression by qPCR. In total, these experiments prove the existence and the functionality of this alternative promoter in the human brain. Furthermore, activation of the alternative promoter results in shorter mRNA transcripts encoding novel tau proteins that might be involved in the onset of the tauopathies.

Les profils de méthylation de l’ADN sont des marques épigénétiques essentielles contrôlant l'expression génétique spécifique des tissus. Ces profils sont fidèlement reproduits par l’enzyme DNMT1 qui est dirigée par la protéine UHRF1 vers les sites CpG hémiméthylés (HM). La spécificité élevée d’UHRF1 vis-à-vis de ces sites CpG HM est liée à la capacité de son domaine SRA de basculer sélectivement les résidus méthylcytosine (mC). Par conséquent, la compréhension de la capacité d’UHRF1 à lire les séquences d'ADN et de basculer leurs résidus mC est une question importante en épigénétique moléculaire. Dans le présent travail, nous avons utilisé des analogues de nucléobases sensibles à l'environnement pour étudier le basculement de base induit par SRA. Nous avons découvert qu’un étiquetage par la 2-thiényl-3-hydroxychromone (3HCnt) à proximité de la cible CpG méthylée, permet le suivi de ce basculement SRA-induit de mC et de sa dynamique. Les spectroscopies de fluorescence à l'état stationnaire et de "stopped flow" ont montré des différences significatives entre les ADNs HM et non méthylé (NM) vis-à-vis de la reconnaissance et la cinétique de liaison du SRA. Effet, nous avons montré que SRA est capable de se lier et de glisser avec une cinétique rapide sur le duplex NM, en accord avec le rôle de lecteur d’UHRF1. Par contre, la cinétique de basculement de mC s’avère beaucoup plus lente, ce qui augmente sensiblement la durée de vie d’UHRF1 lié à un site CpG hémi-méthylé et donc la probabilité de recruter DNMT1 afin de dupliquer fidèlement le profil de méthylation de l’ADN. Nous avons ainsi obtenu pour la première fois un test capable de suivre le basculement de la base induit par UHRF1, ce qui nous a permis de proposer un mécanisme pour le recrutement de DNMT1 par UHRF1 sur les sites HM. / DNA methylation patterns are key epigenetic marks which control tissue specific gene expression. These patterns are faithfully replicated by the DNMT1 enzyme which is directed by the UHRF1 protein to hemi-methylated (HM) CpG sites. The high specificity of UHRF1 to HM CpG sites is related to the ability of its SRA domain to selectively flip methylcytosine (mC) residues. Therefore, the understanding of how UHRF1 reads DNA sequences and flips mC residues is an important question in molecular epigenetics. In the present work, we apply environment-sensitive nucleobase analogues to study the SRA-induced base flipping. We found that only labelling by 2-thienyl-3-hydroxychromone (3HCnt) outside but close to the target methylated CpG allows monitoring the SRA-induced mC-flipping and its dynamics. Fluorescence steady-state spectroscopy and stopped flow measurements showed significant differences in the recognition and binding kinetics of SRA for HM and non-methylated (NM) DNA. Indeed, SRA was found to bind and slide with fast kinetics on NM duplexes, in line with the reader role of UHRF1. In contrast, the kinetics of mC flipping was found to be much slower, substantially increasing the lifetime of UHRF1 bound to a CpG site in HM duplexes and thus, the probability of recruiting DNMT1 in order to faithfully duplicate the DNA methylation profile. Therefore, we proposed for the first time an assay able to sensitively monitor the UHRF1-induced base flipping, which helped us to provide a possible mechanism for the UHRF1 directing function on DNMT1.

La méthylation de l'ADN est l’une des marques épigénétiques les plus étudiées et est largement conservée. Mes travaux de thèse présentent le premier méthylome d'une diatomée marine P. tricornutum qui appartient à la famille des Stramenopiles. P. tricornutum présente une méthylation d’environ 6% qui est présente en mosaïque sur l’ensemble du génome. Une méthylation importante a été retrouvé chez les éléments transposables, en particulier les éléments amplifiés récemment de type Copia. L’analyse met en évidence plus de 320 gènes méthylés dans trois contextes génomiques différents : à proximité des éléments transposables, en grappes de gènes méthylés, et dans des gènes uniques. En outre, les gènes largement et complètement méthylés ont été trouvé fortement corrélés avec le silencing transcriptionnel et l'expression différentielle dans des conditions spécifiques. Enfin, il a été constaté que les gènes susceptibles d’avoir été acquis par transfert horizontal de gènes bactériens étaient préférentiellement insérés dans des régions riches en éléments transposables, ce qui suggère un mécanisme par lequel l'expression de gènes étrangers peut être tamponnée à la suite de leur insertion dans le génome. En résumé, P. tricornutum a une faible méthylation de l'ADN et une methylation relativement importante des éléments transposables et seulement quelques gènes méthylés. Ce premier méthylome d’une diatomée Stramenopile ajoute de manière significative à notre compréhension de l'évolution de la méthylation de l'ADN chez les eucaryotes. En ce qui concerne les modifications des histones, la distribution des marques H3K4me2, H3K9me2 et H3K27me3 a été examinée chez P. tricornutum. H3K4me2 est principalement associée à des gènes alors que les deux marques H3K9me2 et H3K27me3 ciblent principalement des éléments transposables. La répartition de H3K27me3 est inhabituelle et différente de ce qui a été observé chez les espèces modèles étudiées à ce jour. Les gènes marqués par H3K27me3 ont tendance à être faiblement exprimés et de façon différentielle. H3K27me3 et H3K9me2 ont tendance à co-marquer non seulement les éléments transposables méthylés, mais aussi des gènes fortement méthylés, ce qui semble être important pour le maintien du silencing des gènes différentiellement exprimés. L'analyse combinatoire de différentes marques d’histones et la méthylation de l'ADN nous a donné un aperçu du paysage de la chromatine chez les diatomées, et aidera à définir les caractéristiques structurales et fonctionnelles conservées. / DNA methylation is the most extensively studied and widely conserved epigenetic mark. Here the first whole genome methylome from a stramenopile, the marine model diatom P. tricornutum is reported. In P. tricornutum, around 6% of the genome was methylated in a mosaic landscape. Extensive methylation in transposable elements (TEs), especially in recently amplified Copia-like elements was found. Over 320 genes were found methylated occurring in three different genomic contexts: in the proximity of TEs, in clusters of methylated genes, and in single genes. Furthermore, genes extensively and completely methylated correlated strongly with transcriptional silencing and differential expression under specific conditions. Finally, it was found that genes likely acquired by horizontal gene transfer from bacteria were preferentially inserted within TE-rich regions, suggesting a mechanism whereby the expression of foreign genes can be buffered following their insertion in the genome. In general, P. tricornutum has low DNA methylation with relatively extensive DNA methylation on TEs and a few methylated genes. This first Stramenopile methylome adds significantly to our understanding of the evolution of DNA methylation in eukaryotes. As for the histone modifications, genome wide distribution of H3K4me2, H3K9me2 and H3K27me3 were examined in P. tricornutum. H3K4me2 is mainly associated with genes while both H3K9me2 and H3K27me3 marks target mainly transposable elements (TEs). The distribution of H3K27me3 is unusual and different from what have been profiled in model species so far. The genes marked by H3K27me3 tend to be lowly and differentially expressed. H3K27me3 and H3K9me2 tend to co-mark not only methylated TEs but also heavily methylated genes, which appears to be important for maintaining the silencing of differentially expressed genes. The combinatorial analysis of different histone marks and DNA methylation gave us an overview of diatom chromatin landscapes, and will help to define conserved structural and functional features.

La consommation chronique et excessive d’éthanol provoque des modifications neurobiologiques adaptatives. Les mécanismes qui les contrôlent sont multiples et certains ont été reliés à des régulations épigénétiques conduisant à des modifications structurelles et fonctionnelles. L’éthanol induit également une neurodégénérescence de l’hippocampe responsable de déficits cognitifs. Parmi l’ensemble des modèles animaux qui sont utilisés pour étudier les effets d’une consommation chronique d’alcool, figurent les souris de la lignée C57BL/6J. Ces souris possèdent une appétence naturelle pour l’éthanol faisant d’elles un modèle de choix pour étudier les conséquences de la consommation chronique d’éthanol. Le but de ce travail de thèse a été d’étudier les relations entre les mécanismes épigénétiques et la modulation de la neuroplasticité de l’hippocampe à la suite d’une consommation chronique d’éthanol chez les souris C57BL/6J, et d’en évaluer les conséquences comportementales. Nous avons montré que la consommation chronique d’éthanol induit, au niveau de l’hippocampe, des modulations épigénétiques globales corrélées à un remodelage chromatinien au sein du gène du BDNF, impliquant à la fois les modifications post-traductionnelles des histones et la méthylation de l’ADN. Ces modifications épigénétiques sont certainement responsables de l’augmentation d’expression protéique du BDNF observée dans l’hippocampe, et plus particulièrement dans le gyrus denté, après 3 semaines de consommation chronique d’éthanol en libre choix. L’accroissement de l’expression du BDNF induit une stimulation des voies de la signalisation intracellulaire dépendantes de l’activation du récepteur TrkB du BDNF, et une augmentation de la neurogenèse du gyrus denté. Les effets de l’antagoniste spécifique du récepteur TrkB, ANA 12, démontrent que l’augmentation de la neurogenèse observée chez les souris C57BL/6J après la prise chronique d’éthanol, est sous le contrôle unique du complexe BDNF/TrkB. L’analyse comportementale des souris C57BL/6J ayant consommé de l’éthanol, montre une détérioration des capacités d’apprentissage et de mémoire sans modification de la plasticité synaptique dans l’hippocampe, suggérant ainsi que d’autres mécanismes sont impliqués dans ces déficits cognitifs. L’ensemble de ces données apporte de nouveaux éléments de compréhension concernant la stimulation de la neurogenèse hippocampique chez les souris C57BL/6J lors d’une consommation chronique en libre choix d’éthanol. Il est probable que cette apparente augmentation de plasticité soit un mécanisme adaptatif et compensatoire à la détérioration des fonctions cognitives induite par une consommation chronique d’alcool. / Chronic and excessive ethanol consumption triggers neurobiological adaptations within the central nervous system, which are responsible for the development of an addiction. Ethanol induces adaptive mechanisms linked to epigenetic regulations leading to functional and structural changes, and also provokes a neurodegeneration responsible for the cognitive deficits observed in alcohol abusers. Among the different animal models available for studying the effects of chronic ethanol consumption, C57BL/6J mice are among the most relevant. These mice display high ethanol preference, making them a good model for studying the consequences of chronic and free-choice ethanol consumption. The purpose of this work was to study the links between epigenetic mechanisms and hippocampal neuroplasticity and to evaluate the behavioural consequences induced by chronic ethanol consumption in C57BL/6J mice. We showed that, in the hippocampus, chronic ethanol consumption induced global epigenetic modulations that were correlated with chromatin remodelling at the BDNF gene level. These effects involved post-translational histone modifications and DNA methylation. Epigenetic changes at the BDNF gene level probably allowed the increase in BDNF protein expression observed within the hippocampal dentate gyrus in mice having consumed ethanol for 3 weeks. Upregulation of BDNF expression was linked to both the stimulation of intracellular cascades downstream BDNF/TrkB receptor activation, and the increase in neurogenesis within the dentate gyrus. Using a specific TrkB receptor antagonist, ANA-12, we demonstrated that the hippocampal neurogenesis induced by chronic ethanol intake was under the control of BDNF. Behavioural analysis evidenced learning and memory impairments after ethanol consumption without synaptic plasticity alteration within the hippocampus, suggesting the involvement of other mechanisms in the cognitive deficits. Altogether, these data bring new elements for understanding the hippocampal neurogenesis stimulation observed under chronic and voluntary ethanol consumption in C57BL/6J mice. Moreover, this apparent increase in plasticity might probably be considered as an adaptive and compensatory mechanism in response to the cognitive deficits induced by ethanol consumption.

En influençant le degré de compaction de la chromatine ainsi que ses interactions avec différents partenaires protéiques, les modifications post-traductionnelles des histones sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Avec les différents variants d’histones incorporés dans la chromatine, ces modifications dynamiques et sensibles à l’environnement sont constitutives du code histone. Ce travail présente une approche globale de criblage baptisée approche histonomique, visant à révéler une perturbation épigénétique à l’échelle des histones. Cette approche originale offre une comparaison rapide et fiable des abondances relatives des variants d’histones et de leurs modifications post-traductionnelles dans des cellules humaines en une seule analyse LC-MS. Comme preuve de concept, des cellules BeWo issues de choriocarcinome humain ont été exposées au butyrate de sodium, un inhibiteur non spécifique d’histones désacétylases. Les histones extraites des échantillons témoins ou traités au butyrate de sodium à 1 ou 2,5 mM ont été analysées par chromatographie liquide ultra performante couplée à un spectromètre de masse de type Q-TOF. Les analyses statistiques multivariées ont permis de discriminer les échantillons témoins des échantillons traités sur la base des différences de degrés d’acétylation observés sur plusieurs formes d’histones. La même approche a ensuite été appliquée à des cellules exposées au B[a]P à 1 μM et a révélé deux principaux marqueurs caractéristiques d’un remodelage de la chromatine induit par les effets génotoxiques duB[a]P. En résumé, cette approche histonomique globale pourrait se révéler être un outil complémentaire très utile pour explorer une potentielle perturbation du code histone lors d’exposition à des xénobiotiques environnementaux. / While acting upon chromatin compaction, histone post-translational modifications (PTMs) are involved in modulating gene expression through histone–DNA affinity and protein–protein interactions. These dynamic and environment-sensitive modifications are constitutive of the histone code that reflects the transient transcriptional state of the chromatin. Here we describe a global screening approach for revealing epigenetic disruption at the histone level. This original approach enables fast and reliable relative abundance comparison of histone PTMs and variants in human cells within a single LC-MS experiment. As a proof of concept, we exposed BeWo human choriocarcinoma cells to sodium butyrate (SB), a universal histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Histone acide xtracts equally representing 3 distinct classes, Control, 1 mM and 2.5 mM SB, we reanalyzed using ultra-performance liquid chromatography coupled with a hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer (UPLC-QTOF-MS). Multivariate statistics allowed us to discriminate control from treated samples based on differences in the acetylation level of several histone forms. We then applied the same procedure to cells treated with 1 μMB[a]P and suceeded in revealing two markers of chromatin remodeling in relation withgenotoxic properties of B[a]P. Indeed, this untargeted histonomic approach could be auseful exploratory tool in many cases of environmental xenobiotic exposure when histone code disruption is suspected.