Chez les Mammifères femelles, l’extinction transcriptionnelle d’un des deux chromosomes X pendant l’embryogénèse précoce compense le déséquilibre de dose des gènes liés à l’X entre les sexes. L’inactivation aléatoire du chromosome X est mise en place dans la masse cellulaire interne du blastocyste et maintenue jusqu’à l’âge adulte dans le soma. Chez certains Euthériens incluant la souris, les tissus extra-embryonnaires (trophectoderme et endoderme primitif) montrent une inactivation soumise à empreinte du X paternel. Le statut inactif du Xp peut être étudié ex vivo dans les cellules souches trophoblastiques (TS) dérivées du trophectoderme. Nous avons pu sélectionner des cellules TS montrant une réactivation partielle du Xp ou bien une inversion complète du profil d’inactivation. Ceci révèle une plasticité épigénétique accrue de l’inactivation dans le trophectoderme par au soma.L’inactivation aléatoire du chromosome X est récapitulée pendant la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES), qui servent de modèle cellulaire. Ce processus est déclenché par l’accumulation en cis du long ARN non codant Xist qui crée un domaine nucléaire répresseur autour du futur chromosome X inactif. Avant la différenciation, l’accumulation de Xist est réprimée par un autre long ARN non codant, Tsix, qui est transcrit en antisens de Xist. Afin d’adresser la dynamique fonctionnelle des ARN Xist et Tsix, nous avons inséré différents motifs d’étiquetage au locus Xist/Tsix endogène. Incorporés dans l’ARN sens ou antisens, ces étiquettes sont reconnues spécifiquement par des molécules fluorescentes, permettant ainsi la visualisation de ces transcrits dans les cellules vivantes. / In female Mammals, the transcriptional silencing of one of the two X chromosomes during early embryogenesis compensates the dosage disequilibrium of X-linked genes between sexes. Random X chromosome inactivation occurs in the inner cell mass of the blastocyst and is maintained through adult life in the soma. In some Eutherian species including mice, extraembryonic tissues (trophectoderm and primitive endoderm) exhibit imprinted inactivation of the paternal X. The inactive state of the Xp can be extensively studied ex vivo in Trophoblast Stem (TS) cells derived from the trophectoderm. We were able to select from the general cell population, TS cells exhibiting partial reactivation of the Xp or showing a complete switch of imprinted X-inactivation pattern. This reveals an accrued epigenetic plasticity of imprinted X-inactivation in the trophectoderm as compared to random X-inactivation in the soma.Random X-chromosome inactivation is recapitulated during the differentiation of female Embryonic Stem (ES) cells – which serves as cellular model. This process is triggered by the cis-accumulation of Xist long non coding RNA molecules which create a nuclear repressive domain around the future inactive X chromosome. Before differentiation, the accumulation of Xist is repressed by another lncRNA, Tsix, that is transcribed antisense to Xist. In order to address the functional dynamics of Xist and Tsix RNAs, we inserted different types of tag sequences in the endogenous Xist/Tsix locus. Incorporated in the sense or antisense RNA, these tags are specifically recognized by fluorescent molecules, thereby allowing live cell imaging of these transcripts.

La régulation transcriptionelle fine assurée par les Eléments Cis Régulateurs (ECR, eg. promoteurs et «enhancers») et les facteurs protéiques associés, est à la base de la mise en place et le maintien de l'identité tissulaire. Les modifications de la chromatine corrèlent avec l’activité d’ECRs et constituent l’épigénome de la cellule. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux transitions des modifications des histones (H3K4me1/me2/me3, H3K36me3, H3K27me3 and H3K9me2) accompagnant le développement précoce de la cellule T. Pour cela, j’ai utilisé un modèle murin reproduisant une étape cruciale de la thymopoïèse - la sélection β - et la technique d’Immunoprecipitation de la chromatine couplée à des puces à ADN (ChIP-chip). Au sein des enhancer connus, nos analyses ont mis en évidence une nouvelle signature épigénétique liée à leur activité. De plus, nous montrons que l'étendue d'enrichissement d’H3K4me2 au sein des régions géniques des gènes exprimés, constitue une signature épigénétique des gènes tissus spécifiques. Tout ceci a permis de mieux comprendre le rôle de l’épigénétique dans l'établissement et le maintien de l'identité cellulaire.Le traitement anti-cancer moderne est basé sur les analyses de différents marqueurs d'agressivité (MA) et par la suite, de l’établissement de la thérapie personnalisée. Durant la dernière partie de ma thèse, j’ai participé à un projet collaboratif avec le laboratoire de Thérapie Cellulaire de l’Institut Paoli Calmettes à Marseille, qui visait l’isolation des MA des Leucémies Aiguës Myéloïdes à caryotype normal (LMAcn) grâce aux études de profilage épigénétique (H3K27me3) des blastes des patients atteints de LMAcn. / Precise transcriptional regulation underlies the establishment and maintenance of cell type specific identity and is governed by dedicated DNA sequences (i.e., cis regulatory elements (CREs): eg.: promoters, enhancers) and transcription factors. Chromatin modifications (eg.: histone modifications, DNA methylation) impinge on CREs activity and constitute the epigenome of the cell.During my PhD, I was interested in the transitions of a set of histone modifications (H3K4me1/me2/me3, H3K36me3, H3K27me3 and H3K9me2), during one of the major checkpoints of thymopoiesis - the β-selection. I used a dedicated mouse model and Chromatin Immunoprecipitation coupled with microarrays (ChIP-chip) technique. Our data evidenced a previously unappreciated epigenetic signature linked to enhancer activity. In parallel, computational analyses of the patterns of gene body enrichment of H3K4me2 highlighted an epigenetic signature linked to the regulation of the tissue specific gene expression. Altogether, this enabled to deepen the relationship between chromatin states and regulation of cell type specific identity.Modern anticancer treatment is based on the analyses of a number of cancer aggressiveness markers (CAM) and results in a highly personalized therapy. Epigenetic profiling can constitute a powerful tool for CAM’s isolation. In the second part of the presented work, I participate in a collaborative project (with Cellular Therapy Centre at the Paoli Calmettes Institut, Marseille) aiming to isolate new CAM for Acute Myeloid Leukemia with normal karyotype (AMLnc) patients. For this purpose I performed epigenetic (H3K27me3) profiling of blasts of AMLnc.

Les infections virales sont responsables de 15 à 20 % des cancers humains. L étude des mécanismes moléculaires avec lesquels les virus oncogènes induisent la transformation cellulaire est essentielle pour la compréhension des cancers qui en résultent. Cela permettra également la découverte de nouveaux mécanismes pouvant être impliqués dans le développement de cancers, qui peuvent être ciblés par des approches thérapeutiques. Les virus du papillome humain (HPV) sont des petit virus à ADN qui futs isolés de la peau de patients souffrants de Epidermodysplasia Verruciformis (EV) qui cause un risque élevé d'infection par les HPV et le développement de cancer de la peau non mélanique (NMSC). Certains HPV cutanés, tels que HPV5, 8 et 38, sont suspectés de jouer un rôle dans de développement du cancer de la peau. Cependant, le lien direct entre les HPV cutanés et l'étiologie du cancer n'est pas encore clairement établi. Des études de notre laboratoire ont montré que les oncoprotéines HPV38 E6 et E7 sont capables d'immortaliser des kératinocytes primaires humains in vitro et in vivo. Pour immortaliser des cellules, d'importantes voies de signalisations, telles que les voies de p53 et celle de NF-KB, doivent être affectées. Dans cette étude, nous avons cherché à mettre en évidence les mécanismes moléculaires menant à la dérégulation de p53 et de NF-KB par E6 et E7 de HPV38, dans des kératinocytes humains. Nous avons montré que HPV38 E6 et E7 induisent la formation d'un complexe protéique incluant IKKβ, ΔNp73α, EZH2 et DNMT1. La formation de ce groupement protéique corrèle avec l'inhibition de la transcription de certains gènes cibles de p53, tel que PIG3. Nous avons également mis en évidence l'activation de la voie NF-KB par les oncoprotéins E6 et E7 de HPV38. Cette activation est importante par le rôle joué par NF-KB dans la protection des cellules de l apoptose induite par TNF-α et par l'exposition aux rayonnements UVB. De plus nous avons observé que E7 est la principale oncoprotéine de HPV38 responsable de la dérégulation des voies p53 et NF-KB. Nos études mettent en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires qui peuvent être essentiels dans le processus de transformation cellulaire par HPV38 / Viral infections contribute to 15–20% of all human cancers. Studying the mechanisms employed by the oncogenic viruses to induce cellular transformation is essential for a better understanding of the resulting cancers and the discovery of new mechanisms involved in cancer development which can be targeted in therapeutic approaches. Human papillomaviruses (HPVs) are small dsDNA viruses which have been clearly associated with certain cancers. They were first isolated from the skin of patients suffering from Epidermodysplasia Verruciformis (EV) having an increased susceptibility to infection by specific HPV types and to the development of non-melanoma skin cancer (NMSC). Certain cutaneous HPV types, such as 5, 8, and 38, are suspected to play a role in skin cancer development. However the direct role of cutaneous HPV in the etiology of cancer is still under debate. Previous studies from our laboratory have reported that HPV38 E6 and E7 proteins are able to immortalize human primary keratinocytes in vitro and in vivo. Cellular immortalization can be achieved through the deregulation of important signaling pathways including p53 and NF-KB. In the present work, we have investigated the molecular mechanisms of p53 and NF-KB pathways deregulation by E6 and E7 oncoproteins from HPV38 in human keratinocytes. We show here that HPV38 E6E7 induce the formation of a transcription repressor complex including IKKβ, ΔNp73α, and polycomb group members EZH2 and DNMT1. The formation of this protein complex correlates with the inhibition of several p53-target genes, such as PIG3. We also report in these studies that HPV38 E6E7 activate NF KB pathway, which plays an important role in the survival of HPV38 E6E7-immortalized human keratinocytes upon TNF-α– and UVB-mediated apoptosis. In addition our data highlight E7 being the main HPV38 protein mediating p53 and NF-KB deregulation. Our studies shed light on novel molecular mechanisms that could be important for HPV38-mediated cellular transformation

Dans le cas d'une infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV), les traitements actuels (IFN et analogues de nucléos(t)ides) ne permettent pas d'éradiquer l'infection du fait de la persistance de l'ADNccc et des phénomènes de résistance observés chez les patients. S'agissant des traitements par l'IFN, 70 % des patients porteurs chroniques sont non-répondeurs. En effet, le virus HBV aurait développé des stratégies immunosuppressives pour établir une infection persistante. La compréhension des mécanismes impliqués dans cette viro-immunosuppression devient ainsi un enjeu majeur dans la mise en place de nouvelles stratégies antivirales. Les objectifs de ma thèse ont consisté en l'étude des relations précoces entre HBV et les hépatocytes. Nous avons pu mettre en évidence que cette absence d'activation du système immunitaire était le résultat, non pas d'une « invisibilité » du virus, mais d'une inhibition active des réponses IFN de type I/III et proinflammatoires, précocement établie par le virus HBV pour établir une infection persistante. De façon intéressante, nous avons pu démontrer que la protéine HBc était capable d'inhiber spécifiquement l'activation des voies IFN via son interaction avec les promoteurs des gènes de l'immunité innée et l'installation de marques épigénétiques (H3K9me2/3) répressives sur ces gènes par recrutement d'histone méthyl-transférases. Ces résultats prônent l'utilisation de stratégies antivirales utilisant des anticapsides dégradant et/ou prévenant la localisation nucléaire de la protéine HBc, restaurant ainsi le potentiel immunitaire des hépatocytes, pouvant dès lors être exacerbé par des agonistes de PRRs / Current treatments against Hepatitis B virus (HBV) chronic infection (IFNs and nucleos(t)ide analogues) are inefficient due to the persistence of cccDNA and emergence of viral resistance observed in infected patients. So far, up to 70 % of these patients are non responders to IFN treatments and it seems that the virus itself is able to counteract actively the host innate immune responses to establish a persistent infection. Therefore, the understanding of molecular mechanisms involved in this immunosuppression is crucial to design new immunotherapeutic strategies. In this context, the aim of my thesis was to investigate the early interactions between HBV and the hepatocyte antiviral responses. We have determined that HBV is not only a weak inducer of the host immune response, but is also able to inhibit very early and actively type I/III IFNs and proinflammatory pathways to persist in the hepatocytes. Furthermore, we have identified HBc protein as the major determinant involved specifically in the inhibition of IFN responses by counteracting host innate immune gene activations leading to repressive epigenetic marks such as H3K9/K27me3, or the recruitment of histone methyl transferase enzymes to the host IFN gene promoters. These results highlight new immunotherapeutic strategies and proposed the use of anticapsids components to degrade or block the nuclear localization of HBc proteins in order to restore a potent immune response in the hepatocytes. These anticapsid treatments may be also combined to PRRs agonists in order to improve the host antiviral state and HBV replication control

Abstract : 5-Methylcytosine is an epigenetic mark, which can be oxidized to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in DNA by ten-eleven translocation (TET) oxygenases. It is an initial step in the demethylation of 5mC. Levels of 5hmC is relatively high in the brain compared to other organs, but these levels are known to be significantly reduced during the development of a brain tumor, especially in glioblastoma multiforme (GBM). However, no known mechanisms may fully explain this abnormality. The objectives of my project were to (1) understand the implications of the demethylation pathway mediated by TET, and (2) gain a deeper insight in the epigenetic make-up of brain tumors. (1) U87 cells were incubated with 5mC, 5hmC, 5-formylcytosine (5fC) or co-incubated of 5hmC with 3,4,5,6-tetrahydro-2’-deoxyuridine (dTHU) over a timeline of 0, 24, 48 and 96 hours. (2) 130 brain tumors (GBM= 79; grade II/III= 51) were obtained directly from surgery and immediately suspended in DNA extraction buffer. Both cell samples and tumor tissues underwent DNA extraction and DNA digestion protocols. The percent per cytosine (%/C) was obtained by quantification of 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxymethyluracil (5hmU) and 5formyluracil (5fU) using LC-MS/MS. (1) Cellular incubations showed that it is possible to increase levels of 5hmC in DNA, but also a slight increase in 5mC levels throughout the experiment. 5HmC levels dramatically increased by 1.9-fold after 96h. On the other hand, no increase was observed in 5fC levels. Both 5hmC and 5fC incubations were accompanied by high increases in 5hmU and 5fU levels respectively. The addition of dTHU to the 5hmC incubation decreased 5hmU incorporation by 65%. (2) The average levels of 5mC, 5hmC and 5fC, in brain tumors, were 4.0, 0.15 and 0.021 %/C respectively. 5HmU and 5fU levels were present at comparable levels of 5hmC and 5fC. Levels of 5hmC, 5hmU and 5fU were significantly lower in the DNA of GBM specimens. There was a strong correlation between 5mC with 5hmC and 5fC in GBM, but this was absent in low grade tumors. The presence of 5hmU and 5fU in brain tumor and the increase in their levels during cell incubations indicate a deamination activity in these cancerous cells, which may impinge on the cellular levels of 5hmC, in particular. Furthermore, upon the incubations with 5hmC, downstream levels of 5fC did not increase suggesting a TET malfunction. TET activity is maintained in GBMs, but impaired in low grade tumors due to isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1) mutations. Therefore, in brain tumors, a strong deamination activity and TET impairment may lead to epigenetic reduction of 5hmC. / Résumé : 5Mtéthylcytosine (5mC) est une marque épigénétique qui peut être oxydée en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par ten-eleven translocation (TET) oxygénases. Ceci amène à l’étape initiale de la déméthylation de 5mC. Le niveau de 5hmC est plus élevé dans le cerveau par rapport aux autres organes. Par contre, ce niveau a une réduction marquante au cours du développement d’une tumeur cérébrale, notamment le glioblastome multiforme (GBM). Toutefois, il n’y a aucun mécanisme connu pour expliquer cette anomalie. Les objectifs de ce projet étaient de (1) discerner l’implication de la voie de déméthylation obtenu par médiation de TET et (2) d’avoir une compréhension plus profonde de la constitution épigénétique des tumeurs cérébraux. (1) Des cellules U87 ont été incubées avec 5mC, 5hmC, 5-fomylcytosine (5fC) et une co-incubation de 5hmC avec 3,4,5,6-tétrahydro-2’-déoxyuridine (dTHU). Les échantillons ont été récoltés à 0, 24, 48, 96 heures. (2) 130 tumeurs cérébraux (GBM = 79; grade II/III = 51) étaient obtenus directement de chirurgie et mise en suspension dans un tampon d’extraction d’ADN le jour même. Les échantillons d’U87 et de tissu tumoral ont subi les protocoles d’extraction et de digestion d’ADN. Le pourcentage par cytosine (%/C) était calculé par la quantification de 5mC, 5hmC, 5fC, 5-hydroxyméthyluracile (5hmU) et 5-formyluracile (5fU) en utilisant LC-MS/MS. (1) Les incubations d’U87 ont démontrées la possibilité augmenter les niveaux génomique de 5hmC, mais aussi une légère augmentation des niveaux de 5mC. Les niveaux de 5hmC ont accru de 1.9 fois après 96hrs. Par contre, aucune variation n’a été observée dans les niveaux de 5fC. Les incubations de 5hmC et 5fC ont été accompagnées par une élévation des niveaux de 5hmU et 5fU respectivement. L’addition de dTHU avec 5hmC avait diminué l’incorporation de 5hmU par 65%. (2) Dans les tumeurs cérébraux, les niveaux moyens de 5mC, 5hmC et 5fC étaient de 4.0, 0.15 et 0.021%/C respectivement. Les quantités de 5hmU et 5fU étaient grandement plus faible dans le GBMs que dans les tumeurs de bas grades. La présence de 5hmU et 5fU dans les tumeurs et leur augmentation durant l’incubation des U87 indiquent une activité de désamination, qui peut, en particulier, entraver les niveaux de 5hmC. En outre, malgré l’incubation avec 5mC, les niveaux de 5hmC et 5fC n’ont pas augmentés suggérant un dysfonctionnement de TET. L’activité de TET est maintenue dans GBM, mais altérée dans les tumeurs de bas grades à cause de mutation isocitrate dehydrogenase-1 (IDH1). Par conséquent, la forte activité de désamination et la déficience en TET peuvent conduire à une réduction épigénétique.

Chez les mammifères, les lymphocytes T CD4 sont essentiels à la défense de l’organisme contre des infections par des pathogènes ou le développement de tumeurs. Après activation, les lymphocytes T CD4 naïfs ont la capacité de se différencier en divers lymphocytes T helper (Th1, Th2, Th17…) en fonction des signaux reçus. Le choix du lignage permet d’adapter le phénotype et la fonction des cellules au type de danger détecté. Le processus de différenciation des lymphocytes T helper implique l’établissement de programmes d’expression des gènes distincts. La dynamique et la stabilité de ces programmes sont notamment régulées par l’activité d’éléments cis-régulateurs. Le but de ma thèse était de comprendre les mécanismes épigénétiques qui contrôlent la programmation des lymphocytes T CD4. Dans cet objectif, nous avons étudié le rôle de la H3K9 méthyl-transférase SETDB1 dans la différenciation des lymphocytes T CD4 en Th1 et Th2, deux lignages T helper fortement antagonistes. Nous avons découvert que SETDB1 réprime de manière critique le programme d’expression des gènes Th1. En effet, en l’absence d’expression de Setdb1, la différenciation Th1 est exacerbée. De plus, lorsqu’elles sont exposées à un signal pro-Th1, les cellules Th2 franchissent les barrières de lignage et se transdifférencient en Th1. De manière surprenante, SETDB1 ne cible pas directement les enhancers Th1. Au contraire, l’enzyme dépose de manière type cellulaire spécifique la marque répressive H3K9me3 au niveau d’un set restreint de rétrovirus endogènes (ERVs). Des analyses bio-informatiques ont indiqué que les rétrotransposons ciblés sont fortement associés à des gènes impliqués dans les processus immunitaires. La suite de ces analyses a indiqué que ces ERVs flanquent et répriment l’activité d’éléments cis-régulateurs des gènes Th1, ou agissent eux même comme des enhancers du lignage. En conclusion, la déposition de H3K9me3 par SETDB1 garantit l’intégrité des lymphocytes T helper en réprimant un panel d’ERVs qui ont été exaptés en modules cis-régulateurs pour façonner et contrôler le réseau de gènes Th1. / CD4 T lymphocytes play a central role in the defense of mammal organisms against infections by pathogens and the development of tumors. Upon activation, naïve CD4 T cells differentiate into distinct helper cell subsets depending on environmental cues. T helper cells are key players of the immune system as they finely orchestrate immune responses in a danger-adapted manner. The process of T helper differentiation relies on the establishment of complex and lineage-specific gene expression programs. The dynamics and stability of these programs are regulated at the chromatin level through epigenetic control of cis-regulatory elements. My thesis objective was to investigate the epigenetic pathways involved in the regulation of enhancer activity in CD4 T cells. In this purpose, we studied the role of the H3K9 specific methyltransferase SETDB1 in the differentiation of Th1 and Th2 cells, which are strongly antagonistic. We report that SETDB1 critically represses the Th1 gene expression program. Indeed, Setdb1-deficient naïve T cells show exacerbated Th1 priming. Moreover, when exposed to a Th1-instructive signal, SETDB1-deficient Th2 cells cross lineage boundaries and transdifferentiate into Th1 cells. Surprisingly, SETDB1 does not directly target Th1 enhancers to heterochromatin. Instead, SETDB1 deposits the repressive H3K9me3 mark at a restricted and cell type specific set of endogenous retroviruses, strongly associated with genes involved in immune processes. Further bioinformatic analyses indicated that these retrotransposons flank and repress Th1 gene cis-regulatory elements or behave themselves as Th1 gene enhancers. Thus, H3K9me3 deposition by SETDB1 ensures T cell lineage integrity by repressing a repertoire of ERVs that have been exapted into cis-regulatory modules to shape and control the Th1 gene network.

La lutte contre les maladies chroniques nécessite la mise en œuvre de nouvelles stratégies de prédiction du risque et de prévention. La médecine personnalisée représente une approche sophistiquée pour réussir la prise en charge des morbidités de populations vieillissantes. Dans le cadre de ces travaux de thèse inspirés par les principes de la médecine personnalisée, nous décrivons une approche qui associe plusieurs méthodologies «-omiques». Nous avons utilisé un modèle de «dénominateur commun» pour les maladies chroniques afin d'identifier des biomarqueurs associés aux facteurs de risque et aux voies biologiques de maladies courantes. Par l’étude de variants génétiques localisés dans la région comportant le gène TREM2, nous avons identifié une association entre le rs6918289 et à la fois de taux élevés de TNF-α et une augmentation de l’épaisseur intima-média de l’artère fémorale. Grâce à des études d’association panépigénomique (EWAS), nous avons identifié de nouveaux marqueurs épigénétiques liés à des facteurs de risque de maladies courantes. Un site CpG de méthylation était associé à une augmentation du tour de taille, contribuant à expliquer la régulation épigénétique de l’obésité abdominale. De plus, une étude EWAS des taux de triglycérides a permis d’identifier deux sites CpG significatifs. L’un de ces deux sites a pu être confirmé dans le tissu adipeux. Une étude EWAS a également été réalisée pour décrire la régulation épigénétique des concentrations de VEGF-A. 20 sites CpG ont pu être identifiés ainsi et leurs relations avec la régulation du VEGF-A ont été examinées par analyse bioinformatique poussée. Les liens entre le VEGF-A et 11 cytokines ont également été étudiés. Le taux de protéine VEGF-A était associé à IL-4, MCP1 et EGF. Les associations entre les cytokines et des isoformes spécifiques de l’ARNm du VEGF-A ont également été évaluées : le VEGF165 était associé à MCP1 et IL-1α, et le VEGF189 à IL-4 et IL-6. Nous avons étudié le rôle du VEGF-A et LT dans l’athérosclérose. Cela a permis d’identifier un variant génétique lié au VEGF-A associé à l’attrition des télomères qui pourrait constituer un dénominateur commun pour les maladies chroniques. L’utilisation de diverses méthodologies pour étudier les facteurs de risque et les voies impliquées dans des maladies chroniques courantes a permis d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques qui pourraient améliorer la prédiction du risque de maladie basée sur le profil génétique de chaque individu. / The fight against common chronic diseases requires the implementation of new risk prediction and prevention strategies. Personalised medicine offers sophisticated approaches for management of the morbidities of the ageing population. In this thesis, inspired by the principles of personalised medicine, we describe an integrative approach combining “-omics” methodologies. We use a model of a “common denominator” for cardiovascular disease (CVD) and other chronic diseases to identify biomarkers linked with common diseases risk factors and molecular pathways. With the investigation of genetic variants, located in the region of the TREM2 gene, we identified the association of SNP rs6918289 with increased levels of TNF-α and intima-media thickness of the femoral artery. With the use of epigenome-wide association studies (EWAS), we identified novel epigenetic biomarkers related to common diseases risk factors: central obesity and lipid levels. One methylation site (CpG) was associated with increased waist circumference (cg16170243), which could explain the epigenetic regulation of central obesity. Moreover, an EWAS of the triglyceride levels identified two significant CpG sites, one of which was replicated in the adipose tissue (cg04580029), giving insights into epigenetic regulation of lipid levels. An EWAS was also used to study the epigenetics of VEGF-A levels; 20 CpG sites were identified and their relations with VEGF-A regulation were analysed through detailed bioinformatics analysis. VEGF-A was further investigated for its relation with 11 cytokines. VEGF-A protein levels were associated with IL-4, MCP1 and EGF. Specific VEGF-A mRNA isoforms were also investigated for their association with cytokines; VEGF165 showed associations with MCP1 and IL-1α and VEGF189 with IL-4 and IL-6. Together with another important biomarker, TL, we studied the role of VEGF-A in atherosclerosis and identified one VEGF-A related genetic variant associated with telomere attrition, which could present a common denominator of chronic diseases. The employment of diverse methodologies for the investigation of common chronic diseases risk factors and pathways provided new diagnostic markers and generated results, which could help to improve the diseases risk prediction based on the individual genetic “make-up”. New insights into associations between different biomarkers might help in understanding the pathophysiological pathways common between CVDs and other chronic diseases.

L'expression des gènes est étroitement régulée par différentes régions régulatrices afin d'assurer une grande variété de types cellulaires et de fonctions. Identifier ces régions régulatrices actives, leurs caractéristiques et comprendre comment elles interagissent entre elles dans chaque type cellulaire est un enjeu majeur. Cette connaissance permettrait notamment de mieux comprendre l'impact des variants génomiques très souvent localisés dans les régions non-codantes. Par ailleurs, le développement de cancers et autres maladies est lié à des dérégulations des contrôles de l'expression des gènes. Pour pouvoir envisager des traitements ciblés et tendre vers une médecine de précision, il est important de comprendre comment toute cette machinerie est orchestrée.Plusieurs approches ont été développées pour répondre à cette question, la plupart basées sur des données expérimentales de modification d'histones, méthylation et facteurs de transcription (TFs). Cependant, ces données sont limitées à des échantillons spécifiques et ne peuvent pas être générées pour tous les régulateurs et tous les patients. Mes travaux de thèse ont porté, dans une première partie, sur la modélisation de l'expression des gènes uniquement à partir de l'information contenue dans la séquence ADN. Nous avons utilisé un modèle linéaire avec sélection de variables, équivalent en terme de performances à des méthodes non paramétriques et simple à interpréter. Ce modèle m'a permis de comparer plusieurs types de variables basées sur la séquence ADN, comme les motifs de fixation des TFs et la composition nucléotidique. Ces variables sont déterminées pour différentes régions du gène afin d'évaluer leur pouvoir régulateur et leur contribution. Les introns seuls, dont la composition nucléotidique reflète celle de l'environnement du gène, expliquent une part importante de la variation de l'expression des gènes. De plus, nous avons démontré que les domaines topologiques (TADs), dans lesquels les interactions sont favorisées, partagent une composition génomique similaire. Notre modèle de prédiction nous permet vraisemblablement de capturer, pour chaque individu, la composition des TADs actifs.Dans un second temps de mon travail, je me suis intéressée aux régulations pouvant survenir dans les introns. Le consortium international FANTOM a fourni un des atlas de sites de départ de la transcription (TSSs) les plus importants à ce jour et nous avons noté que la majorité d'entre eux sont détectés dans les régions non-codantes, notamment les introns. Nous avons donc entrepris un travail visant à explorer ces TSS introniques. Pour déterminer si ces TSSs sont fonctionnels, je me suis intéressée à la recherche de potentiels motifs régulateurs autour de ces signaux de transcription. Une fraction de ces signaux sont localisés 2 bases en aval d'une répétition de Thymidines (T). Des évidences biochimiques et génétiques suggèrent qu'au moins une partie de ces signaux correspondent à de longs ARNs non-codants sens-introniques exprimés de manière tissu-spécifique. Il semblerait également que la longueur des répétitions de Ts ait une influence sur la présence d'un signal de transcription au niveau de ces loci et, indirectement, sur l'expression du gène hôte. Ces observations offrent une possible base moléculaire à l'effet de ces courtes répétitions en tandem de T. / Genome expression is tightly controlled by different regulatory regions to provide a wide variety of cell types and functions. Identifying these regulatory regions, their characteristics and understand how they interact with each other in a tissue-specific manner is prime importance. This knowledge should help better understand the impact of genomic variants often located in non-coding regions. Besides, cancer development is invariably linked to deregulation of gene expression controls. To pave the way for targeted treatments and precision medicine, it is important to understand how all this machinery is orchestrated.To answer this question, several approaches were developed, most of them based on experimental data of histone modification, methylation and transcription factors (TFs). However, these data are limited to specific samples and cannot be generated for all the regulators and all the patients. First, my thesis research aimed at modeling gene expression based on DNA sequence only. We used a linear model with variable selection, equivalent in term of performances with non-parametric methods and easy to interpret. This model allowed me to compare several types of variables based on the DNA sequence, as TFs binding motifs and nucleotide composition. These variables are computed for various gene regions to estimate their regulatory power and contribution. Strikingly, introns, for which nucleotide composition reflects gene environment, appear to explain an important part of gene expression variation. Furthermore, we demonstrated that the topological domains (TADs), in which interactions are favored, share similar genomic compositions. Our prediction model presumably captures, for every individual, the composition of active TADs.A second aspect of my work studied the regulations occurring in introns. The international FANTOM consortium provided one of the most important transcription start sites (TSSs) atlas and we noticed that the majority of these TSSs are detected into non-coding regions, in particular introns. We thus investigated these intronic TSSs. To determine if these TSSs are functional, we searched for new potential regulatory motifs at the vicinity of these transcription signals. We found that a fraction of them is located 2 bases downstream of a repetition of Ts. Biochemical and genetic evidences suggest that at least part of these signals correspond to sense-intronic long non-coding RNAs, which are expressed in a tissue specific manner. The length of the T repetition also appears to govern the presence of a transcription signal at these loci and indirectly impact on host gene expression. These findings provide one possible molecular explanation for the effect of these short tandem repeats of Ts.

Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), le groupe de protéines Polycomb (PcG) répriment les gènes de développement en participant ainsi à la maintenance de l’état de pluripotence. Ce complexe dépose la H3K27me3au niveau des éléments régulateurs induisant une compaction de la chromatine. Cette marque forme en plus des marquesactives H3K4me3 présentes des domaines bivalents. Etrangement, des boucles d’ADN dites entre le promoteur et enhancer, généralement associé à l’activation du gènes, sont observées au niveau des gènes bivalents avant leur activation.On suppose que la fonction du PcG pourrait être de neutraliser l'enhancer conférant une future activation rapide des gènes.Au cours de ma thèse, j’ai identifié les boucles d’ADN formé par les réprimés par PcG dans les mESCs. Pour cela,j’ai effectué un profilage épigénomique de 4 marques d'histones et identifié près de 2500 promoteurs bivalents et 13000enhancers. En utilisant des données publiées de Hi-C à haute résolution, j’ai identifié toutes les boucles formées par les domaines bivalents. Etonnement, j’ai pu identifier que de nombreux gènes réprimés par PcG interagissent avec des enhancers actifs. Cette observation a été suivie d'une validation par le 4C-seq. De plus, j’ai effectué une caractérisation fonctionnelle des boucles en utilisant deux approches. Tout d'abord, j'ai mis en place, en collaboration avec D. Bourc'his(Institut Curie), un système de culture de mESCs (2i + VitC) où le taux de H3K27me3 est réduit. J'ai effectué un profilage épigénomique similaire révélant que les promoteurs réprimés par PcG ont perdu la marque H3K27me3. En RNA-seq, j’ai démontré que l’expression des gènes ne change pas après le PcG soit détacher des promoteurs.. Ensuite, par la réalisation de plusieurs validations en 4C-seq j’ai démontré que les interactions avec les enhancers ne sont pas affecté alors que la moitié des enhancers interagissant perdent leurs marques activatrices. Dans le système 2i+VitC, ces gènes semblent être réprimés par un autre mécanisme suite à la perte du PcG. De plus, j’utilise une approche ciblée pour enlever localement laH3K27me3 de deux gènes bivalents en utilisant le système Cette technique est en cours d’optimisation.Notre étude est la plus systématique au niveau génomique des boucles d'ADN dans le cadre de la régulation des gènes PcG. Notre étude révèle une nouvelle fonction du PcG qui est la répression de boucle d’ADN déjà établies entre promoteurs et enhancers. / In the mouse embryonic stem cells (mESCs), Polycomb Group Proteins (PcG) repress developmental genes and thereby participating in the maintenance of the pluripotency. PcG repress genes by depositing the H3K27me3 histone marks on their regulatory elements, followed by chromatin compaction. In addition to the H3K27me3 marks, those genes carry H3K4me3 active marks and were characterized as bivalent. Intriguingly, at many PcG repressed genes, DNA loops can be observed with enhancer elements, which are normally thought to have an activating function. The aim of my project is to both describe and mechanistically dissect the function of Polycomb repressed promoter – enhancer loops.During my PhD, I aimed firstly to identify all promoter–enhancer loops involved by PcG repressed genes in mESCs. I have performed ChIP-seq profiling of 4 histone marks and identified around 2500 PcG repressed promoters and 13000 enhancers. Using a recently published high-resolution Hi-C data in mESCs, I have identified all DNA loops that are formed by PcG repressed promoters. Surprisingly, a high percentage of bivalent promoters were found to contact active enhancers. The presence of those loops were validated by ultra-high 4C-seq on selected genes and imply a small significant increase of the gene expression without leading to a complete activation of the gene. I have established a more physiological ESC model (2i+VitC) where H3K27me3 is reduced at all promoters. I have performed ChIP-seq, where bivalent promoters were all classified as H3K27me3 negative. RNA-seq experiments have showed that those genes do not become activated. 4C-seq experiments have revealed that those loops do not disappear after PcG removal, whereas the half of interacted enhancer loose their H3K27ac active marks. Those genes seem to remain repressed by an unknown mechanism. These results argue for a possible role of PcG in preparing the gene for their activation by blocking the productivity of such DNA loops. Secondly, I aimed to functionally characterize those DNA loops by using a CRISPR/dCas9 approach to completely remove H3K27me3 from two PcG repressed genes that contact active enhancers Pax6 and Nkx1-1 genes. This system is still under optimization steps.My project revealed the most systematic characterization of DNA loops under the regulation of PcG, providing important insight how PcG function to inactivate such loops. I have highlighted an additional function of PcG which the involvement in the repression of already establish loops between active enhancers and promoters and thereby blocking the productivity of such activating loops. This function is an addition to the already described repressive function of PcG on both promoters and poised enhancers.

Dans les cancers, la transcription des gènes peut être altérée par des mécanismes génétiques ou épigénétiques. En 2011, mon laboratoire a montré que la progression des cancers de la vessie pouvait être liée à un mécanisme épigénétique appelé MRES (« Mutiple Regional Epigenetic Silencing »). Les tumeurs possédant ce phénotype présentent une inactivation simultanée de gènes voisins dans 7 régions du génome. A l’aide d’une nouvelle approche bio-informatique : « SegCorr », nous avons identifié plus de 400 régions du génome dont l’expression des gènes est corrélée indépendamment du nombre de copie du gène. Ces régions se répartissent en 7 groupes et sont associées à 6 phénotypes de cancer de la vessie. De plus, l’extinction de l’expression des gènes d’une faible proportion de régions est associée à la méthylation de l’ADN et/ou une perte sur les histones de de marques d’activation de la transcription : H3K9ac et H3K4me3 ou des gains de marques de répression de la transcription : H3K27me3 et H3K9me3. Grâce au nouvel algorithme « Musette », J’ai montré que le phénotype MRES n’était probablement pas dû à des altérations génétiques. Enfin, pour comprendre à quel stade de la progression tumorale du cancer de la vessie le phénotype MRES pourrait apparaître, j’ai montré que les tumeurs de cancer de vessie induites chez les souris par ingestion d’un carcinogène (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine) pouvait être un bon modèle d’étude. / In cancers, gene transcription can be altered by genetic or epigenetic mechanisms. In 2011, my laboratory showed that the progression of bladder cancer could be linked to an epigenetic mechanism called MRES ("Mutiple Regional Epigenetic Silencing"). Tumors with this phenotype exhibit simultaneous inactivation of neighboring genes in 7 regions of the genome. Using a new bioinformatics approach: "SegCorr", we have identified more than 400 genomic regions in which gene expression is correlated. These regions fall into 7 groups and are associated with 6 phenotypes of bladder cancer. In addition, the extinction of gene expression from a small proportion of regions is associated with DNA methylation and / or loss of histone marks associated with active transcription: H3K9ac and H3K4me3 or gains of histone marks associated with transcription repression: H3K27me3 and H3K9me3. Using a new algorithm “Musette”, I have shown that the MRES phenotype is probably not due to genetic alterations. Finally, to understand at which stage of tumor progression of bladder cancer the MRES phenotype might appear, I have shown that bladder cancer tumors induced in mice by ingestion of a carcinogen (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) could be a good model.