Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L’érythropoïèse est le processus aboutissant à la production des hématies à partir d’une cellule souche hématopoïétique. La différenciation érythroïde implique des changements morphologiques en partie liés à la perte d’expression membranaire du récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit. En réponse à son ligand, le SCF, c-Kit est activé puis internalisé et dégradé par la voie du protéasome, via l’ubiquitine E3-ligase c-Cbl, ou par la voie lysosomale suite à une endocytose. Dans la première partie de ce travail, nous avons pu mettre en évidence qu’en absence de SCF et en réponse à un inhibiteur de tyrosine kinase, l’imatinib, les érythroblastes cultivés ex vivo perdent l’expression membranaire de c-Kit et accélèrent leur entrée en différenciation terminale. Au vu de ces observations, nous avons cherché à comprendre les mécanismes impliqués. Sur un modèle de cellules érytholeucémiques dépendantes de l’érythropoïétine, mais exprimant de manière endogène c-Kit, nous avons montré que l’imatinib induit une internalisation du récepteur ainsi que sa dégradation par la voie lysosomale et de manière indépendant de c-Cbl. De plus, nous avons montré que cet effet est réversible et que l’imatinib ne bloque pas la réexpression de c-Kit après son internalisation en réponse au SCF. Des marquages métaboliques ont permis de montrer que l’imatinib ne modifie ni la synthèse ni la maturation de c-Kit et que le profil phospho-tyrosine des cellules traitées à l’imatinib est globalement inchangé. Enfin, nous avons montré que la fixation de l’imatinib à la poche catalytique de c-Kit est indispensable à son internalisation, et par conséquent à sa dégradation. Il apparait donc que l’imatinib lève l’auto-inhibition de c-Kit, qui semble nécessaire pour son maintien à la membrane. Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux changements morphologiques subis par les nucléoles, lieu de la biogenèse des ribosomes, au cours de différenciation des érythroblastes. L’étude de la taille et du potentiel prolifératif des cellules, ainsi que l’analyse morphologique des nucléoles, nous a permis de confirmer que la réduction de taille des cellules est contemporaine d’un ralentissement de leur prolifération ainsi que de la réduction du volume et de la surface du composé granulaire (CG), « matrice » du nucléole. En microscopie électronique, nous montrons la persistance des CG en fin de maturation. Enfin, nous avons également étudié l’évolution des nucléoles dans un contexte pathologique de syndromes myélodysplasiques de faible risque, qui se caractérisent par une hématopoïèse inefficace. Nous observons que les cellules pathologiques immatures ont des CG plus volumineux que les cellules normales immatures, et qu’au cours de la différenciation, la morphologie des nucléoles est identique entre les cellules normales et pathologiques. En conclusion, ce travail a permis de décrire 1) le mécanisme d’internalisation d’un récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit par l’imatinib et 2) la morphologie du nucléole au cours de la différenciation érythroïde normale et pathologique des syndromes myélodysplasiques de faible risque. / Erythropoiesis is the process leading to the production of red blood cells from hematopoietic stem cell. The erythroid differentiation involves morphological cell changes, in part related to the loss of membrane expression of the type III receptor tyrosine kinase, c-Kit. In response to its ligand SCF, c-Kit is activated, then internalized and degraded by the proteasome pathway via the E3 ubiquitin ligase c-Cbl, or by the lysosomal pathway, after endocytosis. In the first part of this work, we demonstrated that in the absence of SCF and in response to tyrosine kinase inhibitor, imatinib, erythroblasts cultured ex vivo, lose membrane expression of c-Kit and accelerate their terminal differentiation. In view of these observations, we sought to understand the mechanisms involved. On an erythropoietin dependent cell line expressing c-Kit at the membrane, we showed that imatinib induces receptor internalization and degradation by the lysosomal pathway, independently of c -Cbl. Furthermore, we showed that this effect is reversible and that imatinib does not block the c-Kit re-expression after its internalization, in response to SCF. Metabolic labelling showed that imatinib does not alter synthesis or maturation of c -Kit and that the phospho-tyrosine profile of cells treated with imatinib is generally unchanged. Finally, we showed that the binding of imatinib to the catalytic pocket of c-Kit is essential for its internalization, and therefore its degradation. So, it appears that imatinib removes c-Kit self-inhibition, which seems necessary to its retention at the membrane. In the second part of this work, we studied the morphological changes of nucleoli, the site of ribosome biogenesis, during erythroid differentiation. We showed that the reduction of cell size takes place at the same time than reduction of cell proliferation and reduction of surface and volume of the Granular Compound (GC), the “matrix” of the nucleolus. Moreover, we showed by electronic microscopy, the persistence of GC at the end of maturation. Finally, we also studied the evolution of nucleoli in a pathological context of low risk myelodysplastic syndromes, which are characterized by ineffective hematopoiesis. We observed that immature pathological cells have larger GC than immature normal cells, but that during differentiation, the morphology of nucleoli is identical between normal and pathological cells. In conclusion, this work has allowed us to describe 1) the mechanisms of internalization of a class III receptor tyrosine kinase, c-Kit by imatinib and 2) the morphology of the nucleolus during normal and pathological low risk myelodysplastic syndromes of erythroid differentiation.

L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Au cours de la différenciation érythroïde, l'inclusion de l'exon 16 du pré-messager 4.1R représente un événement majeur pour la fonction érythrocytaire normale de la protéine 4.1R. Cet événement d'épissage est bloqué dans les cellules MEL surexprimant l'oncoprotéine Spi.1/PU.1. Mon travail de thèse avait pour but de comprendre ce mécanisme de blocage en étudiant le rôle de la voie de signalisation de la PI3K en relation avec la phosphorylation de Spi.1/PU.1 d'une part, et celle des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR d'autre part. J'ai montré que l'inhibition de la PI3K active la production d'hémoglobine ainsi que l'épissage de l'exon 16 4.1R. Ensuite j'ai montré que la phosphorylation de Spi-1/PU.1 par la PI3K est nécessaire pour son activité d'inhibition de la différenciation et de l'épissage de l'exon 16 4.1R. Enfin, j'ai montré que le facteur d'épissage Srp40 de la famille des protéines SR est un activateur stade spécifique de l'inclusion de l'exon 16. La surexpression de Srp40 dans les cellules MEL active l'inclusion de l'exon 16 indépendamment de la différenciation.

L'érythropoïèse est le processus aboutissant à la production des hématies à partir d'une cellule souche hématopoïétique. La différenciation érythroïde implique des changements morphologiques en partie liés à la perte d'expression membranaire du récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit. En réponse à son ligand, le SCF, c-Kit est activé puis internalisé et dégradé par la voie du protéasome, via l'ubiquitine E3-ligase c-Cbl, ou par la voie lysosomale suite à une endocytose. Dans la première partie de ce travail, nous avons pu mettre en évidence qu'en absence de SCF et en réponse à un inhibiteur de tyrosine kinase, l'imatinib, les érythroblastes cultivés ex vivo perdent l'expression membranaire de c-Kit et accélèrent leur entrée en différenciation terminale. Au vu de ces observations, nous avons cherché à comprendre les mécanismes impliqués. Sur un modèle de cellules érytholeucémiques dépendantes de l'érythropoïétine, mais exprimant de manière endogène c-Kit, nous avons montré que l'imatinib induit une internalisation du récepteur ainsi que sa dégradation par la voie lysosomale et de manière indépendant de c-Cbl. De plus, nous avons montré que cet effet est réversible et que l'imatinib ne bloque pas la réexpression de c-Kit après son internalisation en réponse au SCF. Des marquages métaboliques ont permis de montrer que l'imatinib ne modifie ni la synthèse ni la maturation de c-Kit et que le profil phospho-tyrosine des cellules traitées à l'imatinib est globalement inchangé. Enfin, nous avons montré que la fixation de l'imatinib à la poche catalytique de c-Kit est indispensable à son internalisation, et par conséquent à sa dégradation. Il apparait donc que l'imatinib lève l'auto-inhibition de c-Kit, qui semble nécessaire pour son maintien à la membrane. Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux changements morphologiques subis par les nucléoles, lieu de la biogenèse des ribosomes, au cours de différenciation des érythroblastes. L'étude de la taille et du potentiel prolifératif des cellules, ainsi que l'analyse morphologique des nucléoles, nous a permis de confirmer que la réduction de taille des cellules est contemporaine d'un ralentissement de leur prolifération ainsi que de la réduction du volume et de la surface du composé granulaire (CG), " matrice " du nucléole. En microscopie électronique, nous montrons la persistance des CG en fin de maturation. Enfin, nous avons également étudié l'évolution des nucléoles dans un contexte pathologique de syndromes myélodysplasiques de faible risque, qui se caractérisent par une hématopoïèse inefficace. Nous observons que les cellules pathologiques immatures ont des CG plus volumineux que les cellules normales immatures, et qu'au cours de la différenciation, la morphologie des nucléoles est identique entre les cellules normales et pathologiques. En conclusion, ce travail a permis de décrire 1) le mécanisme d'internalisation d'un récepteur à activité tyrosine kinase de classe III, c-Kit par l'imatinib et 2) la morphologie du nucléole au cours de la différenciation érythroïde normale et pathologique des syndromes myélodysplasiques de faible risque.

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde. / One of the most important complications of intensive radiotherapy or chemotherapy is cytopenia, which can persist for significant amount of time even after stem cell transplantation. PBI-1402, a small lipid, was previously shown to be associated with decreased neutrophil apoptosis caused by cytotoxic agents. Our work has shown that day primary human hematopoietic cell in vitro culture in the presence of PBI-1402 resulted in an increased number of erythroid progenitors (p<0,05). Dose-response experiments evaluating sensitivity to erythropoietin (Epo) of cells exposed to PBI-1402 indicated that PBI-1402 did not have a sensitizing effect and that both treated and control cells respond similarly to Epo. In addition, PBI-1402, used in combination with stem cell factor (SCF) and Epo, enhanced and prolonged ERK1/2 phosphorylation (p<0.05), a signalling pathway important for erythroid progenitor cell proliferation. This effect was associated with a decrease of the phosphatase MKP-1 activation in PBI-1402 exposed cells. This translated into and increased proliferation of erythroid progenitors as well as a reduced duration and level of anemia in an in vivo murine transplantation model. Lethally irradiated mice that received syngeneic stem cell transplantation were treated orally with PBI-1402 for 14 days. These mice demonstrated a significant reduction in post-transplantation anemia in a dose dependent manner compared to control (vehicle)(p<0.05). Moreover, PBI-1402-treated mice harboured significantly higher numbers of BFU-E and CFU-E in bone marrow compared to control (p<0.05). These results demonstrate that PBI-1402 treatment significantly reduced transplantation-induced anemia with concomitant acceleration in erythroid recovery.

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde. / One of the most important complications of intensive radiotherapy or chemotherapy is cytopenia, which can persist for significant amount of time even after stem cell transplantation. PBI-1402, a small lipid, was previously shown to be associated with decreased neutrophil apoptosis caused by cytotoxic agents. Our work has shown that day primary human hematopoietic cell in vitro culture in the presence of PBI-1402 resulted in an increased number of erythroid progenitors (p<0,05). Dose-response experiments evaluating sensitivity to erythropoietin (Epo) of cells exposed to PBI-1402 indicated that PBI-1402 did not have a sensitizing effect and that both treated and control cells respond similarly to Epo. In addition, PBI-1402, used in combination with stem cell factor (SCF) and Epo, enhanced and prolonged ERK1/2 phosphorylation (p<0.05), a signalling pathway important for erythroid progenitor cell proliferation. This effect was associated with a decrease of the phosphatase MKP-1 activation in PBI-1402 exposed cells. This translated into and increased proliferation of erythroid progenitors as well as a reduced duration and level of anemia in an in vivo murine transplantation model. Lethally irradiated mice that received syngeneic stem cell transplantation were treated orally with PBI-1402 for 14 days. These mice demonstrated a significant reduction in post-transplantation anemia in a dose dependent manner compared to control (vehicle)(p<0.05). Moreover, PBI-1402-treated mice harboured significantly higher numbers of BFU-E and CFU-E in bone marrow compared to control (p<0.05). These results demonstrate that PBI-1402 treatment significantly reduced transplantation-induced anemia with concomitant acceleration in erythroid recovery.

L'épissage alternatif des ARNs pré-messagers est le mécanisme majeur de diversification de l'information génétique chez les eucaryotes supérieurs. Près de 70% des gènes sont concernés par ce mécanisme. Au cours de la différenciation érythroïde, l'inclusion de l'exon 16 du pré-messager 4.1R représente un événement majeur pour la fonction érythrocytaire normale de la protéine 4.1R. Cet événement d’épissage est bloqué dans les cellules MEL surexprimant l’oncoprotéine Spi.1/PU.1. Mon travail de thèse avait pour but de comprendre ce mécanisme de blocage en étudiant le rôle de la voie de signalisation de la PI3K en relation avec la phosphorylation de Spi.1/PU.1 d'une part, et celle des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR d'autre part. J’ai montré que l’inhibition de la PI3K active la production d’hémoglobine ainsi que l’épissage de l’exon 16 4.1R. Ensuite j’ai montré que la phosphorylation de Spi-1/PU.1 par la PI3K est nécessaire pour son activité d’inhibition de la différenciation et de l’épissage de l’exon 16 4.1R. Enfin, j’ai montré que le facteur d’épissage Srp40 de la famille des protéines SR est un activateur stade spécifique de l’inclusion de l’exon 16. La surexpression de Srp40 dans les cellules MEL active l’inclusion de l’exon 16 indépendamment de la différenciation. / Pre-mRNA alternative splicing is a major mechanism of diversification of genetic information in evolued eukaryotes. The expression of about 70% of genes is regulated by this mechanism. During late erythroid development, the inclusion of exon 16 in the mature 4.1R mRNA is a major event that is essential for the corresponding protein function. This process is inhibited in MEL cells overexpressing the oncoprotein Spi-1/PU.1. My thesis work aims to understand the mechanism of this inhibition by studying the role of PI3K signal transduction pathway and its effects on Spi-1/PU.1 in the first place, then its effects on the SR protein family. I showed that PI3K inhibition leads to the activation of hemoglobin synthesis and to the inclusion of exon 16. Moreover, I showed that the phosphorylation mediated by the PI3K pathway is necessary for both the differentiation-inhibiting activity of Spi-1/PU.1 and concurrent inclusion of exon 16. Finally, I showed that the Srp40 splicing factor is an activator of the exon 16 inclusion. Overexpression of Srp40 in MEL cells lineage activates exon 16 inclusion independently of the differentiation.