La protéine EPB41L5 est exprimée lors de la transition épithélio-mésenchymateuse, qui survient lorsque des cellules épithéliales acquièrent des caractéristiques mésenchymateuses, ce qui joue un rôle majeur dans la progression tumorale. Cette protéine est d'ailleurs surexprimée dans plusieurs cancers, où elle favorise un phénotype agressif via l'invasion cellulaire, le développement de métastases et la résistance aux médicaments. Il n'est donc pas surprenant que l'expression d'EPB41L5 soit associée à un mauvais pronostic chez les patients souffrant du cancer. Cependant, la signalisation entourant EPB41L5 est méconnue. En se basant sur des travaux réalisés chez la drosophile, nous avons émis l'hypothèse qu'EPB41L5 fait partie d'un complexe avec NADSYN1 et la déacétylase SIRT2. Ce complexe permettrait la déacétylation de substrats spécifiques, ce qui induirait la progression tumorale. Cette étude vise à 1) valider les interactions entre les protéines du complexe autant chez la drosophile que chez l'humain, 2) déterminer si et comment EPB41L5 module l'acétylation des cibles de SIRT2 et 3 )vérifier la localisation subcellulaire d'EPB41L5. Nous avons réalisé des immunoprécipitations, des fractionnements cellulaires et des analyses par immunobuvardage. Nos travaux indiquent qu' EPB41L5, NADSYN1 et SIRT2 semblent former un complexe conservé entre la drosophile et l'humain. EPB41L5 module aussi l'acétylation de plusieurs cibles de SIRT2, en favorisant l'interaction entre la déacétylase et ses substrats. Nous avons également découvert qu'EPB41L5, en plus d'être cytoplasmique, est aussi nucléaire, ce qui implique potentiellement la présence d'un mécanisme semblable dans ce compartiment. Ces travaux ouvrent la voie vers la caractérisation d'un mécanisme novateur impliquant EPB41L5 dans la progression tumorale. Une étude plus approfondie du complexe EPB41L5-NADSYN1-SIRT2 pourrait donner des pistes pour établir de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrant de cancers agressifs exprimant EPB41L5. / The EPB41L5 protein is expressed during the epithelial-mesenchymal transition, which occurs when epithelial cells acquire mesenchymal characteristics. This plays a major role in tumor progression. EPB41L5 is overexpressed in several cancers, where it promotes an aggressive phenotype via cell invasion, the development of metastases and drug resistance. It is therefore not surprising that EPB41L5 expression is associated with a poor prognosis in cancer patients. However, the signaling pathways downstream of EPB41L5 are poorly understood. Based on previous work done in Drosophila, we hypothesized that EPB41L5 is part of a complex with NADSYN1 and SIRT2 deacetylase. This complex would allow the deacetylation of specific substrates, which would induce tumor progression. This study aims to 1) validate the interactions between proteins in both Drosophila and humans, 2) determine if and how EPB41L5 modulates the acetylation of SIRT2 targets and 3) verify the cellular localization of EPB41L5. We performed immunoprecipitations, cell fractionations and immunoblotting analyses. Our work indicates that EPB41L5, NADSYN1 and SIRT2 appear to form a conserved complex between Drosophila and humans. EPB41L5 also modulates the acetylation of several SIRT2 targets, promoting the interaction between the deacetylase and its substrates. We also discovered that EPB41L5, in addition to being cytoplasmic, is also nuclear, potentially implying the presence of a similar mechanism in this compartment. This work paves the way for the characterization of a novel mechanism involving EPB41L5 in tumor progression. Further study of the EPB41L5-NADSYN1-SIRT2 complex could provide clues to establish new therapeutic approaches for patients suffering from aggressive cancers expressing EPB41L5.

La médecine transfusionnelle est un rouage important du système de santé canadien. Au Québec, la banque de sang Héma-Québec gère l’ensemble des étapes de la collecte de sang et la livraison des produits sanguins aux hôpitaux. Depuis quelques années, l’altération de la déformabilité des globules rouges observée durant leur entreposage dans les banques de sang est revenue à l’avant-plan des discussions en raison de l’accessibilité grandissante de nouvelles technologies permettant de mieux caractériser cette propriété. L’objectif de ce projet, réalisé au sein d’Héma-Québec, consistait à développer une approche microfluidique novatrice permettant la mesure de l’évolution de la déformabilité des globules rouges durant leur entreposage dans une banque de sang. Le suivi de la déformabilité de six concentrés de globules rouges entreposés à T = [2-8 °C] durant 42 jours a permis de déterminer que les performances de la méthode microfluidique surpassent celles d’une méthode comparative également développée dans le cadre de ce projet. Certaines inconsistances observées lors de l’application de la méthode microfluidique ont subséquemment mené à une phase d’optimisation. Bien que certains aspects de la méthode doivent encore être améliorés, les résultats de ce projet laissent présager que la déformabilité pourrait éventuellement servir de marqueur de qualité des globules rouges au même titre que les marqueurs les plus éloquents actuellement pris en compte à Héma-Québec. / Transfusion medicine is an important part of the Canadian health care system. In Quebec, the Héma-Québec blood bank manages all stages from blood collection to delivery of blood products to hospitals. In recent years, the alteration of red blood cells deformability observed during storage in blood banks has returned to the forefront of discussions because of the increasing accessibility of new technologies to better characterize this property. This project objective was to develop, within Héma-Québec, a novel microfluidic approach to measure the evolution of red blood cells deformability during blood bank storage. Monitoring the deformability of six red blood cells concentrates stored at T = [2-8 °C] for 42 days determined that the performance of the microfluidic method surpassed that of a comparative method, which was also developed as part of this project. Some inconsistencies observed during the application of the microfluidic method have subsequently led to an optimization phase. Although some aspects of the method still need to be improved, the results of this project suggest that deformability could possibly serve as a quality marker of red blood cells in the same way as the most eloquent markers do.

On expose ici deux méthodes de déformation de globules rouges. La première méthode constituée de deux faisceaux laser contre propageant non focalisés est appelée « optical stretcher ». On y décrit les forces et stress appliqués à la cellule pour ensuite déterminer la déformation. La comparaison des résultats théoriques avec les expériences réalisées a permis de déterminer l’élasticité membranaire à (20±2)μNm-1. Une méthode originale n’utilisant aucun système d’imagerie et permettant de mesurer la déformation de la cellule déformée en utilisant le couplage résiduel dans les fibres optique est mathématiquement expliquée et les résultats théoriques utilisés pour étudier la faisabilité d’une telle expérience. La seconde méthode appelée « oscillating tweezer » est constituée d’une trappe optique à forte ouverture numérique où un modulateur acousto-optique permet de changer discrètement la position du foyer de la trappe avec une fréquence ajustable. A basse fréquence, la cellule se dandine de gauche à droite, mais à plus haute fréquence, la cellule se déforme. On expliquera donc l’origine de la déformation causée par la distribution de la force. Une théorie approximative est présentée pour calculer la déformation. Encore une fois, une comparaison avec les expériences réalisées a été effectuée. L’élasticité membranaire pour des globules rouges humains a pu être mesurée entre 20uNm-1 et 29uNm-1 et autour de 11uNm-1 pour des globules rouges de souris. / Two methods for deforming red blood cell (RBC) are studied. The first method is made of a non focalised dual beam counter-propagating optical stretcher. The stress and forces applied to the cell are described and analysed to compute the resulting deformation. The comparison with experimental result is made and allows to determinate the elasticity of human RBC at (20±2)μNm-1. An original method using no imaging system and allowing to measure the cells deformation by using the fiber-to-fiber coupling is mathematically explained and used to study the feasibility of such an experiment. The other method called oscillating tweezers is built from a high numerical aperture optical tweezers where an acousto-optic modulator allows to discretely changing the focal position at a given frequency. At low frequency, the cell moves from left to right, however at higher frequency, the RBC deform. The origin of the deformation is explained by calculating an approximate stress distribution. Here again, we compare the results with the experimental work. The value of elasticity found for human RBC is between 20uNm-1 and 29uNm-1 and around 11uNm-1 for mice RBC.

En hématologie, des tensioactifs tels que les saponines sont utilisés comme agent érythrolytique afin de compter et identifier les différentes populations de globules blancs, qui sont mille fois moins abondants que les érythrocytes. Ces saponines sont utilisées pour leur lyse sélective des globules rouges dans les réactifs d’HORIBA Médical. Au cours de cette thèse, nous avons étudié l’action de différents tensioactifs sur les cellules sanguines afin d’avoir une meilleure compréhension des interactions tensioactifs/membrane. Le premier projet a porté sur l’observation et la caractérisation des effets des saponines sur les érythrocytes par des méthodes microscopiques et spectrophotométriques, dans le but d’obtenir une meilleure compréhension de leur sélectivité vis-à-vis des globules rouges. Nous avons ainsi démontré la participation du cholestérol, des transporteurs tels que la bande 3 et du cytosquelette lors de la lyse par les saponines. Dans une seconde étude, des recherches ont été entreprises afin d’identifier les propriétés requises d’un tensioactif pour obtenir un agent lytique efficace. Nous avons sélectionné deux types de familles de tensioactifs, l’une non-ionique de type éther d’alcool polyoxyéthylèné, et l’autre anionique à base d’acides aminés. Ces études se sont concentrées sur la relation entre le pouvoir érythrolytique et certains paramètres physico-chimiques des tensioactifs tels que la concentration micellaire critique (CMC), la balance hydrophile-lipophile (HLB), le coefficient de partage entre la membrane et le milieu aqueux (Kb), et le packing parameter (P). Nous avons montré qu’une considération globale de l’ensemble de ces paramètres était nécessaire pour pouvoir prédire les interactions des tensioactifs avec la membrane des érythrocytes. Enfin, l’effet lytique de ces tensioactifs sur les leucocytes a été étudié en cytométrie en flux afin de vérifier l’intégrité des globules blancs lors des différentes lyses. Les résultats obtenus au cours de ces travaux de thèse rendent possible le développement de futurs réactifs hématologiques pour la différenciation leucocytaire. / Surfactants such as saponins are employed, in the haematology field, as erythrolytic agent in order to count and to identify different leukocyte populations, which are typically thousand times less abundant than erythrocytes. These saponins are used for erythrocytes selective lysis in HORIBA Medical reagents. This thesis aimed to study the action of different surfactants on red blood cells in order to have a better understanding of surfactants/membrane interactions. The first project involved the observation and the characterization of saponins effects on erythrocytes by microscopic and spectrophotometric methods, in order to understand saponins selectivity regarding erythrocytes. We have thus demonstrated the participation of cholesterol, transporters such as band 3 and erythrocyte cytoskeleton during saponins lysis. In a second study, investigations have been performed in order to identify surfactants properties required to get a suitable erythrocyte lysing agent. We have chosen two surfactants families: non-ionic surfactants of the polyoxyethylene alkyl ethers series and anionic amino acid-based surfactants. These studies are focused on the relation between surfactants erythrolytic potency and some physico-chemical parameters such as the critical micellar concentration (CMC), the hydrophile-lipophile balance (HLB), the surfactants membrane / water partition coefficient (Kb) and the packing parameter (P). We have thus shown that the global consideration of all these physico-chemical parameters was necessary to predict surfactants interactions with the erythrocytes membrane. Finally, the lytic effects of surfactants on leukocytes were studied in flow cytometry to verify leukocytes integrity during different lysis. The results obtained in this thesis make possible the future development of hematological reagent for leukocytes differentiation.

Au cours de la dernière année, Héma-Québec a fourni plus de 236 000 culots globulaires aux centres hospitaliers du Québec, ce qui a permis de sauver la vie de milliers de gens. Les transfusions de ces produits sanguins ne sont toutefois pas sans risques. Il y a, chaque année, de nombreux cas d’effets adverses suite à une ou plusieurs transfusions. La TRIM (Transfusions-Related Immunomodulation) est un concept qui a été développé pour tenter d’expliquer plusieurs de ces observations. Selon la littérature, les produits fabriqués avec la méthode des couches leuco-plaquettaires seraient moins risqués pour le patient [1]. Mon projet consistait à mettre au point un modèle de transfusion in vitro permettant d’étudier les propriétés inflammatoires des culots globulaires fabriqués avec deux méthodes de transformation, soit la méthode des couches leuco-plaquettaires et le procédé de centrifugation à froid du sang total. Pour ce faire, différentes technologies ont été utilisées pour la transformation du sang à l’aide d’appareils automatisés, la cytométrie en flux pour l’analyse des populations cellulaires et le dosage des cytokines par ELISA.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

L'acide lysophosphatidique (LPA) est un lipide bioactif qui est formé dans le sang par l'autotaxine. Le LPA est un médiateur important du système vasculaire, notamment par sa modulation de l'immunité et de l'inflammation. Plusieurs espèces moléculaires de LPA existent en fonction de leur acide gras. Les espèces moléculaires de LPA ont des affinités différentes pour les récepteurs aux LPA. Il en résulte que les espèces moléculaires de LPA peuvent avoir des effets différents, même si elles ciblent une même cellule. Parmi ses nombreux effets, le LPA induit l'activation des plaquettes et est le seul activateur endogène connu des globules rouges (GR). L'activation des plaquettes et des GR induit la libération de vésicules extracellulaires (EV). Les EV de plaquettes (PEV) et les EV de GR (REV) ont des effets pro-inflammatoires et sont des acteurs importants de la coagulation. Le LPA est connu pour promouvoir la pathophysiologie de la polyarthrite rhumatoïde (PAR), une maladie rhumatismale auto-immune systémique (MRAS). Les patients touchés par les MRAS comme la PAR ou le lupus érythémateux disséminé (LED) présentent une inflammation vasculaire importante et sont plus à même de développer des maladies cardiovasculaires comme l'athérosclérose. Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez ces patients. Le LPA et les EV promeuvent tous deux l'inflammation vasculaire et le développement de maladies cardiovasculaires. Ils sont également impliqués dans la coagulation. L'hypothèse à l'origine des travaux de cette thèse est que le LPA via l'activation des GR peut promouvoir l'inflammation vasculaire et participer aux dommages vasculaires associés aux MRAS comme l'athérosclérose et la thrombose. Dans cette thèse, nous avons d'abord étudié l'action des principales espèces moléculaires de LPA trouvées dans le plasma sur les GR. Par des approches de cytométrie en flux à haute sensibilité, nous avons montré que certaines espèces moléculaires de LPA induisent l'exposition de la phosphatidylsérine (PS) par les GR et la libération de REV PS⁻ et PS⁺ similaire à celles trouvées dans le plasma de patients LED. Cependant, d'autres espèces moléculaires de LPA inhibent l'activation des GR. J'ai établi les principales voies de signalisation impliquées dans l'activation et l'inhibition des GR. De plus, nous avons mis en évidence que, même si elle est possible dans le plasma, l'activation des GR par le LPA dépend de son environnement. Notre deuxième focus était centré les potentielles associations entre l'autotaxine et les EV avec le risque de thrombose et le développement de l'athérosclérose chez des patients LED. Nous avons montré que l'autotaxine n'était pas augmentée ni associée avec l'activité de la maladie chez les patients LED. Et bien que les patients LED présentaient des quantités très importantes de PEV et de REV, elles n'étaient pas associées avec l'activité de la maladie. Cependant, les quantités de REV PS⁺ sont associées avec un risque plus élevé de thrombose chez les patients SLE. De plus, le groupe de patients avec des quantités élevées de REV PS⁺ présentait également des concentration d'autotaxine plasmatique plus élevées. Le travail présenté dans cette thèse approfondit la compréhension de l'effet du LPA sur l'activation des GR et leur libération de REV. Il met également en évidence l'implication potentielle du LPA et des REV dans les thromboses associées aux patients MRAS. / The lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid which is formed by autotaxin in blood. LPA is an important mediator in the vascular system mainly through its modulation of immunity and inflammation. Several LPA species exist depending on the fatty acid. LPA species varies in their affinity for the LPA receptors, which means that LPA species may have different effects, even if they target a same cell. Among its numerous biological actions, LPA induces platelet activation and is the only known endogenous activator of red blood cells (RBCs). Both platelet and RBC activation lead to the liberation of extracellular vesicles (EVs). Platelet EVs (PEVs) and RBC EVs (REVs) are the two main populations of EVs found in blood. Both PEVs and REVs have been described as pro-inflammatory mediators and are important actors of the coagulation. LPA is a known promoter of the pathophysiology of rheumatoid arthritis (RA), a systemic autoimmune rheumatic disease (SARD). Patients affected by SARDs such as RA and systemic lupus erythematosus (SLE) present high vascular inflammation and are more prone to develop cardiovascular diseases for instance atherosclerosis. Cardiovascular diseases are the first cause of mortality for these patients. LPA and EVs are two mediators which promotes vascular inflammation and the development of cardiovascular diseases. Also, both are pro-coagulant factors. The hypothesis driving this thesis is that LPA through the activation of RBCs promotes vascular inflammation and participate to the vascular damages associated with MRAS patients such as atherosclerosis and thrombosis. In this thesis, we first focused our interest to study the action of major blood LPA species on RBCs. Through high sensitivity flow cytometry, we found that some LPA species induces the exposition of phosphatidylserine (PS) by RBCs and the liberation of PS⁻ and PS⁺ REVs similar to those found in the plasma of LED patients. However, other species were inhibitors of RBC activation. We have established the main LPA's signaling pathways involved in the activation and inhibition as well that even if it is possible in the plasma, RBC activation by LPA is affected by the environment. Our second focus was on the potential associations of autotaxin and EVs with thrombotic risk and the development of atherosclerosis in SLE patients. We found that autotaxin were not elevated in SLE patients nor associated with the disease activity. Even though, SLE patients presented high quantities of PEVs and REVs, they were not associated with the disease activity. However, we showed that the quantities of PS⁺ REVs were associated with a higher risk of thrombosis in SLE patients. Moreover, the group of patients with high quantities of PS⁺ REVs also presented higher quantities of plasmatic autotaxin. The work presented in this thesis brings a better understanding of LPA impact on RBC activation and REV liberation. It also highlights the potential implication of both LPA and REVs in thrombosis associated with SARD patients.

Introduction: L'anémie est une condition médicale fréquemment observée chez les patients admis à l’unité des soins intensifs (USI) suivant un traumatisme craniocérébral (TCC) et justifie souvent le recours à des transfusions de culots globulaires. Une période prolongée d’entreposage des culots globulaires pourrait entrainer des lésions d’entreposage. Considérant la sensibilité du cerveau à l'hypoxémie, les victimes de TCC représentent une population plus vulnérable aux conséquences des lésions d'entreposage. Méthodologie: Nous avons effectué une analyse ‘nichée’ prévue à priori, d’un sous-groupe de patients victimes de TCC ayant participé à l’étude ABLE. L'objectif principal consistait à évaluer si l’administration de culots globulaires les plus frais possibles entraine un meilleur pronostic neurologique à 6 mois lorsque comparé à l'administration de culots standards chez des adultes admis à l'USI suivant un TCC, mesuré à l'aide du Extended Glasgow Outcome Scale. Résultats: Les caractéristiques démographiques des patients étaient comparables entre les deux groupes. Dans le groupe ayant reçu des culots globulaires frais, 73,1% des patients présentaient une issue neurologique défavorable (GOSe ≤ 4) comparé à 64,5% dans le groupe standard (P = 0,21). Nous n’avons observé aucun effet de la transfusion de culots globulaires frais sur le pronostic neurologique (OR 1,34 [0,72-2,50]; P = 0,35). Nous avons cependant observé une probabilité moindre d’issue neurologique défavorable à 3 mois chez les patients ayant un bon pronostic initial (OR 0,33 [0,11-0,96]; P = 0,04), et une probabilité accrue chez les patients avec un pronostic initial intermédiaire (OR 5,88 [1,66-20,81];P = 0,006) ou mauvais (OR 1,67 [0,53-5,30]; P = 0,38). Conclusion: Nos résultats suggèrent que la transfusion de culots globulaires frais n'est pas associée à l'amélioration à 6 mois du pronostic neurologique chez les patients atteints de TCC. Cependant, nous ne pouvons exclure un effet différentiel selon le pronostic initial du patient. / Introduction: Anemia is frequent in critically ill patients with traumatic brain (TBI), often leading to red blood cells (RBC) transfusions. RBC prolonged storage may cause a decreased ability to carry oxygen. Considering the susceptibility of the brain to hypoxemia, the age of RBC transfused to TBI patients may have an impact on outcomes. Methods: We conducted an a priori planned analysis of the TBI patients enrolled (n=217) in the ABLE study, a large multicenter RCT comparing the use of fresh blood to the use of standard issued blood in critically ill patients on mechanical ventilation. Our primary outcome measure was the Glasgow Outcome Scale extended (GOSe); secondary outcomes were ICU, hospital and 6-month mortality. Results: Patient characteristics were comparable between groups. In the fresh group, 73.1% of the patients had an unfavourable neurological outcome (GOSe ≤ 4) as compared to 64.5% in the standard group (P = 0.21). We observed no overall effect of fresh red blood cells on neurologic outcome (OR 1.34 [0.72-2.50]; P = 0.35) but observed differences across prognostic bands with a decreased odds of unfavourable outcome in patients with the best prognosis at baseline (OR 0.33 [0.11-0.96] P = 0.04) but an increased odds in those with intermediate and worst baseline prognosis (OR 5.88 [1.66-20.81]; P = 0.006 and 1.67[0.53-5.30] P = 0.38), respectively. Conclusion: Overall, transfusion of fresh red blood cells was not associated with a better neurological outcome at 6 months. However, we cannot exclude a differential effect according to the patient baseline prognosis.

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Sur l’île de La Réunion, la prévalence du diabète de type 2 est 3,5 fois plus élevée que celle de la France hexagonale. Parmi les diverses complications qu’engendre le diabète, les AVC qui en résultent sont responsables d’une forte mortalité faisant des maladies cardiovasculaires un problème de santé publique majeur sur l’île. Les AVC ischémiques proviennent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus généré localement ou qui s’est détaché d’une plaque d’athérothrombose généralement localisée au niveau des bifurcations carotidiennes. Les plaques compliquées sont souvent caractérisées par des hémorragies intraplaques, responsables de l’extravasation des cellules sanguines. Différents marqueurs moléculaires, protéiques et physiques peuvent refléter ces processus et renseigner le médecin sur l’instabilité de la plaque du patient. Il est donc important d’étudier ces marqueurs de risque de rupture de plaques carotidiennes chez les patients diabétiques, afin d’en prévenir les complications et la mortalité associée. L’hémorragie intraplaque, notamment pourvoyeuse d’érythrocytes et de neutrophiles libérant leurs contenus cytoplasmiques, participe activement à la déstabilisation de la plaque d’athérothrombose chez le diabétique. Cette thèse a permis l’étude de l’influence de ces marqueurs à travers une étude clinique et de proposer un nouveau concept de phagocytose des érythrocytes glyqués par les cellules endothéliales in vitro. Ainsi, les résultats préliminaires de l’étude clinique nous permettent de supposer que la clairance des globules rouges des patients diabétiques est altérée, ce qui leurs permettraient de résider sur une période plus longue dans les plaques de ces patients. De cette manière, les globules rouges pourraient y être pris en charge par d’autres types cellulaires comme les cellules endothéliales. Nous avons tout d’abord mis au point un modèle de glycation des érythrocytes in vitro reflétant un diabète mal équilibré. Nous avons ensuite mis en évidence que les globules rouges glyqués pouvaient être phagocytés par les cellules endothéliales humaines, conduisant à une prolifération limitée et à la surexpression de l’HO-1. Ces données suggèrent qu’une ingestion des érythrocytes glyqués par les cellules endothéliales pourrait amplifier la déstabilisation des plaques d’athérothrombose carotidiennes des diabétiques. / Type 2 diabetes prevalence in Reunion Island, a French overseas department, is 3.5 higher than in France mainland. Among the various diseases caused by diabetes, stroke induces high mortality making cardiovascular diseases a major public health problem on the island. Ischemic stroke results from a cerebral artery occlusion by a thrombus that is locally produced or has detached from an atherothrombotic plaque usually located at the carotid bifurcations. Complicated plaques can are often characterized by intraplaque hemorrhages, responsible for blood cell extravasation. Several molecular and physical markers can reflect these processes and inform the physician about the instability of the patient's plaque. It is therefore of major importance to study the markers of carotid plaque rupture in diabetic patients in order to prevent complications and associated mortality. Intraplaque hemorrhage, providing erythrocytes and neutrophils releasing their cytoplasmic contents, plays an active role in destabilizing atherothrombotic plaque in diabetic subjects. The objectives of the present thesis were to study these markers in a clinical study and to suggest a new concept of red blood cell phagocytosis by endothelial cells in vitro. According to the first results of the clinical study, we can suggest that in diabetic patients, the clearance of red blood cells is impaired. This prolonged residence of red blood cells in atherosclerotic plaques from diabetic patients. In this way, red blood cells could be phagocytosed by othercell types such as endothelial cells. In this work, we have also set up an in vitro model of erythrocyte glycation that reflects a clinical situation of poorly controlled diabetes. We have demonstrated that glycated red blood cell phagocytosed by human endothelial cells, leading to their limited proliferation and to HO-1 overexpression. These data suggest an ingestion of glycated erythrocytes by endothelial cells may amplify the destabilization of carotid atherothrombotic plaques in diabetics.