Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει οργανισμούς σχετικά στενόοικους οι οποίοι ζουν είτε στην παρόχθια βλάστηση ρεμάτων και ποταμών είτε σε υγρά δάση. Στη χώρα μας έχουν καταγραφεί 8 από τα 50 είδη του γένους, 4 από τα οποία είναι ενδημικά της Ελλάδας. Το ένα από αυτά εξαπλώνεται από την Κρήτη μέχρι την Ήπειρο, ένα στα νησιά του κεντρικού Αιγαίου, ένα στην Κρήτη και ένα στο νότιο Ευβοϊκό. Η κατανομή κάθε είδους είναι ασυνεχής, είτε λόγω γεωγραφικών (νησιωτικοί πληθυσμοί κλπ) είτε λόγω ενδιαιτηματικών παραγόντων. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού μορφολογικών χαρακτήρων και δεν είναι βέβαιο ότι αντανακλά τις πραγματικές φυλογενετικές σχέσεις τους. Από τα αποτελέσματα προηγούμενης μελέτης διαπιστώθηκε έντονη απόκλιση μεταξύ των προτύπων της γενετικής ποικιλότητας και εκείνης της τρέχουσας ταξινόμησης σε ορισμένες ομάδες πληθυσμών του γένους αυτού. Επιπλέον, φάνηκε σημαντικός βαθμός γενετικής απομόνωσης μεταξύ των πληθυσμών ενός είδους, ενισχύοντας την άποψη περί ισχυρής μεταπληθυσμιακής συγκρότησής τους. Στην παρούσα μελέτη, συλλέχθηκαν 47 πληθυσμοί στην ηπειρωτική Ελλάδα, οι οποίοι στη μεγάλη τους πλειοψηφία ανήκαν στο είδος Trachelipus kytherensis (σύμφωνα με την ισχύουσα ταξινόμηση). Σε αυτούς προστέθηκαν και τα δεδομένα των Parmakelis et al 2008 (16 πληθυσμοί) έτσι ώστε να είναι πιο ολοκληρωμένη η μελέτη και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το γένος Trachelipus. Συνολικά μελετήθηκαν γενετικά 63 πληθυσμοί του γένους, χρησιμοποιώντας ως μοριακούς δείκτες τα μιτοχονδριακά γονίδια 16S rRNA και COI. Έπειτα από απομόνωση του DNA και τον πολλαπλασιασμό των συγκεκριμένων τμημάτων με PCR προσδιορίστηκε η αλληλουχία των βάσεων, και υπολογίστηκε η γενετική διαφοροποίηση εντός και μεταξύ των πληθυσμών. Για την ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών ή/και των ειδών χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι της Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor Joining-NJ), της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony-MP) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference-BI). Το τελικό μήκος των αλληλουχιών μετά την επεξεργασία ήταν 386 θέσεις για το γενετικό τόπο 16S rRNA και 512 θέσεις για το γενετικό τόπο COI. Με τα δεδομένα αυτά δεδομένα πραγματοποιήθηκε τόσο ανεξάρτητη όσο και συνδυασμένη ανάλυση. Από τα αποτελέσματα φαίνονται πληθυσμοί οι οποίοι παρα το ότι είναι πολύ κοντινοί γεωγραφικά, και μέχρι σήμερα θεωρείται πως ανήκουν στο ίδιο είδος (Trachelipus kytherensis), εμφανίζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους και ομαδοποιούνται σε διαφορετικούς και αρκετά απομακρυσμένους κλάδους των δένδρων σε όλες τις αναλύσεις (NJ, MP, BI). Η τοπολογία των κλάδων, καθώς και η απουσία σαφούς γεωγραφικού προτύπου στην ομαδοποίηση των πληθυσμών του T. kytherensis, καταδεικνύει ότι πιθανότατα δεν έχουμε να κάνουμε με ένα μόνο είδος, αλλά με περισσότερα που είναι δύσκολο να διακριθούν μορφολογικά, τουλάχιστον με τους μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενους ταξινομικούς διαγνωστικούς χαρακτήρες. Αυτό ενισχύεται και από τις γενετικές αποστάσεις που καταγράφηκαν στην παρούσα μελέτη και εμφανίζονται ιδιαίτερα αυξημένες (μέγιστες παρατηρηθείσες γενετικές απόστασεις: 27,3% COI, 17,6% 16S rRNA) ακόμα και σε σχέση με αυτές που έχουν αναφερθεί σε άλλες έρευνες για τη διάκριση ειδών ισοπόδων. Επισημαίνεται η ιδιαίτερα μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των αντιπροσώπων του γένους. Επιπλέον καταδεικνύεται πως η Πελοπόννησος φιλοξενεί τα είδη Trachelipus ‘kytherensis’ και T. aegaeus (τουλάχιστον στη χερσόνησο της Αργολίδας) αλλά και πιθανόν μια τρίτη μορφή στα βόρεια (νέο είδος;) η οποία εμφανίζεται ευρύτερα στην ηπειρωτική Ελλάδα. Θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον λοιπόν να μελετηθούν αυτές οι πιθανές «ζώνες επαφής» ως προς τη γονιδιακή τους ροή, ώστε να εκτιμηθεί το ποσοστό απομόνωσης των πληθυσμών και, κατ’ επέκταση, του κάθε είδους. / The phylogenetic relationships among terrestrial isopod species are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country. The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. Species–level taxonomy has been based on a few morphological characters, mainly the secondary sexual characters of males, exhibiting significant variation, and is controversial. Very high intraspecific genetic divergence among several populations has been documented. In this study we attempt a phylogeographic analysis among the Greek endemic species of the genus. We sampled 47 populations from several sites in mainland Greece. In our analyses we incorporated data from previous work (16 populations) in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in the systematics of the species. Overall, 63 populations were considered. After total DNA extraction, we sequenced the two PCR amplified mtDNA gene fragments, namely 16S rRNA and cytochrome oxidase subunit I (COI), and calculated the genetic divergence within and among the populations studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction used were Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference (BI) for each mtDNA sequence data and the concatenated dataset. The phylogenetic trees obtained from the molecular data – from all three phylogenetic methods (NJ, MP, BI) - produced trees with quite congruent topologies. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The highly-structured phylogenetic tree and the lack of an overall geographic pattern in the clustering of Trachelipus populations indicates that very probably we are not dealing with a single species, but rather with a number of cryptic species, hardly distinguished by means of currently used morphological characters. This is further corroborated by the genetic distances separating the clades hosting nominal T. kytherensis populations (max_dCOI=27.3% and max_d16S rRNA=17.6%). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. Furthermore, it is evident than there are two species present in the Peloponnese, i.e. Trachelipus ‘kytherensis’ and T. aegaeus (in Argolis peninsula). In northern Peloponnese, a third form is also present (new species?) that occurs throughout the central and northern part of mainland Greece. These ‘contact zones’ should be further investigated in terms of genetic flow and isolation of the populations and/or species. Both the phylogeny presented here and the genetic distances separating populations appear to justify the necessity of further investigation into the phylogeny of the Greek Trachelipus species using a population by population approach. It is likely that morphology inadequately describes real variation inside and among species; hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of more extensive molecular phylogenetic analyses.

Το βακτήριο Wolbachia είναι ένα ενδοκυττάριο και μητρικά κληρονομούμενο συμβιωτικό βακτήριο. Ανήκει στην ομοταξία των Alphaproteobacteria και την τάξη των Rickettsiales. Αποτελεί ίσως τον πιο διαδεδομένο ενδοκυττάριο συμβιωτικό οργανισμό στον πλανήτη, καθώς έχει εντοπιστεί μέχρι στιγμής σε πληθώρα αρθροπόδων και νηματωδών της φιλαρίασης. Πρόσφατες μελέτες εκτιμούν ότι πάνω από το 40% των ειδών αρθροπόδων είναι μολυσμένα με το βακτήριο Wolbachia. Το συμβιωτικό αυτό βακτήριο επηρεάζει τις βιολογικές λειτουργίες και ιδιότητες των ξενιστών του και είναι υπεύθυνο για μια σειρά αναπαραγωγικών ανωμαλιών, όπως η κυτταροπλασματική ασυμβατότητα, η παρθενογένεση, η θανάτωση των αρσενικών εμβρύων και η θηλυκοποίηση. Τα μοναδικά αυτά βιολογικά χαρακτηριστικά του βακτηρίου Wolbachia προσελκύουν όλο και περισσότερο το ενδιαφέρον διαφόρων ερευνητών τόσο για το ρόλο του βακτηρίου σε εξελικτικές διαδικασίες (κυρίως ειδογένεση) όσο και για τη χρησιμοποίησή του σε περιβαλλοντικά φιλικές εφαρμογές καταπολέμησης οργανισμών που είναι επιβλαβείς στους τομείς του γεωργικού και δασικού περιβάλλοντος, και της υγείας. Τα είδη του γένους Glossina (Diptera: Glossinidae), γνωστά και ως μύγες τσε-τσε, αποτελούν ξενιστές του βακτηρίου Wolbachia. Η μύγα τσε-τσε είναι ο σημαντικότερος φορέας των παθογόνων τρυπανοσωμάτων στην τροπική Αφρική, τα οποία προκαλούν την ασθένεια του ύπνου (sleeping sickness) στον άνθρωπο και την αντίστοιχη τρυπανοσωμίαση, γνωστή ως nagana, στα ζώα. Η χρησιμοποίηση του βακτηρίου Wolbachia σε μεθόδους βιολογικής καταπολέμησης της μύγας τσε-τσε προαπαιτεί την πλήρη γνώση της γενετικής του ταυτότητας και των αλληλεπιδράσεων του με το ξενιστή. Προς την κατεύθυνση αυτή, και στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia σε περισσότερα από 5300 άτομα από φυσικούς και εργαστηριακούς πληθυσμούς 11 διαφορετικών ειδών μύγας τσε-τσε από 13 Αφρικανικές χώρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν τεράστια απόκλιση της παρουσίας του βακτηρίου τόσο μεταξύ ειδών όσο και μεταξύ πληθυσμών του ίδιου είδους. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ο γενετικός χαρακτηρισμός των στελεχών Wolbachia από συνολικά 29 αντιπροσωπευτικά δείγματα διαφόρων πληθυσμών και ειδών μύγας τσε-τσε, ενώ σε αρκετά από αυτά παρατηρήθηκαν πολλαπλά στελέχη του βακτηρίου. Διαπιστώθηκε εντυπωσιακή γενετική ποικιλότητα στελεχών Wolbachia που απαντούν στα διάφορα είδη μύγας τσε-τσε καθώς και ασυμφωνία μεταξύ των φυλογενειών των στελεχών Wolbachia και των μυγών τσε-τσε ξενιστών της, γεγονός που σημαίνει οριζόντια μετακίνηση του συμβιωτικού βακτηρίου κατά την εξέλιξη. Επιπρόσθετα, εντοπίστηκαν για πρώτη φορά εκτεταμένα γεγονότα οριζόντιας μεταφοράς βακτηριακών γονιδίων στο γονιδίωμα τριών ειδών μύγας τσε-τσε: στο Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. Από εξελικτικής σκοπιάς, κρίσιμα ερωτήματα προκύπτουν από τα παραπάνω ευρήματα, και πιο συγκεκριμένα σχετικά με: την προέλευση-μηχανισμό αυτών των γεγονότων οριζόντιας μεταφοράς, τον χρονικό προσδιορισμό τους, τον πιθανό ρόλο τους σε διαδικασίες ειδογένεσης και την επιλεκτική εμφάνισή τους σε ορισμένα μόνο είδη Glossina π.χ. στo υποείδos Glossina morsitans centralis που είναι πολύ συγγενικό του Glossina morsitans morsitans δεν παρατηρήθηκε το φαινόμενο. Εξίσου σημαντική και επιβεβλημένη κρίνεται η διεξοδική διερεύνηση του ενδεχομένου τα βακτηριακά γονίδια που ενσωματώθηκαν στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα της μύγας τσε-τσε να ευθύνονται για την έκφραση νέων λειτουργιών-ιδιοτήτων (ή να μεταβάλλουν τις ήδη υπάρχουσες), ιδίως μάλιστα εάν αυτές συνδέονται με την αποδοτικότητα μετάδοσης της νόσου της τρυπανοσωμίασης μέσω του φορέα της, δηλαδή της μύγας τσε-τσε. Τέλος, διαπιστώθηκε πιθανή αρνητική συσχέτιση της παρουσίας του βακτηρίου Wolbachia με τον παθογόνο ιό Salivary Gland hypertrophy Virus (SGHV), γεγονός που συζητείται στα πλαίσια βιολογικών εφαρμογών καταπολέμησης του εντόμου-φορέα και της τρυπανοσωμίασης. Παράλληλα, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η προοπτική χρησιμοποίησης του βακτηρίου Wolbachia για τη βιολογική καταπολέμηση εντόμων αγροτικής ή /και περιβαλλοντικής σημασίας, όπως είναι οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. Το γεγονός αυτό προϋποθέτει την ανίχνευση και τη γενετική ταυτοποίηση του βακτηρίου σε φυσικούς πληθυσμούς εντόμων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε ανίχνευση και χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia σε 78 συνολικά άτομα από 22 είδη αφίδων, από 26 φυσικούς πληθυσμούς από την Ελλάδα. Από αυτούς τους 26 πληθυσμούς, μόλις οι 4 βρέθηκαν να είναι μολυσμένοι με το βακτήριο Wolbachia και συγκεκριμένα πληθυσμοί των ειδών: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν για πρώτη φορά ότι η παρουσία του βακτηρίου Wolbachia στις αφίδες είναι πιθανά πιο διαδεδομένη από ότι προέκυπτε από προηγούμενες μελέτες. Επίσης, μελετήθηκε η ανίχνευση και ο χαρακτηρισμός του βακτηρίου Wolbachia στα είδη Cydia splendana, Cydia fagiglandana και Pammene fasciana. Το βακτήριο Wolbachia ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στα συγκεκριμένα είδη και μάλιστα διαπιστώθηκε ότι η συχνότητα εμφάνισής του ποικίλει τόσο μεταξύ των δύο ειδών Cydia όσο και μεταξύ των πληθυσμών του κάθε είδους. Στο είδος Pammene fasciana, το βακτήριο ανιχνεύθηκε σε όλα τα άτομα που μελετήθηκαν. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής συζητούνται από τη σκοπιά τόσο της οικολογικής και εξελικτικής σημασίας τους όσο και της προοπτικής χρησιμοποίησης του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia για τον πληθυσμιακό έλεγχο επιβλαβών εντόμων όπως οι μύγες τσε-τσε, οι αφίδες και η καρπόκαψα καστανιάς. / Wolbachia is an intracellular and maternally inherited symbiotic bacterium that belongs to the class of Alphaproteobacteria and the order of Rickettsiales. It is the most ubiquitous intracellular symbiotic organism of the planet, since it has been estimated that over 40% of insect species, in addition to filarial nematodes, crustaceans, and arachnids are infected with Wolbachia. In arthropods Wolbachia affects the biological functions and properties of its hosts and it is responsible for a number of reproductive abnormalities, such as cytoplasmic incompatibility (CI), thelytokous parthenogenesis, feminization of genetic males and male killing. These unique biological characteristics of Wolbachia are attracting the interest of various researchers for: (a) decyphering the role of Wolbachia in evolutionary processes (mainly speciation), and (b) for its use in environmentally friendly applications for the control of agricultural pests and disease vectors. The species of genus Glossina (Diptera: Glossinidae) known as tsetse flies, have been found to be infected with Wolbachia. Tsetse flies are the sole vectors of pathogenic trypanosomes in tropical Africa, causing the “sleeping sickness” in humans and the “nagana” in animals. The potential use of Wolbachia for the control of tsetse flies, prerequisite a thorough knowledge of its genetic identity and the interactions with the host. To further characterize the prevalence of Wolbachia in tsetse flies an extensive screen of more than 5300 specimens from natural and laboratory populations of 11 different Glossina species originating from 13 African countries was carried out. Our results indicated a huge divergence in the prevalence of Wolbachia, both among the species and among populations of the same species. Further characterization by MLST and wsp genotyping was carried out for the Wolbachia strains of 29 representative populations and species of tsetse flies. An impressive genetic diversity of Wolbachia strains in tsetse flies was revealed. Interestingly, disconcordance between the phylogeny of Wolbachia and that of the tsetse flies was observed, suggesting horizontal transmission of Wolbachia during the evolution. Moreover, extended horizontal gene transfer events were detected for first time in Glossina morsitans morsitans, Glossina pallidipes και Glossina austeni. These results raise critical questions concerning: (a) the origin/mechanism of these horizontal gene transfer events, (b) their temporal determination, (c) their potential role as agents of speciation and (d) their selective appearance in only some Glossina species e.g in the subspecies Glossina morsitans centralis which is closely related with Glossina morsitans morsitans the phenomenon was not observed. Equally important will be to examine if genes from the chromosomal insertions were potentially expressed and examine if these genes are associated with the vectorial capacity of tsetse flies for the trypanosoma transmission. Finally, a negative correlation between the presence of Wolbachia with the Salivary Gland Hypertrophy Virus (SGHV) was identified. This is further discussed in the context of biological applications for control of tsetse fly-vector and trypanosomiasis. Finally in this thesis, the detection and characterization of Wolbachia in 78 specimens of 22 aphids species, from 26 natural populations, from Greece was examined. Only 4 out of 26 populations were found to be infected with Wolbachia, and specifically the species: Aphis fabae, Aphis hederae, Metopolophium dirhodum και Baizongia pistaciae. These results indicated that the presence of Wolbachia in aphids is probably more prevalent than it was derived from previous studies. Also, detection and characterization of Wolbachia in the Cydia splendana, Cydia fagiglandana and Pammene fasciana was carried out. Wolbachia was detected for first time in these species, and it was found that the prevalence of Wolbachia varies between the two species of Cydia and among populations of each species, with the infection in Pammene fasciana being fixed. At the end the ecological and evolutionary importance of Wolbachia, together with the use of the bacterium for the population control of harmful insects like tsetse flies, aphids and moths is further discussed.