Η Heparin affin regulatory peptide (HARP) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa, που έχει μεγάλη συγγένεια με την ηπαρίνη. Είναι συντηρημένη μεταξύ διαφόρων ειδών και παρουσιάζει 50% ομολογία με τη Midkine και την RI-HBP. Οι πρωτεΐνες αυτές συγκροτούν μια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον εγκέφαλο νεογέννητου βοός ως ένα μόριο που μπορεί να επάγει την προέκταση των νευρικών κυττάρων. Επίσης, εκφράζεται στη μήτρα, στους χόνδρους και στα οστά. Αρκετές αναφορές αποδεικνύουν ότι υπάρχει μεγάλη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της HARP και της ανάπτυξης καρκινικού όγκου και της αγγειογένεσης. Υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς καρκινικούς όγκους, αλλά και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους τύπους καρκίνου σε ανθρώπους. Η HARP αποτελεί μιτογόνο παράγοντα για διάφορους τύπους ενδοθηλιακών κυττάρων, ενώ μπορεί να επάγει την αγγειογένεση in vivo και in vitro. Ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας του κυττάρου, όπως η N-συνδεκάνη, ή μετά από δέσμευση σε πιο ειδικούς υποδοχείς. Η RPTPβ/ζ, η εκκρινόμενη μορφή της (φωσφακάνη), αλλά και η κινάση ALK, έχει αναφερθεί ότι μπορούν να δεσμεύουν τη HARP και να συμμετέχουν στη μεταγωγή του σήματός της. Παλαιότερες αναφορές έχουν δείξει ότι η HARP μπορεί να επάγει τις MAP-κινάσες και το μονοπάτι PI3K-Akt, ενώ αναστολείς των Erk½, ή της PI3K καταστέλλουν τη σύνθεση του DNA που επάγεται από τη HARP. Επιπλέον, η Shc και οι Erk ½ φωσφορυλιώνονται μετά από επώαση κυττάρων με HARP. Ωστόσο, τα ενδοκυτταρικά σήματα ειδικών υποδοχέων της HARP προς την PI3K ή τις MAPK δεν έχουν ακόμα χαρακτηριστεί ικανοποιητικά. Στην εργασία αυτή μελετήσαμε την επίδραση της HARP στη μετανάστευση κυττάρων HUVEC, στη δημιουργία αυλών σε υπόστρωμα matrigel, καθώς και το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από τη HARP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η HARP επάγει τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC μετά από δέσμευσή της στην RPTPβ/ζ. Η δέσμευση αυτή οδηγεί σε ενεργοποίηση της Src, της FAK, της PI3K και των Erk ½. Το ορθοβαναδικό νάτριο, η θειική χονδροϊτίνη-C, το ΡΡ1, η wortmannin, το LY294002 και το U0126 αναστέλλουν τη μεταγωγή σήματος της HARP, καθώς και την επαγωγή της μετανάστευσης και διαφοροποίησης των HUVEC. Επιπλέον, η μείωση της έκφρασης της RPTPβ/ζ με τη χρησιμοποίηση παρεμβαλλόμενου RNA παρεμποδίζει τα ενδοκυτταρικά σήματα, καθώς και την επαγωγή της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης που επάγεται από τη HARP. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η RPTPβ/ζ αποτελεί υποδοχέα της HARP σε ενδοθηλιακά κύτταρα και αποσαφηνίζουν το μονοπάτι μεταγωγής σήματος της HARP στα κύτταρα αυτά. / Heparin affin regulatory peptide (HARP) is an 18 kDa growth factor that has a high affinity for heparin. HARP is highly conserved among species and shares 50% homology with Midkine and RI-HBP. The above proteins constitute a relatively new family of growth factors with high affinity for heparin. HARP has been originally purified from perinatal rat brain as a molecule that induces neurite outgrowth. HARP is also expressed in uterus, cartilage and bone extracts. Several reports have established a strong correlation between HARP expression and tumour growth and angiogenesis. High levels of this protein were found in many human cancers and cell lines derived from human tumours. HARP has been reported to be mitogenic for different types of endothelial cells and angiogenic in vivo and in vitro. HARP exerts its biological activity through interactions with cell surface proteoglycans, such as N-syndecan, or binding to more specific cell surface receptors. Receptor-type protein tyrosine-phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and its secreted variant phosphacan, as well as ALK, have been recently reported to bind HARP and to be implicated in its signalling.HARP has been previously shown to activate both the MAPK and PI3K - Akt signalling axes. Inhibitors of Erk½ or PI3K inhibit DNA synthesis stimulated by HARP. Additionally, analysis of tyrosine phosphorylated proteins following HARP stimulation, revealed induction of Shc and Erk ½ phosphorylation. Nevertheless, the signals from specific receptors to PI3K or MAPK are not well documented. In the present work, we examined the effect of HARP on migration and tube formation on matrigel of HUVEC and investigated the signalling pathway induced by HARP. We report that HARP induces migration and differentiation of endothelial cells through binding to RPTPβ/ζ, leading to activation of Src, FAK, PI3K and Erk½. Sodium orthovanadate, chondroitin sulfate-C, PP1, wortmannin, LY294002 and U0126 inhibit HARP-mediated signalling and HARP-induced HUVEC migration and differentiation. In addition, RPTPβ/ζ suppression using siRNA technology, interrupts intracellular signals, as well as HUVEC migration and differentiation that are induced by HARP. These results establish the role of RPTPβ/ζ as a receptor of HARP in HUVEC and elucidate the HARP signalling pathway in endothelial cells.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), γνωστή και ως πλειοτροπίνη, είναι ένας αυξητικός παράγοντας που η έκφρασή του στα ενήλικα άτομα είναι περιορισμένη σε συγκεκριμένους ιστούς. Ωστόσο, έκφραση ή υπερέκφρασή της έχει παρατηρηθεί in vivo σε διάφορους όγκους και στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και in vitro σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Παρόλο που οι in vivo βιολογικές δράσεις της HARP είναι αδιαμφισβήτητες, δεν έχει διασαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο ασκεί τις δράσεις αυτές. Επίσης, υπάρχουν πολλά αντικρουόμενα αποτελέσματα αναφορικά με τις in vitro βιολογικές της δράσεις. Στη συγκεκριμένη εργασία διερευνήθηκε το εάν η διαφορετική έκφραση των υποδοχέων της HARP, RPTPβ/ζ και ALK, είναι ένας άλλος λόγος για τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, δημιουργήσαμε DU145 και PC3 κύτταρα (κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη), τα οποία σταθερά έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ και του ALK. Τα DU145 κύτταρα εκφράζουν μόνο τον RPTPβ/ζ, σε αντίθεση με τα PC3 κύτταρα που εκφράζουν και τους δύο υποδοχείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει την επαγόμενη από HARP κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, ενώ ο ALK επάγει την επαγόμενη από HARP κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, η μελέτη της μεταγωγής σήματος αυτών των υποδοχέων έδειξε ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten/Akt και των Erk1/2, ενώ ο ALK επάγει την ενεργότητα της Akt και των Erk1/2. Επιπρόσθετα, η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ σχετίζεται με την επαγωγή EMT φαινοτύπου, αφού καταστέλλει την έκφραση της E-καντερίνης και επάγει την έκφραση της Ν-καντερίνης, των ιντεγκρινών-α5, -αv και β3, καθώς και της MMP9. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι οι αυξητικοί παράγοντες αποτελούν υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή βιολογικά ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις με το ολικό μόριο. Η πλασμίνη, η τρυψίνη και η MMP2, πέπτουν την HARP και παράγουν πεπτίδια που αναστέλλουν την επαγωγική της δράση. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες, το ενδιαφέρον για την ανακάλυψη πεπτιδίων με αντικαρκινική δράση εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της HARP, καθώς και στις δύο κεντρικές περιοχές που παρουσιάζουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες της θρομβοσπονδίνης-1. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο μηχανισμός δράσης του P(122-131) και οι βιολογικές δράσεις των P(13-39) και P(65-97). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P(122- 131) μετά την πρόσδεσή του στον RPTPβ/ζ, μειώνει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten και των Erk1/2 και καταστέλλει την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και LNCaP κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το P(122-131) καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες και μετά από τον ανταγωνισμό του με τη HARP για την πρόσδεση όχι μόνο στον ALK, αλλά και σε άλλους υποδοχείς. Τέλος, χρησιμοποιώντας το σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, παρατηρήσαμε ότι το P(122-131) καταστέλλει και την in vivo αγγειογένεση. Παρόμοια με το P(122-131), τα P(13-39) και P(65-97) καταστέλλουν την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και PC3 κυττάρων μετά την πρόσδεσή τους στον RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ο ρόλος των υποδοχέων RPTPβ/ζ και ALK στον μηχανισμό δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP και των πεπτιδίων του. Για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι η ανασυνδυασμένη HARP προκαρυωτικής προέλευσης είναι βιολογικά ενεργή και ότι η δράση της εξαρτάται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της HARP και των πεπτιδίων της. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor that is thought to be involved in carcinogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many types of tumors, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. However, contradictory results have been published concerning the in vitro activities of HARP. Here, we investigated whether the differential expression of HARP receptors, namely RPTPβ/ζ and ALK, is another reason for these controversies. Using the RNAi technology, we stably transformed prostate cancer cell lines DU145 and PC3 to knockdown RPTPβ/ζ or ALK expression. DU145 cells express only RPTPβ/ζ, while PC3 cells express both RPTPβ/ζ and ALK. Our results showed that RPTPβ/ζ inhibits HARP-mediated cellular adhesion and migration, while ALK induces HARP-mediated cellular migration. Investigation of the transduction mechanism revealed that RPTPβ/ζ inactivates Src, Fak, Pten/Akt, and Erk1/2, while ALK activates Akt and Erk1/2. In addition, RPTPβ/ζ knockdown promotes a shift in expression form E- to N-cadherin, and induces the expression of integrin-α5, -αv, -β3, and MMP9. Growth factors can be hydrolyzed by proteases, leading to the production of biological active peptides. Previous studies indicate that HARP is cleaved by enzymes in the extracellular environment, such as plasmin, trypsin, chymotrypsin, and MMP2. Moreover, the resulting peptides exert altered biological functions compared to the whole molecule. Here, we investigated the effect of (P122-131), corresponding to the basic cluster of the C-terminal region of HARP, as well as the effect of P(13-39) and P(65-97) derived from the TSR domains of HARP. Our results demonstrated that P(122-131) interacts with RPTPβ/ζ, inactivates its catalytic activity, and triggers a signal transduction pathway that inhibits DU145 and LNCaP adhesion and migration, while in parallel interferes with ALK or other pleiotrophin receptors inhibiting pleiotrophin-induced cellular adhesion and migration. In addition, P(122-131) inhibits angiogenesis in vivo, as determined by the chicken embryo CAM assay. Furthermore, P(13-39) and P(65-97) interacts with RPTPβ/ζ and inhibits DU145 and PC3 adhesion and migration. Taken together, the results of this study demonstrate the effect of RPTPβ/ζ and ALK on HARP and its peptides-mediated biological actions. Our results support the hypothesis that the overall effect of pleiotrophin depends on the expression profile of its receptors. Concluding, we show that bacterial pleiotrophin is biological active and part of the diversity of pleiotrophin biological actions is due to RPTPβ/ζ and /or ALK and the complex way of their interactions and signaling.