Η HARP είναι ένας αυξητικός παράγοντας με πλειοτροπική δράση που εμπλέκεται στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση πολλών ειδών κυττάρων καθώς και στην αγγειογένεση και την καρκινογένεση. Η HARP ασκεί τις δράσεις της μέσω των διαμεμβρανικών της υποδοχέων RPTPβ/ζ, ALK και Ν-συνδεκάνη. Η δομή της HARP αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές ομόλογες με τις επαναλαμβανόμενες περιοχές τύπου I της θρομβοσπονδίνης (Thrombospondin type I Repeat, TSR) και το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό της άκρο που έχουν τυχαία διαμόρφωση στο χώρο. Έχει βρεθεί ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα διάφορων πρωτεολυτικών ενζύμων και πεπτίδια της έχουν ανιχνευθεί στο υγρό θρεπτικό μέσο σε καλλιέργειες διαφόρων κυττάρων. Τα πεπτίδια της HARP μπορούν να έχουν διαφορετική ή και αντίθετη δράση από αυτή ολόκληρου του μορίου. Στo πλαίσιo της μελέτης των επιμέρους περιοχών της HARP που συμμετέχουν στις βιολογικές δράσεις της αλλά και της δράσης των πεπτιδίων που προκύπτουν από την πρωτεόλυσή της, σε αυτή την εργασία μελετήθηκε η δράση δύο ανασυνδυασμένων, τροποποιημένων μορφών της HARP που αντιστοιχούν στις κεντρικές TSR περιοχές, των H9-59 και H60-110, στον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC3 και στη φωσφορυλίωση των μορίων μεταγωγής σήματος ERK1/2. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια H9-59 και H60-110 καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3, ενώ επάγουν την προσκόλληση των ίδιων κυττάρων. Επιπλέον, τόσο το H9-59 όσο και το H60-110 επάγουν τη φωσφορυλίωση των ERK1/2. / HARP is a heparin-binding growth factor, which plays a key role in cell proliferation, differentiation and migration. HARP is also involved in angiogenesis and tumor growth and progression. HARP mediates its functions through its transmembrane receptors RPTPβ/ζ, ALK and N-syndecan. Structurally, HARP contains two TSR homologous domains and two basic clusters in its N and C-termini. It has been found that HARP is a substrate for several extracellular proteolytic enzymes and HARP peptides have been detected in conditioned media of cells. HARP peptides often have different or even opposite biological activity from the whole molecule. The aim of this project was to study the biological activity of two recombinant, truncated forms of HARP that correspond to the two TSR domains, H9-59 and H60-110, in order to contribute to the study of the HARP domains that mediate its biological activities and also the biological activity of HARP peptides. The results of the study show that both H9-59 and H60-110 inhibit the proliferation of PC3 cells but stimulate their adhesion. Moreover, both H9-59 and H60-110 stimulate the phosphorylation of ERK1/2.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα αποτελούν ετερογενή ομάδα νοσημάτων, με δυσμενή πρόγνωση και δυσκολία θεραπευτικής προσέγγισης. Η κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που διέπουν την παθολογική αιμοποίηση που παρατηρείται στα σύνδρομα αυτά in vitro και in vivo, μπορεί να βοηθήσει στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπισή τους. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη της αιμοποίησης των ΜΔΣ με τη μέθοδο των καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων μακράς διάρκειας και η επίδραση διαφόρων παραγόντων στην in vitro αιμοποίηση, με στόχο την αναγωγή των ευρημάτων και στην in vivo διαδικασία. Οι καλλιέργειες βραχείας διάρκειας ανέδειξαν την αδυναμία των προγονικών κυττάρων των ασθενών να δημιουργήσουν φυσιολογικές αποικίες. Η προσθήκη μίγματος αυξητικών παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό είχε θετική επίδραση στην πλειοψηφία των περιπτώσεων. Με μακράς διάρκειας καλλιέργειες συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα των ΜΔΣ με αυτά φυσιολογικών μαρτύρων και των υποκατηγοριών ΜΔΣ μεταξύ τους. Αξιολογήθηκαν η έκταση του στρώματος, η διάρκεια ζωής, η εβδομαδιαία και η συνολική κυτταρική απόδοση. Σε όλες τις περιπτώσεις η ανάπτυξη υπολειπόταν ποιοτικά και ποσοτικά στους ασθενείς, σε σχέση με τους μάρτυρες. Η προσθήκη παραγόντων στο καλλιεργητικό υλικό αποσκοπούσε στη βελτίωση των παραμέτρων που προαναφέρθηκαν. Η IFN-α, η βιταμίνη D3, η Ara-c και ο συνδυασμός της με IFN-α δεν βελτίωσαν τα αποτελέσματα. Η προσθήκη IL-3 είχε ευοδωτική επίδραση κυρίως στις κυτταρικές αποδόσεις. Η IL-6 είχε επίσης ευοδωτική δράση, κυρίως στον σχηματισμό στρώματος. Ο συνδυασμός IL-3+IL-6 απέβη ο πιο σημαντικός τροποποιητής της συμπεριφοράς των καλλιεργειών των ασθενών με ΜΔΣ ευοδώνοντας όλες τις παραμέτρους και προκάλεσε διαφορές πολύ σημαντικές σε σχέση με την control καλλιέργεια. Αναδείχθησαν λοιπόν ευρήματα συνέργειας των δύο ιντερλευκινών, σε όλες τις άλλες παραμέτρους αξιολόγησης των καλλιεργειών μακράς διάρκειας. Με βάση τον τρόπο ανάπτυξης και την συμπεριφορά των κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ στην προσθήκη των κυτταροκινών, διακρίθηκαν δύο μοντέλα in vitro ανάπτυξης της καλλιεργειών: Το δυσπλαστικό και το λευχαιμικό. Συμπερασματικά οι μακράς διάρκειας καλλιέργειες στους ασθενείς με ΜΔΣ αποτελούν χρήσιμη προγνωστική μέθοδο και μπορούν να διακρίνουν τους ασθενείς που θα εξελιχθούν ταχέως, από εκείνους που θα έχουν χρονιότερη και ηπιότερη πορεία. Συνδυασμός κυτταροκινών και άλλων παραγόντων μπορεί να βελτιώσει την προβληματική-παθολογική in vitro αιμοποίηση των προγονικών κυττάρων των ασθενών με ΜΔΣ. / Myelodysplastic syndromes comprise a heterogeneous group of hematopoietic stem-cell disorders, with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach. The revealing of the underlying pathogenetic mechanisms, implicated in the impaired hematopoiesis of these syndromes, is crucial for the development a more comprehensive and effective treatment approaches. The aim of this thesis was the study of hematopoiesis of MDS, by using long term cultures of hemopoietic cells and the investigation of the influence of various exogenous modulating factors-drugs in vitro, in an effort to obtain results, which could direct their use in vivo. Short term cultures revealed the disability of the progenitor cells of patients to form normal colonies. The addition of a mixture of growth factors in the conditioned medium had a positive influence in the majority of cases. By using long term cultures we compared the results obtained from patients with MDS, with those from normal controls, and between the different MDS subgroups For this comparison we used: the extent of the area of the stroma-layer formed, the longevity of the culture, the weekly cell production and the total cell yield of each culture. In all cases the development of cultures derived from patients was inferior to those of controls. The addition of modulating factors to the culture medium was aimed to improve the above parameters. IFN-α, vitamin D3, Ara-c and the combination of IFN-α and Ara-c did not improve any of the culture’s parameter. The addition of IL-3 had a clearly favorable effect mainly to the weekly and the total cell yield. Interleukin-6 had similarly a favourable effect, particularly promi-nent in the stroma-cell formation. The combination of IL-3 plus IL-6 was proved as the most important favourable modulator of the MDS cultures. It improved all culture parameters and produced statistically significant differences in comparison to the control cultures. According to the developmental model obtained by the long-term culture the dysplastic and the leukemic pattern of in vitro growth could be distinguished. In conclusion, long term cultures of hematopoietic cells of MDS patients represent a useful prognostic tool and can distinguish patients who will more rapidly evolve to leukemia from those who will have a more prolonged and stable clinical course. The use of a combination of cytokines and might have a favourable effect on in vitro hematopoiesis of the progenitor cells of MDS patients.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), γνωστή και ως πλειοτροπίνη, είναι ένας αυξητικός παράγοντας που η έκφρασή του στα ενήλικα άτομα είναι περιορισμένη σε συγκεκριμένους ιστούς. Ωστόσο, έκφραση ή υπερέκφρασή της έχει παρατηρηθεί in vivo σε διάφορους όγκους και στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου, καθώς και in vitro σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Παρόλο που οι in vivo βιολογικές δράσεις της HARP είναι αδιαμφισβήτητες, δεν έχει διασαφηνιστεί ο μηχανισμός με τον οποίο ασκεί τις δράσεις αυτές. Επίσης, υπάρχουν πολλά αντικρουόμενα αποτελέσματα αναφορικά με τις in vitro βιολογικές της δράσεις. Στη συγκεκριμένη εργασία διερευνήθηκε το εάν η διαφορετική έκφραση των υποδοχέων της HARP, RPTPβ/ζ και ALK, είναι ένας άλλος λόγος για τα αντικρουόμενα αυτά αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, δημιουργήσαμε DU145 και PC3 κύτταρα (κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη), τα οποία σταθερά έχουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του RPTPβ/ζ και του ALK. Τα DU145 κύτταρα εκφράζουν μόνο τον RPTPβ/ζ, σε αντίθεση με τα PC3 κύτταρα που εκφράζουν και τους δύο υποδοχείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει την επαγόμενη από HARP κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, ενώ ο ALK επάγει την επαγόμενη από HARP κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, η μελέτη της μεταγωγής σήματος αυτών των υποδοχέων έδειξε ότι ο RPTPβ/ζ καταστέλλει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten/Akt και των Erk1/2, ενώ ο ALK επάγει την ενεργότητα της Akt και των Erk1/2. Επιπρόσθετα, η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ σχετίζεται με την επαγωγή EMT φαινοτύπου, αφού καταστέλλει την έκφραση της E-καντερίνης και επάγει την έκφραση της Ν-καντερίνης, των ιντεγκρινών-α5, -αv και β3, καθώς και της MMP9. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι οι αυξητικοί παράγοντες αποτελούν υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή βιολογικά ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις με το ολικό μόριο. Η πλασμίνη, η τρυψίνη και η MMP2, πέπτουν την HARP και παράγουν πεπτίδια που αναστέλλουν την επαγωγική της δράση. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες, το ενδιαφέρον για την ανακάλυψη πεπτιδίων με αντικαρκινική δράση εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της HARP, καθώς και στις δύο κεντρικές περιοχές που παρουσιάζουν ομολογία με τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες της θρομβοσπονδίνης-1. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο μηχανισμός δράσης του P(122-131) και οι βιολογικές δράσεις των P(13-39) και P(65-97). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P(122- 131) μετά την πρόσδεσή του στον RPTPβ/ζ, μειώνει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης Src, της Fak, της Pten και των Erk1/2 και καταστέλλει την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και LNCaP κυττάρων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το P(122-131) καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες και μετά από τον ανταγωνισμό του με τη HARP για την πρόσδεση όχι μόνο στον ALK, αλλά και σε άλλους υποδοχείς. Τέλος, χρησιμοποιώντας το σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, παρατηρήσαμε ότι το P(122-131) καταστέλλει και την in vivo αγγειογένεση. Παρόμοια με το P(122-131), τα P(13-39) και P(65-97) καταστέλλουν την in vitro προσκόλληση και μετανάστευση των DU145 και PC3 κυττάρων μετά την πρόσδεσή τους στον RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ο ρόλος των υποδοχέων RPTPβ/ζ και ALK στον μηχανισμό δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP και των πεπτιδίων του. Για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι η ανασυνδυασμένη HARP προκαρυωτικής προέλευσης είναι βιολογικά ενεργή και ότι η δράση της εξαρτάται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της HARP και των πεπτιδίων της. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor that is thought to be involved in carcinogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many types of tumors, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. However, contradictory results have been published concerning the in vitro activities of HARP. Here, we investigated whether the differential expression of HARP receptors, namely RPTPβ/ζ and ALK, is another reason for these controversies. Using the RNAi technology, we stably transformed prostate cancer cell lines DU145 and PC3 to knockdown RPTPβ/ζ or ALK expression. DU145 cells express only RPTPβ/ζ, while PC3 cells express both RPTPβ/ζ and ALK. Our results showed that RPTPβ/ζ inhibits HARP-mediated cellular adhesion and migration, while ALK induces HARP-mediated cellular migration. Investigation of the transduction mechanism revealed that RPTPβ/ζ inactivates Src, Fak, Pten/Akt, and Erk1/2, while ALK activates Akt and Erk1/2. In addition, RPTPβ/ζ knockdown promotes a shift in expression form E- to N-cadherin, and induces the expression of integrin-α5, -αv, -β3, and MMP9. Growth factors can be hydrolyzed by proteases, leading to the production of biological active peptides. Previous studies indicate that HARP is cleaved by enzymes in the extracellular environment, such as plasmin, trypsin, chymotrypsin, and MMP2. Moreover, the resulting peptides exert altered biological functions compared to the whole molecule. Here, we investigated the effect of (P122-131), corresponding to the basic cluster of the C-terminal region of HARP, as well as the effect of P(13-39) and P(65-97) derived from the TSR domains of HARP. Our results demonstrated that P(122-131) interacts with RPTPβ/ζ, inactivates its catalytic activity, and triggers a signal transduction pathway that inhibits DU145 and LNCaP adhesion and migration, while in parallel interferes with ALK or other pleiotrophin receptors inhibiting pleiotrophin-induced cellular adhesion and migration. In addition, P(122-131) inhibits angiogenesis in vivo, as determined by the chicken embryo CAM assay. Furthermore, P(13-39) and P(65-97) interacts with RPTPβ/ζ and inhibits DU145 and PC3 adhesion and migration. Taken together, the results of this study demonstrate the effect of RPTPβ/ζ and ALK on HARP and its peptides-mediated biological actions. Our results support the hypothesis that the overall effect of pleiotrophin depends on the expression profile of its receptors. Concluding, we show that bacterial pleiotrophin is biological active and part of the diversity of pleiotrophin biological actions is due to RPTPβ/ζ and /or ALK and the complex way of their interactions and signaling.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύεται στην ηπαρίνη και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και της αγγειογένεσης. Υψηλές συγκεντρώσεις του αυξητικού παράγοντα HARP έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και σε ορό ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις από το ολικό μόριο. Η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από πρόσδεση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς SDC3, RPTPβ/ζ και ALK. Παρά την ταυτοποίηση του υποδοχέα ALK ως λειτουργικού υποδοχέα της HARP, μέχρι σήμερα υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με την αλληλεπίδρασή του με τη HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP και του υποδοχέα ALK σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK σε κύτταρα PC3, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε μειωθεί η συσσώρευση του RPTPβ/ζ. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα πεπτίδια που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και αντιστοιχούσαν σε περιοχές του αυξητικού παράγοντα HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] που προκύπτουν ύστερα από πέψη με πλασμίνη. Ύστερα από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) αποτέλεσμα το οποίο προέκυψε και ύστερα από μεωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται η έμμεση αλληλεπίδραση του υποδοχέα ALK και του αυξητικού παράγοντα HARP, η οποία βρέθηκε ότι διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αποδεικνύεται επίσης ότι παρόλο που η αλληλεπίδραση των δύο αυτών μορίων δεν είναι ικανή να οδηγήσει στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν βιοχημικά καθώς η αλληλουχία 60-110 των αμινοξέων της HARP αλληλεπιδρά ισχυρά και με τις δύο μορφές του υποδοχέα, με μοριακό βάρος 220 και 140 kDa αντίστοιχα. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) is a heparin-binding growth factor, involved in the regulation of cell differentiation, cell proliferation as well as in angiogenesis. Elevated concentrations of HARP have been detected in malignancies, in cancer cell lines, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. It is also known that HARP is substrate for different proteases of the cell microenvironment, leading to the production of biological active peptides which can exert similar or even opposite biological activities to HARP. HARP exerts its biological actions after binding to the transmembrane receptors SDC3, RPTPβ/ζ and ALK. Even though ALK has been defined as a functional HARP receptor, contradictory results have been published concerning HARP-ALK interaction. In the present work, we studied the interaction of HARP growth factor with ALK transmembrane receptor using PC3 prostate cancer cells. It was shown that HARP induces the phosphorylation of ALK in PC3 cells, however no effect on ALK activation was observed in PC3 cells after RPTPβ/ζ knockdown. We also used recombinant gst-fused peptides corresponding to various fragments of HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] which result after cleavage with plasmin. After GST pull-down assays it was shown that ALK strongly binds to the P(60-110), result that was also taken after RPTPβ/ζ knockdown. Cumulatively, our results indicate that HARP-induced ALK phosphorylation is mediated by RPTPβ/ζ. It is also demonstrated that HARP interacts biochemically with ALK, since P(60-110) strongly binded both species of ALK (220 and 140 kDa).

Thirty eligible patients are randomly assigned to two groups. The test group received PRP application around new implants, while in the control group no PRP treatment was made. The bone-to-implant contact region was analyzed in a clinical sample of 60 Digitized Panoramic Radiographs, 30 corresponding to immediate implant loading (Class-I) and 30 after an 8 month follow-up period (Class-II). This region was sampled by 1146 circular Regions-of-Interest (ROIs), resulting from a specifically designed segmentation scheme based on Markov-Random-Fields (MRF). From each ROI, 41 textural features were extracted, then reduced to a subset of 4 features due to redundancy and employed as input to Receiver-Operating-Characteristic (ROC) analysis, to assess the textural differentiation between two classes. / Σε αυτή την έρευνα για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε μια υπολογιστική μελέτη υφής για την εκτίμηση της διαφοροποίησης της υφής που συνδέεται με τις ιδιότητες του σχηματισμού των οστών, περιμετρικά του εμφυτεύματος μετά την χρήση πλάσματος πλούσιο σε αιμομετάλια (Platelet-Rich-Plasma), σε πανοραμικές ακτινογραφίες. Ο κύριος στόχος ήταν να ποσοτικοποιηθεί οποιαδήποτε διαφοροποίηση της υφής σε εικόνες πανοραμικής ακτινογραφίας σε μια περίοδο παρακολούθησης 8 μηνών, στην διεπαφή οστών-εμφυτεύματος, μεταξύ των δύο κατηγοριών (0 & 8 μήνες) και κατά συνέπεια να αξιολογηθεί οποιαδήποτε στατιστική διαφορά στα χαρακτηριστικά υφής των ακτινογραφιών μεταξύ των ομάδων ελέγχου και δοκιμασίας που μπορεί να αποδοθεί στη θεραπεία PRP. Η ανάλυση υφής σε συνδυασμό με τις ιδιότητες του σχηματισμού των οστών γύρω περιμετρικά του εμφυτεύματος πραγματοποιήθηκε με ROC ανάλυση.

Η διαδικασία της αύξησης ελέγχεται από έναν πολύπλοκο συνδυασμό πολλών παραγόντων σε διάφορα επίπεδα, που περιλαμβάνουν ενδογενείς παράγοντες, όπως είναι ο γονότυπος, οι ορμόνες, οι παράγοντες αύξησης και εξωγενείς παράγοντες, όπως είναι η διατροφή και η επίδραση του περιβάλλοντος. Οι ορμονικοί παράγοντες, που επηρεάζουν την αύξηση είναι κυρίως η αυξητική ορμόνη (GH) και οι ινσουλινόμορφοι αυξητικοί παράγοντες (IGFs). Στην διαδικασία της αύξησης συμμετέχουν, όμως, και άλλες ορμόνες, όπως η θυροξίνη, τα επινεφριδιακά ανδρογόνα, τα στεροειδή του φύλου, τα γλυκοκορτικοειδή, η βιταμίνη D, η λεπτίνη και η ινσουλίνη, που αλληλεπιδρούν με τον άξονα GH-IGF. Η αυξητική ορμόνη εκκρίνεται στην κυκλοφορία από τα σωματότροπα κύτταρα του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης, υπό την επίδραση δύο υποθαλαμικών ορμονών του εκλυτικού παράγοντα της αυξητικής ορμόνης (GHRH), που διεγείρει την έκκριση της GH και της σωματοστατίνης (SS), που αναστέλλει την έκκρισή της. Μέχρι σήμερα στην διεθνή βιβλιογραφία έχουν περιγραφεί πολλές μεταλλάξεις του γονιδίου της GH ως αιτία κοντού αναστήματος στα παιδιά. Η παρούσα μελέτη εξέτασε ομάδα 11 παιδιών με κοντό ανάστημα, ρυθμό αύξησης κάτω από την 2η εκατοστιαία θέση και καθυστερημένη οστική ηλικία. Όλοι οι ασθενείς υπεβλήθησαν σε λεπτομερή κλινική εξέταση και πλήρη εργαστηριακό έλεγχο. Από την κλινική εξέταση και τον εργαστηριακό έλεγχο αποκλείστηκε η παρουσία κάποιας συστηματικής πάθησης. Στην συνέχεια υπεβλήθησαν σε προκλητές δοκιμασίες έκκρισης της GH, με κλονιδίνη και L-Dopa, σε έλεγχο της 24ωρης έκκρισης της GH και τη δοκιμασία γένεσης του IGF-I. Με βάση τα εργαστηριακά αποτελέσματα της έκκρισης της GH η ομάδα των ασθενών διαχωρίστηκε σε αυτούς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (10 περιπτώσεις) και ένα ασθενή με νευροεκκριτική δυσλειτουργία της GH (GHND), ο οποίος είχε μειωμένη 24ωρη έκκριση GH. Από τους ασθενείς αυτούς ελήφθησαν βιοψίες ούλων, στους καλλιεργημένους ινοβλάστες των οποίων έγιναν οι μελέτες αύξησης των ινοβλαστών και περιφερικό αίμα, από το οποίο έγινε εξαγωγή γονιδιωματικού DNA. Έγινε πολλαπλασιασμός των γονιδίων του υποδοχέα της GH (GHR) και του γονιδίου της GH (GH1) με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και προσδιορισμός της αλληλουχίας τους. Ανιχνεύτηκαν μεταλλαγές στους 6 από τους 11 ασθενείς, που μελετήθηκαν, οι οποίες εντοπίζονταν στο ιντρόνιο 4 του γονιδίου GH1 και ένας ακόμη ασθενής που έφερε μεταλλάξεις στα ιντρόνια 1 και 2. Οι μεταλλάξεις αυτές δεν επηρέαζαν την διαδικασία του ματίσματος και τον σχηματισμό του mRNA και απομακρύνονταν με το μάτισμα. Στην βιβλιογραφία αναφέρονται περισσότεροι από 10 πολυμορφισμοί του γονιδίου GH1 που εντοπίζονται κυρίως στα ιντρόνια του γονιδίου και κάποιοι από αυτούς έχουν συσχετιστεί με ελαττωμένη έκφραση του γονιδίου GH1. Στον ασθενή με την GHND περιγράφηκε μια μεταλλαγή στη θέση +7 του ιντρονίου 4 του γονιδίου GH1. RT-PCR του GH1 cDNA έδειξε ότι η μετάλλαξη αυτή είναι υπεύθυνη για το εσφαλμένο μάτισμα του mRNA, με αποτέλεσμα την απαλοιφή του εξονίου 5 από το ώριμο μετάγραφο. Ο ασθενής με τη μεταλλαγή είναι ετεροζυγώτης και η ίδια μεταλλαγή σε ετερόζυγη κατάσταση, βρέθηκε και στους δύο γονείς του ασθενούς, οι οποίοι έχουν επίσης κοντό ανάστημα. Η μεταλλαγή αυτή οδηγεί στην παραγωγή μικρότερου μορίου GH. Η βιοδραστικότητα του παραγόμενου ανώμαλου μορίου της GH εκτιμήθηκε με την προσθήκη ορού του ασθενούς σε καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών, με τη μέθοδο ενσωμάτωσης στο DNA της βρώμο-δεοξυουριδίνης (BrDU), η οποία έδειξε μειωμένη σύνθεση DNA συγκρινόμενη με την σύνθεση DNA παρουσία ορού φυσιολογικών ατόμων. Δηλαδή η περίπτωση αυτή οικογενούς κοντού αναστήματος, το οποίο κληρονομείται κατά τον επικρατούντα χαρακτήρα, οφείλεται σε μεταλλαγή στο ιντρόνιο 4 του γονιδίου GH1. / Growth can be defined as an increase in size by accretion of tissue. The control of the growth process is affected by many complex interacting factors including internal cues such as the genotype, external factors such as nutrition and environment, and internal signaling systems such as hormones and growth factors. The principal hormones influencing growth are Growth Hormone (GH) and the Insulin-like Growth Factors (IGFs), but many other hormones contribute, such as thyroxine, adrenal androgens, sex steroids, glucocorticoids, vitamin D, leptin and insulin, often channeled through interaction with the GH-IGF axis. GH is secreted from the anterior pituitary into the circulation. The pattern of GH secretion is determined primarily by the interaction between the hypothalamic peptides Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) and somatostatin (SS). Many mutations of the GH1 gene have been described as the cause of short stature in children. The present study examined 11 children with severe short stature, growth velocity below the 2nd centile and delayed bone age. All patients underwent thorough clinical examination and laboratory investigation in order to exclude an underlying chronic disease. Also GH secretion provocative studies, 24 hr endogenous secretion studies and IGF-I generation test were carried out. According to the results of these tests the patients we studied were divided in two groups: 10 of the patients had idiopathic short stature (ISS) and 1 patient had GH neurosecretory dysfunction (GHND). Fibroblast cultures were established from gingival biopsies obtained from the patients and genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes. GH1 and GH receptor (GHR) genes were amplified by PCR and sequenced. Hot spot mutations were detected in GH1 intron 4 in 6 patients and mutations in introns 1 and 2 were detected in 1 patient. These mutations did not affect the splicing of the primary RNA transcript. A novel deletion of thymine 7 bp downstream from the 3' splice site of intron 4 was found in the patient who had GHND. RT-PCR of GH1 cDNA showed that this mutation causes aberrant GH mRNA splicing, changes the read frame, creates a new stop codon and results in the deletion of exon 5. This was also confirmed by restriction enzyme analysis of the mutant cDNA. Both short parents and the patient are heterozygotes for this mutation. BrDU incorporation in the DNA of normal fibroblast cultures in the presence of the patient’s blood serum showed reduced DNA synthesis compared to fibroblasts cultured in medium with normal human serum. Addition of high concentrations of GH (4 μg/ml) to the culture medium containing the patient’s serum led to a near normal DNA synthesis. This is a new case of familial short stature inherited as a dominant trait, due to a mutation in intron 4 of the GH1 gene.