Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας ο οποίος εμφανίζει πλειάδα βιολογικών δράσεων εμπλεκόμενος στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση πολλών τύπων κυττάρων, καθώς και στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων. Η HARP έχει χρονοειδικό και ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης, υπερεκφράζεται όμως σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους και βρίσκεται σε υψηλή συγκέντρωση στον ορό του αίματος ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου. Η HARP ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μετά από δέσμευση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς, SDC3, ALK και RPTPβ/ζ. Οι βιολογικές της δράσεις προσδιορίζονται από τη συνισταμένη των δράσεων που έχει κάθε υποδοχέας της, αντικατοπτρίζοντας τον περίπλοκο μηχανισμό δράσης της. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε τον τρόπο με τον οποίο η SDC3 διαμεσολαβεί τις βιολογικές δράσεις της HARP σε κύτταρα DU145 και PC3, κυτταρικές σειρές από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη. Χρησιμοποιώντας την RNAi τεχνολογία, διαμολύναμε παροδικά τα κύτταρα με siRNA ειδικά σχεδιασμένο έναντι της SDC3, μειώνοντας τα επίπεδα έκφρασης της. Καλλιεργήσαμε κύτταρα, φυσιολογικά και μετασχηματισμένα, επιδράσαμε εξωγενώς με HARP και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, η SDC3 είναι θετικός ρυθμιστής της επαγόμενης από τη HARP κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης. Παράλληλα, μελετήσαμε την ενεργοποίηση μορίων που εμπλέκονται στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της SDC3 όπως της Src, Fak, Akt, Pten και Erk1/2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποίησή της SDC3 από τη HARP οδηγεί στην αύξηση των επιπέδων των pSrc, pFak, pAkt και p Erk1/2, ενώ, βρέθηκε ότι μειώνεται η φωσφορυλίωση της Pten. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η συμμετοχή της συνδεκάνης 3 στις βιολογικές δράσεις της HARP, καθώς και μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού μεταγωγής σήματος του υποδοχέα αυτού. Βρέθηκε ότι η HARP προσδενόμενη στον υποδοχέα αυτό, επάγει την προσκόλληση και μετανάστευση των κυττάρων, δράσεις που συνδέονται με την ανάπτυξη όγκων και τη μετάσταση καρκινικών κυττάρων. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide), also known as Pleiotrophin, is a growth factor involved in several biological actions such as induction of cellular proliferation, migration and angiogenesis. Elevated concentrations of this growth factor are found in many tumours, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. HARP exerts its actions after binding to the transmembrane receptors RPTP β/ζ, ALK and N-Syndecan (SDC3). In the present work, we studied the role of the transmembrane receptor SDC3 in the biological actions of HARP. We used DU145 and PC3 transiently transfected with specific siRNA to downregulate the accumulation of SDC3. Our results show that HARP binds to SDC3 and induces the cell adhesion and migration of DU145 and PC3 cells. We also studied the signal transduction through SDC3 receptor and the activation of signaling molecules such as Src, Fak, Akt, Pten and Erk 1/2. Our results revealed that HARP induces the phosphorylation of Src kinase, Fak and Erk1/2 after binding to SDC3 in both DU145 and PC3 cells. Also, HARP increases Akt signaling cascade in PC3 cells, while it suppresses the signaling cascade induced by PTEN in DU145 cells. Consequently, HARP interaction with SDC3, results in the activation of SDC3, which in turn triggers a signal transduction pathway that leads to specific biological cell responses activates other cytoplasmic effectors. Therefore, there starts a signaling cascade that targets specific genes and cell response. In conclusion, our results indicate that SDC3 contributes, as a positive regulator, to HARP-dependent cell adhesion and migration in both DU145 and PC3 cells.

Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύεται στην ηπαρίνη και εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς και της αγγειογένεσης. Υψηλές συγκεντρώσεις του αυξητικού παράγοντα HARP έχουν βρεθεί σε ανθρώπινους καρκινικούς όγκους, σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως επίσης και σε ορό ασθενών με διάφορους τύπους καρκίνου. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα για διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενεργών πεπτιδίων που μπορούν να έχουν παρόμοιες ή και αντίθετες δράσεις από το ολικό μόριο. Η HARP ασκεί τις βιολογικές τις δράσεις ύστερα από πρόσδεση στους διαμεμβρανικούς υποδοχείς SDC3, RPTPβ/ζ και ALK. Παρά την ταυτοποίηση του υποδοχέα ALK ως λειτουργικού υποδοχέα της HARP, μέχρι σήμερα υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις αναφορικά με την αλληλεπίδρασή του με τη HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα HARP και του υποδοχέα ALK σε καρκινικά κύτταρα PC3 ανθρώπινου προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK σε κύτταρα PC3, ωστόσο δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου υποδοχέα σε κύτταρα PC3 στα οποία είχε μειωθεί η συσσώρευση του RPTPβ/ζ. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα πεπτίδια που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και αντιστοιχούσαν σε περιοχές του αυξητικού παράγοντα HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] που προκύπτουν ύστερα από πέψη με πλασμίνη. Ύστερα από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι ο ALK αλληλεπιδρά ισχυρά με το πεπτίδιο P(60-110) αποτέλεσμα το οποίο προέκυψε και ύστερα από μεωρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται η έμμεση αλληλεπίδραση του υποδοχέα ALK και του αυξητικού παράγοντα HARP, η οποία βρέθηκε ότι διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αποδεικνύεται επίσης ότι παρόλο που η αλληλεπίδραση των δύο αυτών μορίων δεν είναι ικανή να οδηγήσει στη φωσφορυλίωση του υποδοχέα ALK, τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν βιοχημικά καθώς η αλληλουχία 60-110 των αμινοξέων της HARP αλληλεπιδρά ισχυρά και με τις δύο μορφές του υποδοχέα, με μοριακό βάρος 220 και 140 kDa αντίστοιχα. / HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) is a heparin-binding growth factor, involved in the regulation of cell differentiation, cell proliferation as well as in angiogenesis. Elevated concentrations of HARP have been detected in malignancies, in cancer cell lines, as well as in the plasma of patients with different types of cancer. It is also known that HARP is substrate for different proteases of the cell microenvironment, leading to the production of biological active peptides which can exert similar or even opposite biological activities to HARP. HARP exerts its biological actions after binding to the transmembrane receptors SDC3, RPTPβ/ζ and ALK. Even though ALK has been defined as a functional HARP receptor, contradictory results have been published concerning HARP-ALK interaction. In the present work, we studied the interaction of HARP growth factor with ALK transmembrane receptor using PC3 prostate cancer cells. It was shown that HARP induces the phosphorylation of ALK in PC3 cells, however no effect on ALK activation was observed in PC3 cells after RPTPβ/ζ knockdown. We also used recombinant gst-fused peptides corresponding to various fragments of HARP [P(9-110), P(9-59), P(60-110)] which result after cleavage with plasmin. After GST pull-down assays it was shown that ALK strongly binds to the P(60-110), result that was also taken after RPTPβ/ζ knockdown. Cumulatively, our results indicate that HARP-induced ALK phosphorylation is mediated by RPTPβ/ζ. It is also demonstrated that HARP interacts biochemically with ALK, since P(60-110) strongly binded both species of ALK (220 and 140 kDa).