Η Ακετονική Τριαμσινολόνη είναι ένα συνθετικό γλυκοκορτικοειδές το οποίο έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία ενός αριθμού φλεγμονωδών και αγγειακών / εξιδρωματικών παθήσεων του οφθαλμού, χορηγούμενη υπό μορφή ένεσης παραβόλβια, υποτενόνια ή ενδοϋαλοειδικά. Δυστυχώς έχει περιορισμένο χρόνο ημιζωής με συνέπεια να είναι συχνά αναγκαίες επανειλημμένες ενέσεις για να επιτευχθεί παρατεταμένη δράση. Αυτό αυξάνει τη συχνότητα των επιπλοκών, οι οποίες σχετίζονται τόσο με το ίδιο το φάρμακο όσο και με την οδό χορήγησης. Σκοπός της μελέτης: Η παρασκευή σκληρικών συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης Ακετονικής Τριαμσινολόνης βασιζόμενα στο βιοδιασπόμενο πολυμερές Πόλυ[γαλακτικό] (PLA) και η αξιολόγηση των in vitro/ex vivo χαρακτηριστικών τους σε σχέση με τη δυνητική χρήση τους για παρατεταμένη διασκληρική χορήγηση ΤΑ. Υλικό και Μέθοδος: Μικροσφαίρες PLA που περιείχαν ΤΑ παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του απλού και του διπλού γαλακτώματος. Εξετάστηκαν η μορφολογία τους, το μέγεθός τους, η επίδραση της αρχικής ποσότητας ΤΑ και της μεθόδου παρασκευής στη φόρτιση των μικροσφαιρών καθώς και η in vitro αποδέσμευση ΤΑ από αυτές. Παρασκευάστηκαν δισκία αποτελούμενα από μικροσφαίρες καθαρού PLA και ΤΑ (με αναλογία βάρους 1:1, 2:1 και 4:1 αντίστοιχα) και εξετάστηκε η in vitro καμπύλη αποδέσμευσης ΤΑ από αυτά. Αξιολογήθηκε η καμπύλη διασκληρικής διάχυσης in vitro τοποθετώντας ένα δισκίο αναλογίας PLA:TA=1:1 σε ένα δοχείο δότη και μετρώντας τη συγκέντρωση ΤΑ σε δοχείο δέκτη. To δοχείο δότης και το δοχείο δέκτης διαχωρίζονταν διαμέσου ενός τμήματος σκληρού χιτώνα κουνελιού. Σε δύο πτωματικούς οφθαλμούς κουνελιών τοποθετήθηκε επισκληρικά ένα δισκίο 1:1 PLA-ΤΑ και καλύφθηκε με ένα σκληρικό μόσχευμα. Η συγκέντρωση της ΤΑ στο υδατοειδές υγρό και στο υαλοειδές μετρήθηκε 5, 10 και 20 ημέρες μετά από την ένθεση. Aποτελέσματα: Η μέση διάμετρος των μικροσφαιρών ήταν 2 μm. H μέθοδος του διπλού γαλακτώματος καθώς και η αύξηση της αρχικής ποσότητας του φαρμάκου οδήγησε στην αύξηση της τιμής φόρτισης και ενκαψακίωσης των μικροσφαιρών. Παρατηρήθηκε παρατεταμένη για αρκετές μέρες αποδέσμευση ΤΑ από τις μικροσφαίρες, με το ρυθμό αποδέσμευσης να εξαρτάται από την περιεκτικότητά τους σε ΤΑ. H ΤΑ αποδεσμευόμενη από δισκία PLA-TA παρουσίασε παρατεταμένη αποδέσμευση, με το ρυθμό της να εξαρτάται από το λόγο PLA:TA. H TA μπόρεσε να διαπεράσει το σκληρό χιτώνα με περίπου 21% του φαρμάκου στο δοχείο δότη να έχει διαχυθεί διαμέσου του σκληρού χιτώνα μετά από 45 ημέρες. Μετά από σκληρική χορήγηση η ΤΑ εμφάνισε συγκεντρώσεις στο υδατοειδές υγρό και στο υαλοειδές σε πτωματικούς οφθαλμούς. Συμπεράσματα: Οι μικροσφαίρες και τα δισκία PLA-TA που αναπτύχθηκαν σε αυτήν τη μελέτη παρουσιάζουν παρατεταμένη και ελεγχόμενη αποδέσμευση ΤΑ, έχουν τα πλεονεκτήματα της καθιερωμένης βιοαποικοδομησιμότητας και βιοσυμβατότητας του πολυμερούς PLA, παρέχουν ευελιξία ως προς το ρυθμό αποδέσμευσης και τη συνολική δόση ΤA και παρουσιάζουν ευκολία στους χειρουργικούς χειρισμούς. Αυτά τα συστήματα φαίνεται να είναι υποσχόμενα για την ελεγχόμενη διασκληρική χορήγηση ΤΑ και δικαιολογείται η περαιτέρω μελέτη τους. / Triamcinolone Acetonide (TA) is a synthetic glucocorticoid, which has been widely used to treat a number of inflammatory and vascular and/or exudative diseases of the eye, administered via a peribulbar, sub-tenon or intravitreal injection. Unfortunately, it has a limited half-life and thus repeated injections are often required to establish a prolonged effect. This increases the rate of complications, which are related to the drug itself as well as to the administration route. Study Purpose: To develop scleral controlled-release-systems of Τriamcinolone Αcetonide based on biodegradable Poly[lactide] (PLA) and evaluate their in vitro/ex vivo properties with regard to their possible application for the prolonged transscleral delivery of TA. Materials and Methods: PLA microspheres containing TA were prepared by a single or double emulsification-solvent evaporation method. Morphology, size, effect of drug input and method of microsphere preparation on drug loading, and in vitro TA release of the microspheres were investigated. Tablets consisting of blank PLA-microspheres and TA (weight ratios of 1:1, 2:1, and 4:1, respectively) were developed and their release profile οf TA in vitro was evaluated. The in vitro transscleral diffusion profile was evaluated by placing a PLA-TA (1:1) tablet in a donor chamber and measuring the TA concentration in a receptor chamber. Donor and receptor chambers were separated by rabbit sclera. Two cadaver rabbit eyes received a 1:1 PLA-TA tablet episclerally, which was covered by a scleral patch. TA aqueous humor and vitreous concentrations were measured 5, 10, and 20 days post implantation. Results: Microsphere average diameter was 2 μm. The double emulsification method and increasing drug input led to an increase in microsphere drug loading and encapsulation. Sustained release of TA over several days from the microspheres in vitro was observed, with the rate of release being affected by their TA content. TA exhibited sustained release profile from the PLA-TA tablets, with the rate of release being affected by the PLA:TA ratio. TA could cross the sclera tissue in vitro, with approximately 21% of the initial drug in the donor compartment having diffused through the sclera in 45 days. Following scleral administration of the PLA-TA tablets, TA accumulated in the vitreous and aqueous humor of cadaver eyes. Conclusions: The PLA-TA microspheres and tablets developed in this study provide a sustained and controlled release of TA, provide the advantages of established biodegradability and biocompatibility of the PLA polymer, demonstrate flexibility concerning their TA release rate and total TA dosage and are easy to surgically manipulate. These systems appear promising for the controlled transscleral delivery of TA and justify further investigation.

Παρά τις προόδους των κλασικών θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο, η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών υποτροπιάζει και καταλήγει. Η ανάγκη για την αντιμετώπιση της νόσου με εναλλακτικό τρόπο οδήγησε στην ανάπτυξη ανοσοθεραπευτικών μεθόδων. Η ιδέα της ανοσοθεραπείας του καρκίνου έγινε γνωστή στα τέλη του δέκατου ένατου αιώνα, όταν ο William Coley χρησιμοποίησε ζωντανά στελέχη του πυογενούς βακτηρίου Streptococcus erysipelas με σκοπό τη δημιουργία γενικευμένης ανοσολογικής απάντησης, μέρος της οποίας να κατευθυνθεί ενάντια σε όγκους σαρκώματος. Οι σποραδικές θετικές αποκρίσεις που παρατήρησε οφείλονταν κατά πάσα πιθανότητα σε ενίσχυση της ανοσολογικής απάντησης από τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις που προκάλεσαν τα βακτήρια. Για να επαχθεί όμως ειδική ανοσολογική απάντηση ενάντια σε όγκους απαιτείται να χαρακτηριστούν στα καρκινικά κύτταρα συγκεκριμένα αντιγόνα, ώστε να δύναται το ανοσολογικό σύστημα να τα αναγνωρίσει ως στόχους. Συνεπώς, το πρώτο βήμα στην προσπάθεια για ανοσοθεραπεία του καρκίνου είναι η απομόνωση αντιγόνων που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία κατά προτίμηση να μην εκφράζονται από τους φυσιολογικούς ιστούς ώστε να αποφευχθεί η αυτοάνοση απάντηση. Η ταυτοποίηση ογκοειδικών αντιγόνων, τα οποία αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα, έδωσε ιδιαίτερη ώθηση στην ανάπτυξη της κατευθυνόμενης από τα Τ κύτταρα ανοσολογικής απάντησης, στο επίπεδο τόσο της έρευνας της ανοσολογίας του καρκίνου, όσο και της κλινικής ανοσοθεραπευτικής εφαρμογής και έθεσε τις βάσεις για τη χρησιμοποίηση πεπτιδικών εμβολίων στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Από την πληθώρα των γνωστών καρκινικών αντιγόνων, έχουν ταυτοποιηθεί κατά κύριο λόγο επίτοποι ικανοί να συνδεθούν με μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Ι και συνεπώς να επάγουν την ενεργοποίηση των CD8+ T κυττάρων, δεδομένου ότι οι περισσότεροι όγκοι είναι θετικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης Ι, αλλά αρνητικοί ως προς τα μόρια MHC τάξης ΙΙ. Επιπρόσθετα, τα CD8+ Τ κύτταρα μπορούν να καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα απευθείας, μέσω της αναγνώρισης του συμπλόκου MHC τάξης Ι-πεπτιδίου που εκφράζεται στην επιφάνεια του όγκου. Τα τελευταία χρόνια, δεδομένης της αναγνώρισης του κεντρικού ρόλου των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων στην έναρξη, οργάνωση και διατήρηση της ανοσολογικής απάντησης, έχουν αναγνωριστεί και αρκετοί επίτοποι που αναγνωρίζονται από μόρια MHC τάξης ΙΙ. Πρόσφατες κλινικές μελέτες και προκλινικά μοντέλα έδειξαν ότι ο εμβολιασμός με επιτόπους που δύνανται να συνδεθούν με μόρια MHC τάξης ΙΙ, οι οποίοι εμπεριέχουν αλληλουχίες σύνδεσης για τα μόρια MHC τάξης Ι, είναι αποτελεσματικοί στην ταυτόχρονη ανάπτυξη βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με μακρά διάρκεια ζωής in vivo. Από τα γνωστά καρκινικά αντιγόνα, η πρωτεΐνη HER-2/neu παρουσιάζει το πλεονέκτημα της υπερέκφρασης σε ποικίλους τύπους καρκίνου, ενώ οι ασθενείς των οποίων όγκοι την υπερεκφράζουν παρουσιάζουν προϋπάρχουσα ανοσία ενάντια σε πεπτίδια αυτής. Η αυξημένη έκφρασή της στα καρκινικά κύτταρα και το γεγονός ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη την καθιστούν στόχο για ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις που περιλαμβάνουν τόσο κυτταρική όσο και χυμική ανοσία. Κλινικές έρευνες με χρήση πεπτιδίων της HER-2/neu έχουν δείξει την πρόκληση ανοσολογικής απάντησης στην πλειονότητα των ασθενών. Παρόλα αυτά, οι μεταστατικοί τύποι καρκίνου που υπερεκφράζουν τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη παραμένουν μη θεραπεύσιμοι. Συνεπώς, υπάρχει άμεση ανάγκη για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις και στο σημείο αυτό η διερεύνηση των πιο ανοσογονικών τμημάτων της αλληλουχίας της πρωτεΐνης HER-2/neu, καθώς και της αντίδρασης των ασθενών σε αυτά, αποτελούν στόχο για ειδικές νέες αντικαρκινικές θεραπείες. O εγκλεισμός του αντιγόνου σε μικροσφαίρες πολυ-γαλακτικού-γλυκολικού οξέος (PLGA) έχει δειχθεί ότι επάγει ισχυρή και παρατεταμένη ανοσοαπόκριση. Μέχρι σήμερα, δεν φαίνεται να έχει αναφερθεί μελέτη στην οποία να αναλύεται η επίδραση των χαρακτηριστικών του PLGA συμπολυμερούς και του σχήματος ανοσοποίησης στον τύπο της λαμβανόμενης ανοσοαπόκρισης μετά την χορήγηση PLGA μικροσφαιρών του αντιγόνου in vivo. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης που λαμβάνεται in vivo μετά την χορήγηση πεπτιδίων της HER-2/neu (πρότυπα αντιγόνα) συνδεμένων σε πολυ-γαλακτικού οξέος (PLA) και PLGA μικροσφαίρες. Τα πρότυπα αντιγόνα ήταν δύο: * το πεπτίδιο GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL, που αντιστοιχεί στην περιοχή 778-799 της ογκοπρωτεΐνης HER-2/neu. Η πεπτιδική αυτή ακολουθία περιλαμβάνει τον κυτταροτοξικό επίτοπο CLTSTVQLV (789-797) σε συνδυασμό με τον T βοηθητικό (Th) επίτοπο GSPYVSRLLGICL (778-790) της συγκεκριμένης ογκοπρωτεΐνης. * καθώς και το πεπτίδιο CLTSTVQLV (789-797), δηλαδή μόνο ο κυτταροτοξικός (CTL) επίτοπος. Ως πειραματόζωα στην συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν HHD διαγονιδιακοί μύες, οι οποίοι εκφράζουν ανθρώπινα HLA-A2.1 μόρια ιστοσυμβατότητας, δεδομένου ότι η ακολουθία του πεπτιδίου που έχει επιλεγεί προέρχεται από την ανθρώπινη HER-2/neu. Η μετατροπή της ανοσοαπόκρισης Th2 τύπου, εναντίον διαλυτών αντιγόνων που εκφράζονται σε καρκινικούς όγκους, σε Τh1 τύπο ανοσοαπόκρισης είναι σημαντική στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Η δημιουργία αντιγονο-ειδικών CD8+ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων, σε συνέργεια με τα αντίστοιχα βοηθητικά Τ (CD4+) λεμφοκύτταρα, πιστεύεται ότι θα οδηγήσουν στην απόρριψη του όγκου ή στην επιβράδυνση της ανάπτυξης αυτού. Η ταυτοποίηση του τύπου της ανοσοαπόκρισης έγινε με την ανάπτυξη ανοσοαναλυτικών τεχνικών για την μέτρηση των ολικών ειδικών ανοσοσφαιρινών IgG, των ισοτύπων αυτών (IgG1 και IgG2a). Επίσης προσδιορίσθηκε ο τύπος της ανοσοαπόκρισης σε κυτταρικό επίπεδο με την ανάπτυξη τεχνικών μέτρησης της ικανότητας του πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων και με μέτρηση των κυτοκινών, κυρίως σε υπερκείμενα καλλιεργειών λεμφοκυττάρων, αλλά και στο αίμα. Για την χορήγηση χρησιμοποιήθηκαν μικροσφαίρες PLA και PLGA με φορτωμένο το αντιγόνο με δύο διαφορετικούς τρόπους (προσροφημένο ή απλά αναμεμιγμένο). Η in vivo χορήγηση του πεπτιδικού αντιγόνου που απλά και μόνο αναμίχθηκε με PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση που ήταν συγκρίσιμη με αυτήν που προκλήθηκε από το συνδυασμό του αντιγόνου με πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund (CFA). Επιπλέον, μετά από ανάλυση του προφίλ των κυτοκινών που εκκρίνονται από τα Τ λεμφοκύτταρα των ανοσοποιημένων μυών, αποδείχθηκε ότι ο συνδυασμός του αντιγόνου πεπτιδίων με τις PLA μικροσφαίρες προκάλεσε μια ισχυρή Th1 ανοσολογική απόκριση στο αντιγόνο. Ο χρόνος της επώασης πεπτιδίων με τις μικροσφαίρες πριν από τη χορήγηση δεν είχε επιπτώσεις στην ανοσολογική απόκριση, γεγονός που απλοποιεί περαιτέρω την παραγωγή σε ευρεία κλίμακα αυτού του τύπου εμβολίων. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από αυτή τη μελέτη δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση σε in vivo πειραματικά μοντέλα καρκίνου της δυνατότητας επαγωγής ισχυρής κυτταρικής ανοσοαπόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν την HER-2/neu πρωτεΐνη με απλή ανάμιξη κατάλληλων πεπτιδικών αντιγόνων της HER-2/neu με PLA μικροσφαίρες. / Despite the progress of classic therapeutic strategies developed concerning cancer the greatest number of patients deteriorates and eventually dies. The need to confront this disease in an alternative way has led to the development of new immunotherapeutic methods. The novel idea of cancer immunotherapy was born in the 19th century when William Coley used live live species of bacteria Streptococcus erysipelas in order to induce an overall immune response targeted in part against sarcoma tumors. Occasional positive immune responses that were observed were possibly due to the enhancement of the immune response from the inflammatory reactions caused by the bacteria. In order to induce a special immune response against tumors it is necessary for some specific antigens to be identified at cancer cells. So the first step in the effort to induce immunotherapy is the isolation of antigens expressed by cancer cells that are preferably not expressed at healthy tissues, to prevent autoimmune response. The identification of tumor-specific antigens that are identified by T cells gave a great boost to the development of T-cell-mediated specific immune response, both in research for tumor immunology as in its clinical appliance. That led to the beginning of peptide use in vaccines in cancer immunotherapy. From the plethora of already known cancer antigens, epitopes have been identified as capable of forming complex with MHC (Major Histocompatibility Complex) class I molecules, which consequently induce the activation of CD8+ T cells, given that most tumors are positive for the MHC class I molecules, but negative to MHC class II molecules. Moreover, CD8+ T cells can kill cancer cells directly, through identification of the MHC class I–peptide complex that is expressed on the tumor surface. Recently many epitopes that are recognized by MHC class II molecules have been identified, since it is well known that the CD4+ T cells play an important role in the initiation, organization and maintenance of the immune response. Recent clinical studies and preclinical models have shown that immunization with epitopes that are eminent to form a complex with MHC class II molecules, which comprise amino acid sequences that can connect with MHC class I molecules, are effective in the simultaneous induction of helper and cytotoxic long life T-cell in vivo. Among all known cancer antigens, the HER-2/neu protein demonstrates the advantage of being overexpressed in various types of cancer, while patients whose tumors overexpress the protein exhibit preexisting immunity against its peptides. HER-2/neu is a transmembrane protein that is overexpressed in cancer cells and therefore the perfect target for immunotherapy concerning both cellular and humoral immunity. Clinical studies using HER-2/neu peptides have shown induction of immune response in the majority of patients. However, metastatic tumors overexpressing HER-2/neu protein still remain incurable. As a result, there is ample need for respective new therapeutic strategies and at this point more potent immunogenic sequences of the protein are under investigation, as is the response of patients to those sequences, in hope of creating more specific anticancer therapies. Encapsulation of antigen into poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) microspheres has proven to induce potent and long lasting immune response. Up to date, there is no study analyzing the influence of PLGA polymer characteristics or the immunization scheme, regarding the type of the immune response following the administration of PLGA antigen microspheres in vivo. In the current study, the type of the immune response after in vivo administration of HER-2/neu peptide adsorbed on poly-lactic acid (PLA) and PLGA microspheres is investigated. The model antigens used were the following two: • GSPYVSRLLGICLTSTVQLVQL peptide corresponds to the 779-799 amino acid sequence of the HER-2/neu protein. This amino acid sequence contains the cytotoxic epitope CLTSTVQLV (789-797) in combination with the Th epitope GSPYVSRLLGICL (778-790) of the HER-2/neu protein. • CLTSTVQLV (789-797) peptide, which corresponds to merely the cytotoxic epitope. HHD transgenic mice expressing human HLA-A2.1 histocompatibility molecules were used as subjects, given the fact that the amino acid sequence chosen has derived from the human HER-2/neu protein. Converting the preexisting Th2 type of immune response, against soluble antigens expressed in tumors, to the Th1 type is extremely important in curing cancer. The production of antigen-specific CD8+ cytotoxic lymphocytes with the relevant helper T (CD4+) lymphocytes is believed to trigger the rejection of the tumor or the delay of its development. The type of the immune response was identified with immuno-analytic techniques developed for measuring the total amount of IgG immunoglobulins, and their isotypes (IgG1 and IgG2a). Moreover the type of the immune response has been determined at cellular level using proliferation assay and cytokine measurement assay, usually at cell culture supernatants but also in blood samples. For the peptide administration, PLA and PLGA microspheres were used. The antigen was administered in two different ways, either absorbed or adsorbed (just mixed). The in vivo administration of the peptide antigen just admixed with PLA microspheres induced potent immune response, comparable to that caused by the antigen administration using complete Freund’s adjuvant (CFA). Moreover, upon the analysis of the cytokine profile secreted from T lymphocytes of immunized mice, the PLA admixed peptide proved to induce a specific and potent Th1 immune response. The incubation time of the peptide with PLA microspheres had no implications to the immune response, therefore further simplifying future mass production of such vaccine types. The results extracted by this study justify further investigation of the in vivo experimental cancer models for inducing potent cellular immune response against cancer cells that overexpress the HER-2/neu protein by simply mixing the appropriate HER-2/neu peptide antigens with PLA microspheres.