Τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπινου περιφερικού αίματος, ανήκουν σε μία κατηγορία κυττάρων, τα οποία ονομάζονται επαγγελματίες φαγοκύτταρα και τα οποία είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη και θανάτωση των παθογόνων μικροοργανισμών (Bessler et al.2002). Από παλαιότερες έρευνες της ερευνητικής μας ομάδας, έχει δειχθεί η συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων FAK, Elk-1 και MAP κινασών στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας από τα εξειδικευμένα φαγοκύτταρα (πλασματοκύτταρα), που βρίσκονται στην αιμολέμφο της μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata. (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). Είναι επίσης γνωστό ότι κατά την κυτταροφαγία παράγονται διάφορες μορφές δραστικού οξυγόνου (ROS) και αζώτου (RNS), με κύριες το Η2Ο2 και ΝΟ αντίστοιχα. Οι παραγόμενες ROS και RNS συμμετέχουν ως μόρια μεταγωγής σήματος σε διάφορα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν την κυτταροφαγία από τα λευκοκύτταρα. Όμως τα βιβλιογραφικά δεδομένα στο πεδίο αυτό είναι λιγοστά. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η συμμετοχή των FAK, Elk-1, MAP κινασών και Η2Ο2 στην κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου καθώς και η αλληλεπίδραση μεταξύ των FAK, Elk-1, MAP κινασών και του Η2Ο2 που παράγεται από τα κύτταρα λόγω της παρουσίας των βακτηρίων E.coli και S.aureus. Με κυτταρομετρία ροής και τη χρήση του εξειδικευμένου φθοροχρώματος διυδροροδαμίνη (DHR), πιστοποιήθηκε η παραγωγή Η2Ο2 από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του αίματος, παρουσία E.coli και S.aureus. Η ενεργός συμμετοχή του παραγόμενου Η2Ο2 αποδείχτηκε όταν η μείωση της παραγωγής υπεροξεικών ανιόντων με τη χρήση του εξειδικευμένου αναστολέα Ν-εθυλεν-μαλεϊμίδιο (NEM), μείωσε την πρόσληψη βακτηρίων από τα κύτταρα. Η συμμετοχή των FAK και Elk-1 στην κυτταροφαγία ελέγχθηκε με καταστολή της γονιδιακής τους έκφρασης με τη χρήση μορίων siRNA, ενώ αντίστοιχα για τις MAP κινάσες χρησιμοποιήθηκαν αναστολείς της φωσφορυλίωσης τους, οι οποίοι καταστέλλουν την ενεργότητα τους. Με τη χρήση των ίδιων μεθόδων αναστολής για τα μόρια FAK, Elk-1 και MAPKs, μελετήθηκε και ο ρόλος τους στην παραγωγή Η2Ο2 κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου. Τέλος, ερευνήθηκε και ο ρόλος του Η2Ο2, σαν σηματοδοτικό μόριο κατά τη διαδικασία της κυτταροφαγίας, μελετώντας με ανάλυση κατά western, την επίδραση της αναστολής της παραγωγής του Η2Ο2, στην φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των MAP κινασών. / Neutrophil cells from human peripheral blood belong in a group of cells, that are called professional phagocytes and are responsible for the uptake and killing of pathogen microorganisms (Bessler et al.2002). Research data from our lab, has shown that the signaling molecules FAK, Elk-1 and MAP kinases participate in the regulation of phagocytosis from the phagocytes of the Mediterranean fly, C.capitata (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). It is also known, that during phagocytosis phagocytes produce different forms of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen species (RNS), mainly Η2Ο2 and ΝΟ, respectively. Produced ROS and RNS, act as signaling molecules in different intracellular signaling pathways that regulate phagocytosis in leykocytes. . In the present work, we examined the participation of FAK, Elk-1, MAPKs and Η2Ο2 in the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus and also the interaction between FAK, Elk- 1, MAPKs and Η2Ο2 that is produced from the cells, due to the presence of the bacteria E.coli and S.aureus. Using flow cytometry and the specialized fluorescent dye Dihydrorodamine-123 (DHR), we certified the production of Η2Ο2 from the human neutrophil cells, in the presence of E.coli and S.aureus. The participation of the produced Η2Ο2 was shown, when the reduction of the produced Η2Ο2 with the use of the inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), reduced the uptake of bacteria from the cells. The participation of FAK and Elk-1 in phagocytosis was examined by suppressing their expression with the use of siRNA molecules, while for the MAP kinases we used specific activation inhibitors. By using the same inhibitng methods for the molecules FAK, Elk-1 and MAPKs we studied their role in the production of Η2Ο2 during the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus from human neutrophil cells. Finally, by reducing the production of superoxide anions, thereby reducing the production of H2O2, by using the specific inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), we examined the expression of the phosphorylated forms of MAPKs, by western analysis, in human neutrophils in the presence of the bacteria E.coli and S.aureus.

Οι λοιμώξεις από διάφορους παθογόνους μικροοργανισμούς αποτελούν σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου. Η αυξημένη ευαισθησία των νεογνών σε βακτηριακές λοιμώξεις έχει αποδοθεί σε ανωριμότητα της έμφυτης ανοσίας. Θεωρείται ότι ένας από τους μηχανισμούς που ευθύνεται είναι η μειωμένη φαγοκυτταρική λειτουργία των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσουμε την φαγοκυτταρική ικανότητα των νεογνικών ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου και στο περιφερικό αίμα 3 ημέρες μετά τη γέννηση. Μέθοδος: Διερευνήσαμε την φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων σε μια ομάδα 42 νεογνών. Η in vitro φαγοκυτταρική δραστηριότητα υπολογίστηκε με βάση το Phagotest kit (Opregen Pharma, Heidelberg, Γερμανία) χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, η οποία εκτιμά την πρόσληψη E. Coli από τα φαγοκύτταρα, στον ομφάλιο λώρο και στο περιφερικό αίμα την τρίτη μέρα ζωής. Τυχαία επιλεγμένοι 15 ξένοι υγιείς ενήλικες συμπεριελήφθησαν στη μελέτη και αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου-controls. Αποτελέσματα: Η φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων στο αίμα του ομφάλιου λώρου ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη των ενηλίκων. Την 3η μεταγεννητική ημέρα η φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων είχε αυξηθεί σε σύγκριση με εκείνη στο αίμα του ομφάλιου λώρου και δεν διαφέρει σημαντικά από εκείνη των ενηλίκων. Η φαγοκυτταρική ικανότητα των μονοκυττάρων δεν διέφερε από αυτή των ενηλίκων, τόσο κατά τη γέννηση όσο και την τρίτη μεταγεννητική μέρα. Συμπέρασμα: Η μελέτη μας έδειξε ότι η πρόσληψη του E. Coli από τα φαγοκύτταρα είναι μειωμένη στα νεογνά (πρόωρα και τελειόμηνα) στη γέννηση, σε σύγκριση με τους ενήλικες. Αυτή η ατέλεια είναι παροδική, καθώς την 3η ημέρα μετά τη γέννησή η φαγοκυτταρική ικανότητα των νεογνών φτάνει στα επίπεδα των ενηλίκων. / Infections by a variety of pathogens are a significant cause of morbidity and mortality during perinatal period. The susceptibility of neonates to bacterial infections has been attributed to immaturity of innate immunity. It is considered that one of the impaired mechanisms is the phagocytic function of neutrophils and monocytes. The purpose of the present study was to investigate the phagocytic ability of neonates at birth and the third postnatal day. Methods: The phagocytic ability of neutrophils and monocytes of 42 neonates was determined using the Phagotest flow cytometry method, that assesses the intake of E. Coli by phagocytes, in cord blood and in peripheral blood 3 days after birth. Fifteen healthy adults were included in the study as controls. Results: The phagocytic ability of neutrophils in the cord blood of neonates was significantly reduced compared to adults. The 3rd postnatal day the reduction of phagocytic ability of neutrophils was no longer significant compared to adults. The phagocytic ability of monocytes did not show any difference from that of adults either at birth or the 3rd postnatal day. Conclusions: Our findings indicate that the intake of E. Coli by phagocytes is impaired at birth in both preterm and full term neonates compared to adults. This defect is transient, with the phagocytic ability in neonates reaching that of the adults 3 days after birth.