Οι λοιμώξεις από διάφορους παθογόνους μικροοργανισμούς αποτελούν σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου. Η αυξημένη ευαισθησία των νεογνών σε βακτηριακές λοιμώξεις έχει αποδοθεί σε ανωριμότητα της έμφυτης ανοσίας. Θεωρείται ότι ένας από τους μηχανισμούς που ευθύνεται είναι η μειωμένη φαγοκυτταρική λειτουργία των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσουμε την φαγοκυτταρική ικανότητα των νεογνικών ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου και στο περιφερικό αίμα 3 ημέρες μετά τη γέννηση. Μέθοδος: Διερευνήσαμε την φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων σε μια ομάδα 42 νεογνών. Η in vitro φαγοκυτταρική δραστηριότητα υπολογίστηκε με βάση το Phagotest kit (Opregen Pharma, Heidelberg, Γερμανία) χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής, η οποία εκτιμά την πρόσληψη E. Coli από τα φαγοκύτταρα, στον ομφάλιο λώρο και στο περιφερικό αίμα την τρίτη μέρα ζωής. Τυχαία επιλεγμένοι 15 ξένοι υγιείς ενήλικες συμπεριελήφθησαν στη μελέτη και αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου-controls. Αποτελέσματα: Η φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων στο αίμα του ομφάλιου λώρου ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη των ενηλίκων. Την 3η μεταγεννητική ημέρα η φαγοκυτταρική ικανότητα των ουδετερόφιλων είχε αυξηθεί σε σύγκριση με εκείνη στο αίμα του ομφάλιου λώρου και δεν διαφέρει σημαντικά από εκείνη των ενηλίκων. Η φαγοκυτταρική ικανότητα των μονοκυττάρων δεν διέφερε από αυτή των ενηλίκων, τόσο κατά τη γέννηση όσο και την τρίτη μεταγεννητική μέρα. Συμπέρασμα: Η μελέτη μας έδειξε ότι η πρόσληψη του E. Coli από τα φαγοκύτταρα είναι μειωμένη στα νεογνά (πρόωρα και τελειόμηνα) στη γέννηση, σε σύγκριση με τους ενήλικες. Αυτή η ατέλεια είναι παροδική, καθώς την 3η ημέρα μετά τη γέννησή η φαγοκυτταρική ικανότητα των νεογνών φτάνει στα επίπεδα των ενηλίκων. / Infections by a variety of pathogens are a significant cause of morbidity and mortality during perinatal period. The susceptibility of neonates to bacterial infections has been attributed to immaturity of innate immunity. It is considered that one of the impaired mechanisms is the phagocytic function of neutrophils and monocytes. The purpose of the present study was to investigate the phagocytic ability of neonates at birth and the third postnatal day. Methods: The phagocytic ability of neutrophils and monocytes of 42 neonates was determined using the Phagotest flow cytometry method, that assesses the intake of E. Coli by phagocytes, in cord blood and in peripheral blood 3 days after birth. Fifteen healthy adults were included in the study as controls. Results: The phagocytic ability of neutrophils in the cord blood of neonates was significantly reduced compared to adults. The 3rd postnatal day the reduction of phagocytic ability of neutrophils was no longer significant compared to adults. The phagocytic ability of monocytes did not show any difference from that of adults either at birth or the 3rd postnatal day. Conclusions: Our findings indicate that the intake of E. Coli by phagocytes is impaired at birth in both preterm and full term neonates compared to adults. This defect is transient, with the phagocytic ability in neonates reaching that of the adults 3 days after birth.

The human leukocyte antigen-G (HLA-G has been considered to be an important tolerogeneic molecule playing an essential role in maternal-fetal tolerance, which constitutes the perfect example of successful physiological immunotolerance of semi-allografts. In this context, we investigated the putative role of this molecule in the allogeneic hematopoietic cell transplantation setting. The percentage of HLA-G+ cells in peripheral blood of healthy donors and allo-transplanted patients was evaluated by flow cytometry. Their immunoregulatory and immunotolerogeneic properties were investigated in in vitro immunostimulatory and immunosuppression assays. Immunohistochemical analysis for HLA-G expression was performed in skin biopsies from allo-transplanted patients and correlated with the occurrence of graft-versus-host disease. We identified a CD14+ HLA-Gpos population with an HLA-DRlow phenotype and decreased in vitro immunostimulatory capacity circulating in peripheral blood of healthy individuals. Naturally occurring CD14+HLA-Gpos cells suppressed T cell responses and acted immunotolerogenic on T cells by rendering them hyporesponsive and immunosuppressive in vitro. After allogeneic hematopoietic cell transplantation, HLA-Gpos cells increase in blood. Interestingly, besides an increase of CD14+HLA-Gpos cells there was also a pronounced expansion of CD3+HLA-Gpos cells. Of note, CD3+HLA-Gpos and CD14+HLA-Gpos cells from transplanted patients were suppressive in in vitro lymphoproliferation assays. Furthermore, we found an upregulation of HLA-G expression in skin specimens from transplanted patients which correlated with graft-versus-host disease. Inflammatory cells infiltrating the dermis of transplanted patients were also HLA-Gpos. Here, we report the presence of naturally occurring HLA-Gpos monocytic cells with in vitro suppressive properties. HLA-G epressing regulatory blood cells were found in increased numbers after allogeneic transplantation. Epithelial cells in skin affected by graft-versus-host disease revealed elevated HLA-G expression. / Το ανθρώπινο λεμφοκυτταρικό αντιγόνο -G (HLA-G) θεωρείται ένα σημαντικό ανοσορρυθμιστικό μόριο, το οποίο κατέχει έναν πολύ σημαντικό ρόλο στην προαγωγή εμβρυο-μητρικής αντοχής, η οποία αποτελεί το ιδανικό παράδειγμα επιτυχούς φυσιολογικής ανοσοαντοχής του ημι-αλλομοσχεύματος. Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στη διερεύνηση του πιθανού ρόλου του μορίου HLA-G στην αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (άλλο-ΜΑΚ). Το ποσοστό των HLA-G+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων και των μεταμοσχευμένων ασθενών ελέγθηκε με κυτταρομετρία ροής. Ο ανοσορρυθμιστικός τους ρόλος και οι ανοσοκατασταλτικές τους ικανότητες ελέγθηκαν σε in vitro ανοσοδιεγερτικές και ανοσοκατασταλτικές δοκιμασίες. Ανοσοιστοχημική ανάλυση της έκφρασης του HLA-G πραγματοποιήθηκε σε δερματικές βιοψίες από άλλο-μεταμοσχευμένους ασθενείς και συσχετίστηκε με την εμφάνιση της νόσου του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή(GvHD). Ένας CD14+HLA-Gθετ πληθυσμός με HLA-DRlow φαινότυπο και μειωμένη in vitro ανοσοδιεγερτική ικανότητα ανιχνεύτηκε στο περιφερικό αίμα των υγιών ενηλίκων. Τα φυσικώς εμφανιζόμενα CD14+HLA-Gθετ κύτταρα κατέστειλαν τον Τ λεμφοκυτταρικό πολλαπλασιασμό και είχαν ανοσοκατασταλτική επίδραση στα Τ κύτταρα, μετατρέποντάς τα σε υπο-απαντητικά και ανοσοκατασταλτικά κύτταρα in vitro. Μετά την αλλογενή μεταμόσχευση, τα HLA-Gθετ κύτταρα αυξάνουν στο αίμα. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι πέραν της αύξησης των CD14+HLA-Gθετ κυττάρων παρατηρήθηκε επίσης μια ιδιαίτερη αύξηση των CD3+HLA-Gθετ κυττάρων στο αίμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα CD14+HLA-Gθετ και CD3+HLA-Gθετ κύτταρα των άλλο-μεταμοσχευμένων ασθενών ήταν ικανά να καταστέλλουν τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό in vitro. Επιπλέον ανιχνεύθηκε μια αύξηση της έκφρασης του HLA-G στις δερματικές βιοψίες των μεταμοσχευμένων ασθενών, η οποία συσχετίζονταν με τη νόσο GvHD. Τα φλεγμονώδη κύτταρα που είχαν διεισδύσει στο δέρμα των ασθενών ήταν επίσης HLA-G θετικά. Στη συγκεκριμένη εργασία αναφέρουμε την παρουσία φυσικώς εμφανιζόμενων HLA-Gθετ μονοκυττάρων με in vitro ανοσοκατασταλτικές ικανότητες. HLA-G εκφραζόμενα ρυθμιστικά κύτταρα ανιχνεύονται στο αίμα μετά τη μεταμόσχευση σε αυξημένους αριθμούς. Τα επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος που είναι προσβεβλημένο από τη νόσο GvHD εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του HLA-G.

Ο S. epidermidis αποτελεί κύριο μέλος της χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων του ανθρώπου, ενώ συνιστά ένα από τα συχνότερα παθογόνα που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς φέροντες προσθετικά υλικά. Κύριος λοιμογόνος παράγοντας του S. epidermidis είναι ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Διάφοροι πολυσακχαρίτες έχουν απομονωθεί από την εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis και έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό βιομεμβράνης καθώς και με την παθογόνο δράση τους. Ο πλέον μελετημένος και εδραιωμένος είναι ο ΡΙΑ, ενώ οι άλλοι πολυσακχαρίτες (PS/A ή PNSG ή PNAG και το SSA) απεδείχθησαν τελικώς ότι είναι ταυτόσημοι ή χημικώς ανάλογοι του ΡΙΑ. Ο ΡΙΑ είναι μία ομογλυκάνη αποτελούμενη από μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό και η σύνθεσή του ελέγχεται από ένζυμα που κωδικοποιούνται από τον icaADBC γενετικό τόπο. Η εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis περιέχει επίσης έναν πολυσακχαρίτη, τον 20-kDaPS, ο οποίος απομονώθηκε από ερευνητές του Πανεπιστημίου Πατρών και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, και είναι μερικώς θειωμένος. Ο 20-kDaPS αντιορός αναστέλλει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εμφάνιση βακτηριακής κερατίτιδας σε κουνέλια. Με βάση αναλύσεις κλινικών στελεχών, ο 20-kDaPS εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στελεχών S. epidermidis, ενώ δεν ανευρέθηκε σε στελέχη άλλων πηκτάση αρνητικών σταφυλοκόκκων. Η παρεμβολή αλληλουχιών εισδοχής σε διάφορα σημεία του icaADBC οπερονίου, το οποίο ελέγχει τη σύνθεση του ΡΙΑ, δεν παρεμβάλλεται στην έκφραση του 20-kDaPS. Η κατεργασία βακτηριακών κυττάρων S. epidermidis με το ένζυμο dispersin B, το οποίο διασπά ειδικά τον β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό που συνθέτει το πολυμερές του ΡΙΑ, και με μετα-περιοδικό νάτριο που διασπά το δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα C-3 και C-4 των μονομερών Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, οδηγεί σε διάσπαση της βιομεμβράνης, χωρίς όμως να διαφοροποιείται αντιγονικά ο 20-kDaPS. Τα κλάσματα, μετά την έκλουση της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis από στήλη Q-Sepharose, που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ανοσοδραστικότητα για τον ΡΙΑ, στερούνται πλήρως 20-kDaPS. Η προεπώαση κλινικού στελέχους που δεν εκφράζει τον 20-kDaPS με τον πολυσακχαρίτη αναστέλλει την ενδοκυττάρωση, ενώ η προεπώαση του πρότυπου στελέχους ATCC35983 που συνθέτει τον 20-kDaPS με ειδικό αντιορό ενισχύει την ενδοκυττάρωση από τα ανθρώπινα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, ο icaADBC γενετικός τόπος δεν εμπλέκεται στη σύνθεση του 20-kDaPS. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του PIA και του 20-kDaPS είναι διακριτές. Ο 20-kDaPS πιθανό να επιδεικνύει αντιφαγοκυτταρική δράση, ενώ τα ειδικά αντισώματα έχουν δράση οψωνίνης. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεμβράνης προστατεύει από τις αντιμικροβιακές ουσίες και το σύστημα ανοσίας. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης περιέχουν στην εξωκυττάρια ουσία τους μεγαλύτερα ποσά ΡΙΑ από τα ελεύθερα αναπτυσσόμενα, πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επιδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα για προσκόλληση και επιβίωση εντός των ανθρώπινων μακροφάγων από τα πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επάγουν την παραγωγή μικρότερων ποσών φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, καθώς και Th1 κυτταροκινών, όπως οι IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, ενώ ενισχύουν τις IL-8, GM-CSF και IL-13. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις αφορούν ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς και βακτηριακά κύτταρα μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη. Τα ανωτέρω δεδομένα συνάδουν με την ήπια συμπτωματολογία των σχετιζόμενων με βιομεμβράνη λοιμώξεων S. epidermidis και τη διαφυγή της επιτήρησης του ανοσολογικού συστήματος. Συμπερασματικά, ο 20-kDaPS αποτελεί κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis με αντιφαγοκυτταρικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του 20-kDaPS είναι πλήρως διακριτές του ΡΙΑ, του κύριου πολυσακχαρίτη που σχετίζεται με το σχηματισμό βιομεμβράνης, ενώ ο γενετικός τόπος icaADBC δε ρυθμίζει τη σύνθεση του 20-kDaPS. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεβράνη εξασφαλίζει αντίσταση στην ενδοκυττάρια θανάτωσή τους από τα μακροφάγα και καταστολή της ανοσιακής απόκρισης. / The skin commensal and opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis is a leading cause of hospital-acquired and biomaterial-associated infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA), a homoglycan composed of β-1,6-linked N-acetylglucosamine residues, synthesized by enzymes encoded by the icaADBC operon is a major functional factor in biofilm accumulation, promoting virulence in experimental biomaterial-associated S. epidermidis infections. Extracellular mucous layer extracts of S. epidermidis contain another major polysaccharide, referred to as 20-kDa polysaccharide (20-kDaPS), composed mainly out of glucose, N-acetylglucosamine, and being partially sulfated. 20-kDaPS antiserum prevents adhesion of S. epidermidis on endothelial cells and development of experimental keratitis in rabbits. Here we provide experimental evidence that 20-kDaPS and PIA represent distinct molecules and that 20-kDaPS is implicated in endocytosis of S. epidermidis bacterial cells by human monocyte-derived macrophages. Analysis of 75 clinical coagulase-negative staphylococci from blood-cultures and central venous catheter tips indicated that 20-kDaPS is expressed exclusively in S. epidermidis but not in other coagulase-negative staphylococcal species. Tn917-insertion in various locations in icaADBC in mutants M10, M22, M23, and M24 of S. epidermidis 1457 are abolished for PIA synthesis, while 20-kDaPS expression appears unaltered as compared to wild-type strains using specific anti-PIA and anti-20-kDaPS antisera. While periodate oxidation and dispersin B treatments abolish immuno-reactivity and intercellular adhesive properties of PIA, no abrogative activity is exerted towards 20-kDaPS immunochemical reactivity following these treatments. PIA polysaccharide I-containing fractions eluted from Q-Sepharose were devoid of detectable 20-kDaPS using specific ELISA. Preincubation of non-20-kDaPS-producing clinical strains with increasing amounts of 20-kDaPS inhibits endocytosis by human macrophages, whereas, preincubation of 20-kDaPS-producing strain ATCC35983 with 20-kDaPS antiserum enhances bacterial endocytosis by human macrophages. In conclusion, icaADBC is not involved in 20-kDaPS synthesis, while the chemical and chromatographic properties of PIA and 20-kDaPS are distinct. 20-kDaPS exhibits anti-phagocytic properties, whereas, 20-kDaPS antiserum may have a beneficial effect on combating infection by 20-kDaPS-producing S. epidermidis. As stated above, biofilm formation is a major virulence factor of S. epidermidis. Biofilm protects bacterial cells from antimicrobial agents and components of the immune system. Interactions of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages with planktonic or biofilm phase S. epidermidis cells were also studied. Biofilm phase bacteria exhibited higher attachment, as well as, a ten fold higher intracellular survival in monocyte-derived macrophages than their planktonic counterparts. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages was performed with live or formalin-fixed bacterial cells. Supernatant concentration of selected cytokines was measured by Luminex® xMAP™ technology at different time points. As compared to planktonic phase, biofilm phase bacteria elicited lower amounts of proinflammatory cytokines and Th1 response cytokines, such as TNFα, IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, whereas, they enhanced production of IL-8, GM-CSF and IL-13. This phenomenon was independent of formalin pretreatment. Taken together, these results may contribute to interpretation of observed silent course of biofilm associated infections. In conclusion, 20-kDaPS represents a major component of S. epidermidis extracellular matrix and data show that 20-kDaPS posseses antiphagocytic and immunomodulatory properties. 20-kDaPS and PIA are immunochemically and chromatographically discrete molecules, whereas icaADBC locus is not involved in 20-kDaPS synthesis. Biofilm mode of growth ensures higher resistance rates to intracellular killing and down regulation of immune responses.