- / -

Τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπινου περιφερικού αίματος, ανήκουν σε μία κατηγορία κυττάρων, τα οποία ονομάζονται επαγγελματίες φαγοκύτταρα και τα οποία είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη και θανάτωση των παθογόνων μικροοργανισμών (Bessler et al.2002). Από παλαιότερες έρευνες της ερευνητικής μας ομάδας, έχει δειχθεί η συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων FAK, Elk-1 και MAP κινασών στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας από τα εξειδικευμένα φαγοκύτταρα (πλασματοκύτταρα), που βρίσκονται στην αιμολέμφο της μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata. (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). Είναι επίσης γνωστό ότι κατά την κυτταροφαγία παράγονται διάφορες μορφές δραστικού οξυγόνου (ROS) και αζώτου (RNS), με κύριες το Η2Ο2 και ΝΟ αντίστοιχα. Οι παραγόμενες ROS και RNS συμμετέχουν ως μόρια μεταγωγής σήματος σε διάφορα ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν την κυτταροφαγία από τα λευκοκύτταρα. Όμως τα βιβλιογραφικά δεδομένα στο πεδίο αυτό είναι λιγοστά. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η συμμετοχή των FAK, Elk-1, MAP κινασών και Η2Ο2 στην κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου καθώς και η αλληλεπίδραση μεταξύ των FAK, Elk-1, MAP κινασών και του Η2Ο2 που παράγεται από τα κύτταρα λόγω της παρουσίας των βακτηρίων E.coli και S.aureus. Με κυτταρομετρία ροής και τη χρήση του εξειδικευμένου φθοροχρώματος διυδροροδαμίνη (DHR), πιστοποιήθηκε η παραγωγή Η2Ο2 από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του αίματος, παρουσία E.coli και S.aureus. Η ενεργός συμμετοχή του παραγόμενου Η2Ο2 αποδείχτηκε όταν η μείωση της παραγωγής υπεροξεικών ανιόντων με τη χρήση του εξειδικευμένου αναστολέα Ν-εθυλεν-μαλεϊμίδιο (NEM), μείωσε την πρόσληψη βακτηρίων από τα κύτταρα. Η συμμετοχή των FAK και Elk-1 στην κυτταροφαγία ελέγχθηκε με καταστολή της γονιδιακής τους έκφρασης με τη χρήση μορίων siRNA, ενώ αντίστοιχα για τις MAP κινάσες χρησιμοποιήθηκαν αναστολείς της φωσφορυλίωσης τους, οι οποίοι καταστέλλουν την ενεργότητα τους. Με τη χρήση των ίδιων μεθόδων αναστολής για τα μόρια FAK, Elk-1 και MAPKs, μελετήθηκε και ο ρόλος τους στην παραγωγή Η2Ο2 κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli και S.aureus από τα ουδετερόφιλα κύτταρα του ανθρώπου. Τέλος, ερευνήθηκε και ο ρόλος του Η2Ο2, σαν σηματοδοτικό μόριο κατά τη διαδικασία της κυτταροφαγίας, μελετώντας με ανάλυση κατά western, την επίδραση της αναστολής της παραγωγής του Η2Ο2, στην φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) των MAP κινασών. / Neutrophil cells from human peripheral blood belong in a group of cells, that are called professional phagocytes and are responsible for the uptake and killing of pathogen microorganisms (Bessler et al.2002). Research data from our lab, has shown that the signaling molecules FAK, Elk-1 and MAP kinases participate in the regulation of phagocytosis from the phagocytes of the Mediterranean fly, C.capitata (Lamprou et al. 2007, Mamali et al. 2008). It is also known, that during phagocytosis phagocytes produce different forms of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen species (RNS), mainly Η2Ο2 and ΝΟ, respectively. Produced ROS and RNS, act as signaling molecules in different intracellular signaling pathways that regulate phagocytosis in leykocytes. . In the present work, we examined the participation of FAK, Elk-1, MAPKs and Η2Ο2 in the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus and also the interaction between FAK, Elk- 1, MAPKs and Η2Ο2 that is produced from the cells, due to the presence of the bacteria E.coli and S.aureus. Using flow cytometry and the specialized fluorescent dye Dihydrorodamine-123 (DHR), we certified the production of Η2Ο2 from the human neutrophil cells, in the presence of E.coli and S.aureus. The participation of the produced Η2Ο2 was shown, when the reduction of the produced Η2Ο2 with the use of the inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), reduced the uptake of bacteria from the cells. The participation of FAK and Elk-1 in phagocytosis was examined by suppressing their expression with the use of siRNA molecules, while for the MAP kinases we used specific activation inhibitors. By using the same inhibitng methods for the molecules FAK, Elk-1 and MAPKs we studied their role in the production of Η2Ο2 during the phagocytosis of bacteria E.coli and S.aureus from human neutrophil cells. Finally, by reducing the production of superoxide anions, thereby reducing the production of H2O2, by using the specific inhibitor Ν-etheylen-maleimide (NEM), we examined the expression of the phosphorylated forms of MAPKs, by western analysis, in human neutrophils in the presence of the bacteria E.coli and S.aureus.

- / -

Τα Gram αρνητικά βακτήρια είναι οι κύριοι αιτιολογικοί παράγοντες της περιοδοντικής νόσου, όπως τα βακτήρια Porphyromonas gingivalis, Actinοbacillus actinomycetemcomitans και Bacteroides forsythus. Σκοπός της εργασίας είναι η μοριακή ανίχνευση και ταυτοποίηση των βακτηρίων αυτών, σε δείγματα ασθενών με περιοδοντίτιδα, μέσω εντοπισμού ειδικών αλληλουχιών του DNA του γονότυπου κάθε παθογόνου. Τα δείγματα συλλέγονται σε PBS και DNA παρασκευάζεται με το QIAmp Tissue kit (Qiagen). Η μοριακή ανάλυση γίνεται με PCR και multiplex PCR, με ένα εκκινητή ειδικό για κάθε βακτήριο και ένα κοινό για τα τρία βακτήρια, για ειδική αλληλουχία του γονιδίου 16S rRNA.Το αποτέλεσμα της PCR ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση αγαρόζης 2%.Η ταυτοποίηση του προϊόντος της PCR γίνεται με κατάτμηση του γενετικού υλικού με ειδικά ένζυμα περιορισμού. Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας της μεθόδου γίνεται με συνεχείς αραιώσεις του DNA για κάθε βακτήριο και PCR.Εξετάστηκαν 42 δείγματα οδοντικής πλάκας. Τα εξεταζόμενα παθογόνα βακτήρια ανιχνεύτηκαν σε 40 δείγματα, εκ των οποίων: 15 περιέχουν τη Porphyromonas gingivalis, 6 τον Actinοbacillus actinomycetemcomitans και 19 το Bacteroides forsythus. Σε 5 δείγματα συνυπάρχουν τα βακτήρια Porphyromonas gingivalis και Bacteroides forsythus, ενώ σε 4 η Porphyromonas gingivalis και ο Actinοbacillus actinomycetemcomitans. Η μεθοδολογία αυτή παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα καθότι δεν ανιχνεύεται μη ειδικό προϊόν PCR και υψηλή ευαισθησία, με το χαμηλότερο όριο ανίχνευσης για το Porphyromonas gingivalis είναι 280 pgr/αντίδραση και για το Actinοbacillus actinomycetemcomitans, 120 pgr/αντίδραση. Η υψηλή αποτελεσματικότητα, ειδικότητα και ευαισθησία μεθόδου, σε συνδυασμό με τον μικρό χρόνο ανάλυσης, καθιστούν τη μοριακή ανίχνευση και ταυτοποίηση των περιοδοντικά παθογόνων βακτηρίων αποτελεσματικότερη, σε σχέση με τις συμβατικές μεθόδους. / Gram- bacteria are the main aetiological factors for periodontal disease(i.e.Porphyromonas gingivalis, Actinοbacillus actinomycetemcomitans και Bacteroides forsythus). The aim of this study is the molecular identification of these bacterias in samples of patients with periodontal disease. The molecular analysis is performed with PCR and multiplex PCR.42 samples with dental plague were evaluated. The pathogenic bacterias were found in 40 of these samples. The great efficacy, sensitivity and speciality of the method make the molecular identification of the periodontal pathogenic bacteria more useful than the conventional methods.

Στόχος της εργασίας αυτής είναι η καταγραφή και αξιολόγηση της ποιότητας δέκα παραλιών του νομού Αχαΐας, καθώς και η σύγκριση των μικροβιολογικών και γεωλογικών στοιχείων που διεξάγονται μέσω μηνιαίων επαναλαμβανόμενων δειγματοληψιών και αναλύσεων. Εβδομήντα δείγματα άμμου συλλέχθηκαν μηνιαία, σε χρονικό διάστημα επτά μηνών και ακολούθησαν αναλύσεις όσον αφορά τα εξής βακτήρια: ολικά κολοβακτηριοειδή, e.coli και εντερόκοκκους. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν γεωλογικές αναλύσεις των δειγμάτων, όσον αφορά το μέγεθος των κόκκων, την σφαιρικότητα, την στρογγύλωση καθώς και τον υπολογισμό των στατιστικών τους παραμέτρων. / The aim of this paper is to record and evaluate the quality of ten beaches of Achaia, and to compare the microbiological and geological data held by recurring monthly sampling and analysis. Seventy samples of sand were collected monthly, over a period of seven months, followed by analyzes of the following bacteria: total coliforms, e.coli and enterococci. Furthermore, a geological analysis of the samples for grain size, the sphericity and the calculation of statistical parameters.