Ο καρκίνος του προστάτη, αποτελεί ένα από τα σπουδαιότερα προβλήματα υγείας και συγκεκριμένα την τρίτη πιο συχνή αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες. Ο υποδοχέας ανδρογόνων είναι ένας σημαντικός μοριακός στόχος στη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη. Η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών προστατικών κυττάρων εξαρτώνται από τη δράση των ανδρογόνων, τουλάχιστον κατά τα πρώιμα στάδια της νόσου. Λόγω αυτής της εξάρτησης, η αποστέρηση των ανδρογόνων αποτελεί την αρχική μέθοδο φαρμακολογικής παρέμβασης για την αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, παρά την αρχική αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης στην καταστολή του όγκου, εκείνος επανακάμπτει εντός δύο ή τριών ετών και εξακολουθεί να αναπτύσσεται ανεξάρτητα από την ύπαρξη ανδρογόνων. Οι υπάρχουσες θεραπευτικές προσεγγίσεις αδυνατούν να προλάβουν την επανεμφάνιση του όγκου. Προς αυτήν την κατεύθυνση, η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων με αποτελεσματικότερη αντιανδρογόνο δράση, θα είχε σημαντική αξία στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Πρόσφατα, στεροειδικά παράγωγα, τα οποία έφεραν έναν εξαμελή λακταμικό δακτύλιο στη θέση-20 του στεροειδικού σκελετού εμφάνισαν ανασταλτική δράση έναντι του ανδρογονικού υποδοχέα καθώς και έναντι του πολλαπλασιασμού καρκινικών προστατικών κυττάρων. Επίσης, παράλληλες μελέτες της ερευνητικής ομάδας μας έχουν δείξει ότι τροποποιημένα στεροειδικά παράγωγα που έφεραν είτε ενδοκυκλική λακταμική ή εξωκυκλική αμιδική -NHCO- ομάδα, έχουν εμφανίσει εξαιρετική δράση έναντι αιματολογικών νεοπλασιών. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων 20-αμινοστεροειδών. Συγκεκριμένα επιτεύχθηκε η σύνθεση νέων μορίων που φέρουν ως κύρια δομικά χαρακτηριστικά έναν επταμελή λακταμικό Α-στεροειδικό δακτύλιο και ένα αμινο-υποκατεστημένο στερεογονικό κέντρο (C-20). Το συνθετικό σχήμα που ακολουθήθηκε, περιελάμβανε αρχικά τη διεύρυνση του Α-στεροειδικού δακτυλίου της πρεγνενολόνης μέσω μετάθεσης Beckmann της αντίστοιχης 3-κετοξίμης σε επταμελή λακταμικό δακτύλιο και μετέπειτα τη διαστερεοεκλεκτική μετατροπή της 20-κετο-ομάδας σε αμινο-υποκατεστημένο στερεογονικό κέντρο μέσω νουκλεόφιλης προσθήκης οργανομαγνησιακού αντιδραστηρίου στην αντίστοιχη ενδιάμεση Ν-[t-butyl-σουλφινυλ]-20-ιμίνη. Κατά την εξέλιξη της συνθετικής πορείας διερευνήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν οι πειραματικές συνθήκες των επιμέρους σταδίων. Η αποτίμηση της βιολογικής δράσης των νέων 20-αμινοστεροειδών αναμένεται να αποσαφηνίσει κατά πόσο οι παραπάνω δομικές τροποποιήσεις μπορούν να συμβάλλουν στην εκδήλωση αντιανδρογόνου και αντικαρκινικής δράσης. Παράλληλα, ο στεροειδικός σκελετός των νέων μορίων είναι εφικτό να οδηγήσει σε νέα τροποποιημένα παράγωγα για την εξαγωγή σχέσεων χημικής δομής-βιολογικής δραστικότητας. / Prostate cancer is one of the most important health problems and specifically the third most common cause of death because of cancer in men. The androgen receptor is an important molecular target for the treatment of prostate cancer. The survival and the proliferation of cancer prostatic cells depend on the action of androgens, at least at the early stages of the disease. Because of this dependency, androgen deprivation is the initial method in the pharmacological intervention for the treatment of prostate cancer. However, despite the initial effectiveness of this approach in tumor suppression, the tumor relapses within two or three years and continues to grow regardless the presence of androgens. The existing therapeutic approaches fail to prevent the revival of the tumor. Toward this direction, the development of new therapeutic agents with more effective antiandrogen activity, would have significant value in the treatment of prostate cancer. Recently, steroid derivatives, which carried a six membered lactam ring at C-20 of the steroid skeleton, exhibited inhibitory activity against the androgen receptor and also against the proliferation of prostate cancer cells. Furthermore, parallel studies of our research group have shown that modified steroid derivatives which carried either a lactam or an amide-NHCO-group, have shown excellent activity against haematological malignancies. Based on these data, in this study the design and synthesis of new 20-aminosteroid was achieved. Specifically we achieved the synthesis of new molecules bearing as main structural features one seven membered lactam A-steroid ring and an amino-substituted stereogenic center (C-20). The synthetic approach used, initially involved the pregnenolone A-steroidal ring expansion to a seven membered lactam ring via Beckmann rearrangement of the corresponding 3-ketoxime and then the diastereoselective conversion of the 20-keto group to an amino-substituted stereogenic center via nucleophilic addition of organometallic reagent to the corresponding intermediate N-[t-butyl-sulfinyl]-20-imine. During this process, the experimental conditions of the intermediate synthetic steps were investigated and optimized. The biological evaluation of the new 20-aminosteroids is expected to unravel whether these structural modifications may contribute to antiandrogenic and anticancer activity. Meanwhile, the steroidal skeleton of the new molecules may lead to the development of new modified derivatives for further structure-activity relationship studies.

Εστιάζοντας στα αποτελέσματα προσφάτων μελετών, οι οποίες είχαν ως θέμα τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της χημικής δομής και της αντιλευχαιμικής δράσης, προκύπτει ότι το στεροειδικό τμήμα των ενώσεων που περιέχουν αλκυλιωτικούς παράγοντες, δεν αποτελεί μόνο τον βιολογικό φορέα των αλκυλιωτικών παραγόντων. Ο σχεδιασμός και η μελέτη παρόμοιων ενώσεων, οι οποίες έφεραν στη θέση 7 του στεροειδικού σκελετού μία αλλυλική κετόνη, παρουσίασαν μία σημαντικά αυξημένη αντιλευχαιμική δραστικότητα συγκριτικά με παράγωγα που περιείχαν στο μόριό τους έναν απλό στεροειδικό σκελετό. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσο η βελτίωση της αντιλευχαιμικής οφειλόταν στην εισαγωγή της 7-κετόνης ή του Δ5-7-κετο στεροειδικού συστήματος, αναγάγαμε το διπλό δεσμό στη θέση 5 του στεροειδούς. Τα 5α-7-κετο στεροειδικά παράγωγα που προέκυψαν κατά την αναγωγή του διπλού δεσμού χρησιμοποιήθηκαν αρχικά για τη σύνθεση των στεροειδικών εστέρων της χλωραμβουκίλης και του φαινυλοξικού οξέος και ακολούθως μελετήθηκε η in vivo αντιλευχαιμική τους δράση έναντι της λευχαιμίας Ρ388. Τέλος, η αναγωγή του διπλού δεσμού αποδείχθηκε να έχει αρνητική επίδραση στην αντιλευχαιμική δράση, αφού η συγκριτική μελέτη με τα πρωτότυπα μόρια έδειξε πως οι πολύ δραστικοί Δ5-7-κετο στεροειδικοί εστέρες με την αναγωγή του διπλού δεσμού μετατράπηκαν σε ενώσεις με αμελητέα αντιλευχαιμική δράση. / Recent structure-antileukemic activity studies showed that the steroidal part of complex molecules containing DNA alkylators does not play only the role of the “biological carrier”. New such compounds designed to possess an allylic 7-ketone showed enhanced antileukemic potency compared with derivatives with a simple steroidal skeleton. In order to investigate whether the enhancement of the antileukemic potency is attributed to the introduction of the 7-ketone or to the Δ5-7-keto conjugated steroidal system we decided to reduce the Δ5 double bond. The 5α-7-keto-steroidal skeletons synthesized were tethered to chlorambucil and phenyl acetic acid’s nitrogen mustard and studied against leukemia P338 in vivo. The reduction of the double bond had a negative impact on the antileukemic potency since the comparative study of the novel derivatives showed that a series of very potent Δ5-7-keto-steroidal esters were converted by this modification to compounds with marginally accepted activity.

Είναι ευρέως γνωστό από παλιά ότι οι μουστάρδες του αζώτου όταν είναι συνδεδεμένες μέσω ενός εστερικού δεσμού με ένα στεροειδές μόριο ή με ένα τροποποιημένο στεροειδές, τότε εμφανίζουν μικρότερη τοξικότητα και καλύτερη αντινεοπλασματική δράση. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε το ρόλο του στεροειδικού μορίου στην έκφραση της αντιλευχαιμικής ενεργότητας, επανασυνθέσαμε 16 ανάλογα της μουστάρδας 4-Μe-CABA και τα εξετάσαμε στη λευχαιμία Ρ388 in vivo και σε φυσιολογικά ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro. H πλειοψηφεία των εξεταζόμενων ενώσεων εμφάνισε χαμηλή τοξικότητα-χαμηλότερη τοξικότητα από αυτήν της μουστάρδας- ενώ η αντιλευχαιμική δράση αυξήθηκε σημαντικά. Όσον αφορά στις τροποποιήσεις αποδείχτηκε για μια ακόμη φορά ότι η ύπαρξη της ΝΗ-CΟ ομάδας ως εξωκυκλικό αμίδιο συνεισεφέρει σημαντικά στην δράση του μορίου μόνο όμως όταν βρίσκεται σε β-διαμόρφωση. Η μετατροπή του Β αλλά και του D στεροειδικού σκελετού σε λακταμικό ενίσχυσε την αντιλευχαιμική δράση των μορίων. Επίσης τα 7-οξειδωμένα παράγωγα αποδείχτηκαν καλύτερα από τα μη οξειδωμένα ανάλογα. Τα ευρήματα μας υποστηρίζουν ότι το στεροειδικό κομμάτι αυτών των ενώσεων δεν είναι μία απλή βιολογική πλατφόρμα όπως εικαζόταν για χρόνια. / It is commonly known that nitrogen mustards when conjugated with steroids or modified steroids via esteric bond show low toxicity and better antileukemic activity. In order to confirm the role of the steroidal moiety on the expression of anti-leukemic activity we re-synthesized 15 derivatives of the 4-Μe-CABA mustard and tested them on leukaemia P388 in vivo and in normal human lymphocytes in vitro.The majority of the tested compounds showed low toxicity while the measured antileukemic potency was significantly increased.As far as the modifications that were tested, once more it was proved that the existence of the ΝΗ-CΟ moiety when out of the ring as an amidic group contributes significantly to the activity of the molecule only if it is at axial conformation. The lactamization of the B-steroidal ring as well as the lactamization of the D-steroidal ring rendered the molecule more potent. Furthermore the 7-oxidized derivatives proved better than the non-7-oxidized derivatives. Our findings support the notion that the steroidal part of these molecules is not just a simple biological platform as has been speculated for years.

Περιγράψαμε την Διαταραχή Μεταγωγής Σήματος Αυξητικής Ορμόνης (GHTD), σε παιδιά με σοβαρή καθυστέρηση ανάπτυξης, φυσιολογική έκκριση αυξητικής ορμόνης (GH), χαμηλό IGF-I αλλά φυσιολογική ανταπόκριση IGF-I σε χορήγηση hGH, που παρουσιάζουν ελαττωματική φωσφορυλίωση του STAT3. Η διαταραχή θεραπεύεται με hGH. Οι CIS πρωτεΐνες είναι αρνητικοί ρυθμιστές του σηματοδοτικου μονοπατιού της GH που ανταγωνίζονται STATs για θέση πρόσδεσης με τον υποδοχέα GHR ή συμμετέχουν στην αποδόμηση του JAK2/GHR μέσω ουβυκουιτίνης/προτεασώματος. Η αδυναμία φωσφορυλίωσης του STAT3 και JAK2 φαινεται να προσπερνάται με χρήση εναλακτικής οδου. Με ‘διασυνομιλία’ της GH με το μονοπάτι του EGF. Συγκεκριμένα η GH φωσφωρυλιώνει το EGFR μέσω φωσφορυλίωσης JAK2. Τέλος, η φωσφορυλίωση STAT3 προκαλείται και από την 17β-οιστραδιόλη. Υπάρχει μία κλινική οντότητα της “καθυστέρησης της ήβης και ανάπτυξης” όπου γίνεται σημαντική επιτάχυνση στην ανάπτυξη μετά την εφηβεία όπου υπάρχει φυσιολογικό τελικό ανάστημα που ταιριάζει με την πορεία ενός ασθενή. Σκοπός: Μελετήθηκε η αρνητική ρύθμιση της GH σε ινοβλάστες παιδιών με GHTD και φυσιολογικών. Στη συνέχεια, η πιθανή συσχέτιση του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH και EGF στα παιδιά και τέλος η πιθανή συσχέτιση των στερεοειδών του φύλου με το GH άξονα σε ένα GHTDπαιδί . Yλικά/μέθοδοι: Σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών ούλων μαρτύρων και GHTD παιδιών μελετήσαμε την έκφραση και ενεργοποίηση της CIS και JAK2, με επαγωγή με hGH, με Western blot. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση του EGF και pEGF στα κύτταρα των παιδιών και μαρτύρων με επαγωγή των κυττάρων με GH και EGF έλεγχος με Western blot και coimmunoprecipitation. Τέλος μελετήθηκε η φωσφoρυλίωση STAT3 και JAK2 σε ινοβλαστες (προεφηβικούς και εφηβικούς) του ασθενή με GH και 17-β οιστραδιόλη με Western immunoblotting. Αποτελέσματα: Η έκφραση του CIS με 200 ng/ml hGH έδειξε μόνο στους ασθενείς αύξηση της συνολικής CIS και της ουβικουτινυλιομενής μορφής της. Η έκφραση και ενεργοποίηση τoυ JAK2 μόνο στους ασθενείς με επαγωγή με hGΗ δείχνει καθυστερημένη ενεργοποίηση του. Το STAT3 φωσφωρυλιώνεται φυσιολογικά με επαγωγή των κυττάρων των ασθενών με EGF όχι με GH. Οι pEGFRs φωσφωρυλιώνουν φυσιολογικά το JAK2 στους ασθενείς, ενώ όχι στους μάρτυρες. Ο ένας ασθενής προεφηβικά δε φωσφωρυλιώνει το STΑT3 με GH. Εμφανίζει την ουβικουτινιλιωμένη μορφή του CIS. Δεν φωσφωρυλιώνει το STAT3 με 17β-οιστραδιόλη προ-εφηβικά, και εμφανίζει την ουβικουτινιλιωμένη μορφή του CIS. Ενώ εφηβικά φωσφορυλιώνει το STAT3 με 17β-οιστραδιόλη και δεν εμφανίζει την ουβικουτινιλιωμένη μορφή του CIS. Συμπεράσματα: Βρέθηκε καθυστερημένη ενεργοποίηση του GH άξονα σε 2 ασθενής με GHTD μαζί με υπερέκφραση της CIS και ουβικουτινυλιομενής CIS. Η σηματοδότηση της GH γίνεται φυσιολογικά στους μάρτυρες άρα δεν υπάρχει λόγος εναλλακτικής οδού, σε αντίθεση με ασθενείς που χρειάζεται να χρησιμοποιήσουν το μονοπάτι του EGF. Ο ένας ασθενής ξεπέρασε την αδυναμία να φωσφορυλιώσει το STAT3 χωρίς hGH αλλά με την έναρξη της εφηβείας. Ένας λόγος που το παιδί αυτό έδειξε σημαντική επιτάχυνση στην ανάπτυξη είναι ότι μετά την εφηβεία δεν υπήρχε υπερλειτουργία του ανασταλτικού μηχανισμού της GH, διαμέσου του Ub CIS. / We have previously described a new disorder (GHTD) in 4 children with growth delay, normal provoked and spontaneous GH secretion, and low IGF-I concentrations but normal IGF-I generation test results who have a defect in the phosphorylation of the signal transducer and activator of transcription STAT-3. These children respond with a significant increase in their growth velocity after administration of hGH. CIS proteins are inhibitors of the GH signal transduction pathway, by distinct mechanisms: by competition with STATs for common tyrosine-binding sites on the cytoplasmic tail of GHR or by a proteasome-dependent mechanism. Monoubiquitinated form of CIS protein was observed in 2 GHTD patients.Also STAT3 phosphorylation defect could be overcomed by using an alternative pathway the one of Epidermal Growth factor (EGF). Also in one patient its STAT3 defect was overcomed when he entered puberty, sex steroids may enhanced his growth. Objective: The purpose of the study was the characterization of the molecular mechanisms involved in GH signal transduction pathway in GHTD patients, as a possible cause of an increased expression of its inhibitors. Also to search if there is a possible crosstalk between GH and EGF growth transduction pathways. And finally the role of sex steroids in GH signalling in one GHTD patient. Patients/Material and Methods: In primary fibroblast cell cultures from gingival biopsies of the GHTD patients and age-matched normal children we studied: expression analysis, in cells inducted with GH, of CIS and JAK2 phosphorylationby western immunoblotting and RT-PCR. Also the cells of the same children and controls were inducted with EGF and STAT3 phosphorylation was studied. Finally the cells of one of the patients were inducted with GH and 17β-estradiole before and after puberty and its STAT3 phosphorylation and CIS expression were studied. Results: Expression analysis in the childrens’ fibroblasts showed an overexpression of CIS in 2 patients as compared to normal children. STAT3 defect was not present in the patients fibroblasts that were inducted with EGF. Also one GHTD patient that he couldn't phosphorylate in his inducted fibroblast with GH and 17-b estardiole STAT3 and ubiquitinated CIS was present to his cells before puberty this defect was overcomed after he entered puberty. Conclusions: The overexpression of CIS may inhibit the activation of STAT3 and may be involved in the pathogenesis of the severe short stature of the GHTD children. Also GH signalling pathway has no defect in control patients so there is no need of using an alternative pathway such as the one of EGF that occurs in GHTD patients. Also one GHTD patient that showed a STAT3 defect before puberty was overcomed after he entered puberty and without GH treatment. There is a clinical status that is called 'growth dealy' that matches this patients profile, that shows rapid growth after puberty. A probable cause could be that ubiquitinated form of CIS was not present after he entered puberty.