L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie de forte incidence affectant les articulations. Elle est caractérisée principalement par une dégradation du cartilage articulaire, un déséquilibre au niveau du remodelage osseux et une sclérose de l’os sous-chondral. L’étiologie de cette pathologie reste encore méconnue, cependant il semble de plus en plus que tous les tissus composant l’articulation soient affectés dans cette pathologie. L’importance du rôle de l’os dans le développement de l’OA est incontestable et représente donc une cible thérapeuthique intéressante. Des études effectuées par tomodensitométrie ont démontré une structure et une organisation anormales du tissu osseux des patients OA. Parallèlement, les cultures primaires d’ostéoblastes (Ob) humains OA issus de l’os sous-chondral démontrent un phénotype altéré et une faible minéralisation in vitro. La signalisation Wnt, essentielle dans l’embryogenèse, a montré avoir un rôle clé dans la régulation de l’ostéogenèse en régulant notamment la différenciation terminale des Ob. Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), un facteur agissant notamment sur la prolifération et sur le début de la différenciation des Ob, est surexprimé par les Ob OA et pourrait moduler cette signalisation. Aussi, deux populations de patients OA peuvent être différenciées in vitro par la production de prostaglandines E2 (PGE2) par leurs Ob et les PGE2, dans une étude sur le cancer colorectal, ont montré moduler la signalisation Wnt. Notre hypothèse de travail est que l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est diminuée dans les Ob OA. Cette diminution est responsable de la sous-minéralisation et de l’altération du phénotype des Ob humains OA. Par ailleurs, DKK2, dont l’expression est contrôlée par TGF-β1, est responsable de la diminution de l’activité Wnt/β-caténine et les PGE2 peuvent en partie corriger cette situation. L’objectif général de cette étude est d’une part, de démontrer le rôle de TGF-β1, DKK2 et de PGE2 sur l’altération de la signalisation Wnt/β-caténine et d’autre part, de démontrer le lien entre TGF-β1 et DKK2 et l’effet de ces derniers sur le phénotype des Ob. Dans cette étude on a montré que la signalisation canonique Wnt est altérée dans les Ob OA et que cela était responsable de l’altération du phénotype des Ob OA. On a montré, parmi les acteurs de la signalisation Wnt, que l’expression de l’antagoniste Dickkopf-1 (DKK1) était relativement similaire entre les Ob OA et normaux contrairement à celle de l’antagoniste DKK2 qui était augmentée et à celle de l’agoniste Wnt7B qui était diminuée dans les Ob OA. On a également montré que les PGE2 pouvaient potentialiser l’activité de la signalisation Wnt dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 a permis d’augmenter l’activité de la signalisation Wnt et de corriger le phénotype anormal ainsi que d’augmenter la minéralisation des Ob OA. L’inhibition de TGF-β1, un facteur aussi surexprimé dans les Ob OA, a également permis la correction du phénotype et l’augmentation de la minéralisation dans les Ob OA. L’inhibition de TGF-β1 a aussi menée à l’inhibition de DKK2. Le contraire ne fût pas observé démontrant ainsi la régulation de DKK2 par TGF-β1. En conclusion, la signalisation canonique Wnt est diminuée dans les Ob OA et cela est dû au niveau élevé de DKK2 dans ces Ob. TGF-β1 régule positivement DKK2 et donc la surexpression de TGF-β1 entraîne celle de DKK2 ce qui a pour conséquences d’altérer le phénotype des Ob. Les PGE2 ont aussi montré pouvoir potentialiser l’activité de la signalisation Wnt et auraient donc un rôle positif. Ensemble, ces données suggèrent que ces altérations au niveau des Ob OA pourraient être responsables de la structure osseuse anormale observée chez les patients OA. / Osteoarthritis (OA) is a disease affecting joints and it has a very strong incidence in the population. It is characterized by articular cartilage degradation, an abnormal bone remodelling cycle and subchondral bone sclerosis. The aetiology of this disease is still unknown although OA is now considered as a joint disease involving all the tissues of the joint. The importance of bone in OA pathogenesis is now considered as fundamental and thus bone represent an interesting target for treatments. Tomodensitometric studies have shown an abnormal structure and organisation of the bone tissue of OA patients. In parallel, primary human OA osteoblast (Ob) cultures grown from the tibiofemoral subchondral bone show an abnormal phenotype and a reduced mineralization in vitro. The Wnt signalling pathway, known primarily for its important role in embryogenesis, is of utmost importance in osteogenesis and it has been shown to regulate terminal Ob differentiation. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), known to act on proliferation and on early phases of the differentiation of Ob, is overexpressed by OA Ob and could also modulate the Wnt signalling activity. Furthermore, two populations of OA patients can be discriminated in vitro by the production of prostaglandins E2 (PGE2) of their Ob. In a study on colorectal cancer, PGE2 was shown to modulate the canonical Wnt signalling pathway. Our hypothesis is that canonical Wnt signalling is diminished in OA Ob. This reduction is responsible for the poor mineralization and the abnormal phenotype of human OA Ob. Furthermore, DKK2, overexpressed in OA Ob and whose expression is controlled by TGF-β1, is responsible for the diminution of Wnt signalling activity, and PGE2 can partly correct this situation. The general goal of this study is twofold: 1) to demonstrate the role of TGF-β1, DKK2 and of PGE2 in the Wnt signalling activity; 2) to demonstrate the link between TGF-β1 and DKK2 and their effect on the abnormal OA Ob phenotype. We have shown in this study that the canonical Wnt signalling pathway is altered in OA Ob and that this was responsible for the altered phenotype observed in OA Ob. Also, we have shown that among the mediators of the Wnt signalling pathway, the expression of antagonist Dickkopf-1 (DKK1) was similar between OA and normal Ob. In contrast, the antagonist DKK2 was overexpressed and the expression of the agonist Wnt7B was low in OA Ob. Moreover, PGE2 increased Wnt signalling activity in OA Ob. The inhibition of DKK2 expression also increased Wnt signalling activity and corrected the abnormal phenotype along with increasing the mineralization of OA Ob. The inhibition of TGF-β1 expression, also overexpressed in OA Ob, also resulted in the correction of the phenotype and increased the mineralization of OA Ob. Inhibiting TGF-β1 expression also led to DKK2 inhibition. As the contrary was not observed, this demonstrated that TGF-β1 could regulate DKK2 expression. To conclude, Wnt signalling is reduced in OA Ob and this is due to elevated DKK2 levels in these cells. High levels of TGF-β1 in OA Ob increased DKK2 expression which could be responsible, at least partially, for their altered phenotype. PGE2 was shown to also increase Wnt signalling activity in OA Ob. Taken together these data suggest that such alterations in OA Ob could be responsible for the abnormal bone structure observed in OA patients.

<p>Hypoxia-reoxygenation (H-R) injury is an important clinical phenomenon in patients with coronary artery disease (CAD). Endothelial injury is a critical step in the initiation and progression of atherosclerosis. Therefore, endothelial and cardiomyocyte protection has been considered an effective step in prevention and treatment of CAD.</p><p>To investigate the cardioprotective effect of tocopherols, omega-3 fatty acid [eicosapentaenoic acid (EPA)] and transforming growth factor-β₁ (TGF-β₁) during H-R, calcium tolerant myocytes isolated from adult rats were cultured and subjected to hypoxia for 24 hrs followed by reoxygenation of 3 hrs. All strategies, including tocopherol preparations, EPA and TGF-β₁, showed attenuation of H-R-induced myocyte injury indicated by reduction of lactate dehydrogenase (LDH) release. Both a-tocopherol and a mixed- tocopherols (α-, γ-, and δ-) decreased the effects of H-R on iNOS expression and SOD activity in cultured myocytes. The mixed-tocopherols was more potent than a-tocopherol alone. EPA inhibited H-R-induced lipid peroxidation, MMP-1 expression and p38MAPK phosphorylation. TGF-β₁ blocked the increase in iNOS and PKB phosphorylation as well as the decrease in eNOS expression in cultured myocytes exposed to H-R.</p><p> To further investigate the protective effect of omega-3 fatty acids [docosahexaenoic acid (DHA) and EPA] and TGF-β₁, the cultured endothelial cells were exposed to oxidant injury mediated by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL). Ox-LDL markedly reduced TGF-β₁ release, increased the expression of TGF-β₁ receptors, upregulated the expression of adhesion molecules, P-selectin and ICAM-1, enhanced the adhesion of monocytes to endothelial cells, and decreased protein kinase B (PKB) activation. Both DHA and EPA blocked these effects of ox-LDL on endothelial cells. Exogenous recombinant TGF-β₁ also ameliorated ox-LDL-induced expression of adhesion molecules and monocytes adhesion, which were blocked by antibodies to the TGF-β₁ type 2, but not to the type 3 receptor.</p><p>These observations provide mechanistic insights into H-R and oxidant injury and tissue protection by three different strategies.</p>

Hypoxia-reoxygenation (H-R) injury is an important clinical phenomenon in patients with coronary artery disease (CAD). Endothelial injury is a critical step in the initiation and progression of atherosclerosis. Therefore, endothelial and cardiomyocyte protection has been considered an effective step in prevention and treatment of CAD. To investigate the cardioprotective effect of tocopherols, omega-3 fatty acid [eicosapentaenoic acid (EPA)] and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) during H-R, calcium tolerant myocytes isolated from adult rats were cultured and subjected to hypoxia for 24 hrs followed by reoxygenation of 3 hrs. All strategies, including tocopherol preparations, EPA and TGF-β1, showed attenuation of H-R-induced myocyte injury indicated by reduction of lactate dehydrogenase (LDH) release. Both a-tocopherol and a mixed- tocopherols (α-, γ-, and δ-) decreased the effects of H-R on iNOS expression and SOD activity in cultured myocytes. The mixed-tocopherols was more potent than a-tocopherol alone. EPA inhibited H-R-induced lipid peroxidation, MMP-1 expression and p38MAPK phosphorylation. TGF-β1 blocked the increase in iNOS and PKB phosphorylation as well as the decrease in eNOS expression in cultured myocytes exposed to H-R. To further investigate the protective effect of omega-3 fatty acids [docosahexaenoic acid (DHA) and EPA] and TGF-β1, the cultured endothelial cells were exposed to oxidant injury mediated by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL). Ox-LDL markedly reduced TGF-β1 release, increased the expression of TGF-β1 receptors, upregulated the expression of adhesion molecules, P-selectin and ICAM-1, enhanced the adhesion of monocytes to endothelial cells, and decreased protein kinase B (PKB) activation. Both DHA and EPA blocked these effects of ox-LDL on endothelial cells. Exogenous recombinant TGF-β1 also ameliorated ox-LDL-induced expression of adhesion molecules and monocytes adhesion, which were blocked by antibodies to the TGF-β1 type 2, but not to the type 3 receptor. These observations provide mechanistic insights into H-R and oxidant injury and tissue protection by three different strategies.

Ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι αρκετά ευάλωτος στις επιδράσεις περιβαλλοντικών τοξινών, λόγω των ιδιαίτερων δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του. Η έκθεση σε μια νευροτοξίνη εκδηλώνεται συνήθως μέσω γνωστικών και συμπεριφορικών διαταραχών, που συνοδεύουν δυσμενείς νευροχημικές αλλαγές και καθορίζονται από το είδος, την ηλικία, το φύλο, το γενετικό προφίλ, τη δόση, την οδό και τη χρονική περίοδο έκθεσης. Ωστόσο, η χρόνια έκθεση σε ένα νευροτοξικό παράγοντα είναι δυνατόν να επάγει μη αναστρέψιμη νευρωνική βλάβη και εκφύλιση. Το αργίλιο (Al), που συνιστά το τρίτο σε αφθονία στοιχείο στη φύση, ασκεί ποικίλες νευροτοξικές επιδράσεις, ανάλογα με τη χημική μορφή του μετάλλου, τη δόση, την οδό και την περίοδο έκθεσης, ενώ αμφιλεγόμενη παραμένει η εμπλοκή του στην παθογένεια της νόσου του Alzheimer. Η αφλατοξίνη Β1 (AFB1) ανήκει στην ομάδα των μυκοτοξινών (δευτερογενής μεταβολίτης των μυκήτων του γένους Aspergillus), μολύνει καλλιέργειες και ζωοτροφές και αποτελεί ισχυρή ηπατοτοξίνη και ηπατοκαρκινογόνο. Εντούτοις, η νευροτοξικότητα της AFB1 είναι ελάχιστα μελετημένη και οι λίγες αναφορές που παρουσιάζουν την εκδήλωση συμπεριφορικών διαταραχών, αφορούν την έκθεση σε αναπτυξιακό στάδιο. Εκτενής και εντατική είναι τις τελευταίες δεκαετίες η έρευνα της νευροπροστατευτικής δράσης φαρμακευτικών φυτών και των βιοδραστικών συστατικών τους, με απώτερο στόχο την πρόληψη ή αντιμετώπιση της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας που επάγεται από γενετικούς ή/και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ενδιαφέρον για τον ελλαδικό χώρο, λόγω της υψηλής εμπορικής του αξίας, έχει το καλλιεργούμενο φυτικό είδος Crocus sativus L., του οποίου οι στύλοι (κρόκος ή σαφράν) χρησιμοποιούνται στη διατροφή ως άρτυμα και η φαρμακευτική τους αξία έχει αναγνωριστεί εδώ και χιλιετίες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να συμβάλλει στην έρευνα της νευροτοξικής δράσης του Al και της AFB1 και του νευροπροστατευτικού ρόλου των στύλων του C. sativus, εστιάζοντας σε παραμέτρους της μνημονικής λειτουργίας ενηλίκων μυών, της χολινεργικής/μονοαμινεργικής διαβίβασης και της οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου τους. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε αρσενικούς ενήλικες Balb-c μύες (n=7-10/ομάδα) χορηγήθηκε δια στόματος AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) διαλυμένο στο κανονικό πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες ή ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) AFB1 (0.3 και 0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) για 4 ημέρες. Η ικανότητα εκχυλισμάτων των στύλων του C. sativus και της κροκετίνης, του κύριου βιοδραστικού μεταβολίτη των καροτενοειδών συστατικών (κροκίνες) του κρόκου, να προλαμβάνουν ή να ανατρέπουν τις βλαπτικές επιδράσεις του Al και της AFB1 στον εγκέφαλο των μυών, διερευνήθηκε ακολουθώντας τα εξής σχήματα χορήγησης: α) υδατικό/μεθανολικό εκχύλισμα κρόκου (60 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. τις τελευταίες 6 ημέρες της περιόδου χορήγησης του AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα στο πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες), β) αφέψημα κρόκου (0.45 mg/mL) καταναλώθηκε για 2 εβδομάδες πριν τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. τις τελευταίες 4 ημέρες της περιόδου χορήγησης του αφεψήματος), και γ) καθαρή κροκετίνη (4 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. για 3 ημέρες πριν ή μετά τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. για 4 ημέρες). Μελετήθηκαν επίσης, οι επιδράσεις των προηγούμενων σχημάτων χορήγησης του αφεψήματος κρόκου και της κροκετίνης στον εγκέφαλο υγιών ενηλίκων μυών. Η ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία παθητικής αποφυγής. Η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης [AChE, διαλυτές σε άλας (SS)/απορρυπαντικό (DS) ισομορφές], της βουτυρυλοχολινεστεράσης (BuChE, SS/DS ισομορφές) και της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ, -Α και -Β ισομορφές) προσδιορίστηκαν στον ολικό εγκέφαλο (-ce, πλην παρεγκεφαλίδας) και την παρεγκεφαλίδα, ως δείκτες της χολινεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης, αντιστοίχως. Επίσης, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), ως δείκτες της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της αντιοξειδωτικής άμυνας, αντιστοίχως, των εγκεφαλικών ιστών. Με τη χρήση φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης μετρήθηκαν τα επίπεδα Al στους εγκεφαλικούς ιστούς, ενώ, για πρώτη φορά, η κροκετίνη προσδιορίστηκε στον ολικό εγκέφαλο (-ce) των μυών μετά την i.p. χορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, με HPLC ανάλυση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μακρόχρονη πρόσληψη υψηλής δόσης AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού οδήγησε σε εξασθένηση της μάθησης/μνήμης των μυών, σημαντική μείωση της ενεργότητας της AChE και BuChE, αύξηση της ενεργότητας των ισομορφών της ΜΑΟ του ολικού εγκεφάλου (-ce), αλλά αναστολή της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας, σημαντική αύξηση των επιπέδων MDA στον εγκέφαλο και μείωση της συγκέντρωσης GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Συσσώρευση του μετάλλου καταγράφηκε στους εγκεφαλικούς ιστούς των μυών που λάμβαναν AlCl3. Μνημονικό έλλειμμα εμφάνισαν οι μύες που έλαβαν την υψηλή (0.6 mg/kg) αλλά όχι χαμηλή δόση (0.3 mg/kg) AFB1. Επίσης, η βραχύχρονη i.p. χορήγηση της μυκοτοξίνης ανέστειλε τις χολινεστεράσες (ChEs), ενεργοποίησε τη ΜΑΟ, αύξησε σημαντικά τη λιπιδική υπεροξείδωση και μείωσε τα επίπεδα GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Ωστόσο, διαφορική απόκριση στην έκθεση στην AFB1 παρουσίασαν οι ισομορφές της BuChE και ΜΑΟ των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χορηγούμενη δόση. Αντιχολινεστερασική και αντιοξειδωτική δράση επέδειξαν τόσο η μακρόχρονη πρόσληψη αφεψήματος κρόκου όσο και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση κροκετίνης στους εγκεφαλικούς ιστούς των υγιών μυών, ενώ δεν μετέβαλλαν τη μνημονική τους ικανότητα. Η βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου στο τέλος της περιόδου πρόσληψης AlCl3, αν και δεν είχε καμία επίδραση στη γνωστική ικανότητα των μυών, αντέστρεψε σημαντικά τις επαγόμενες από το Al αλλαγές της ενεργότητας της ΜΑΟ και των επιπέδων MDA και GSH των εγκεφαλικών ιστών. Επιπλέον, η ενεργότητα των ισομορφών της AChE των εγκεφαλικών ιστών μειώθηκε περαιτέρω σημαντικά μετά τη χορήγηση του εκχυλίσματος. HPLC ανάλυση του ολικού εγκεφάλου (-ce) των μυών αποκάλυψε, για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, την παρουσία κροκετίνης μετά τη βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, η οποία δεν ανιχνεύτηκε στους μύες μάρτυρες. Η μακρόχρονη καθημερινή κατανάλωση αφεψήματος κρόκου πριν την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 απέτρεψε την επαγόμενη από τη μυκοτοξίνη μνημονική εξασθένηση, αναστολή της DS-BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Α του εγκεφάλου και της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων στους εγκεφαλικούς ιστούς. Επίσης, οι μύες που κατανάλωναν το αφέψημα εμφάνισαν περαιτέρω σημαντική μείωση της ενεργότητας των ισομορφών της AChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), της DS-AChE της παρεγκεφαλίδας και των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών. Αν και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση καθαρής κροκετίνης πριν ή μετά την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 δεν επηρέασε την ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών, έδρασε αποτελεσματικά στην πρόληψη ή αντιστροφή της επαγόμενης από τη μυκοτοξίνη αναστολής της BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), ενεργοποίησης των ισομορφών της ΜΑΟ του εγκεφάλου και αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών ιστών. Ωστόσο, μόνο η προηγηθείσα χορήγηση κροκετίνης απέτρεψε την αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και τη μείωση των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών, που προκάλεσε η χορήγηση της AFB1. Διαφορική απόκριση (περαιτέρω αναστολή ή αύξηση) στη χορήγηση κροκετίνης εμφάνισαν οι ισομορφές της AChE των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χρονική ακολουθία της χορήγησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η μακρόχρονη πρόσληψη AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού και η βραχύχρονη συστημική έκθεση στην AFB1 ασκούν ισχυρές νευροτοξικές επιδράσεις στους ενήλικες μύες, όπως απέδειξαν η επαγωγή μνημονικής εξασθένησης και οι νευροχημικές διαταραχές. Η αναστολή του γνωστικού ελλείμματος από τη μακρόχρονη κατανάλωση αφεψήματος κρόκου, υποστηρίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κρόκου έναντι της νευροτοξικότητας της AFB1 και τον αναδεικνύει ως ελπιδοφόρο διατροφικό παράγοντα στην πρόληψη της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας. Ωστόσο, οι ευεργετικές επιδράσεις της κροκετίνης στους νευροχημικούς δείκτες της εγκεφαλικής λειτουργίας υπό συνθήκες τοξικότητας και η απόδειξη της βιοδιαθεσιμότητάς της στον εγκέφαλο, προτείνουν τη συμβολή των καροτενοειδών συστατικών του κρόκου στις νευροπροστατευτικές του ιδιότητες και ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνησή τους ως νευροπροστατευτικών παραγόντων. / Mammalian brain is quite susceptible to environmental toxins, due to its special structural and functional features. Exposure to a neurotoxin is commonly manifested through cognitive and behavioral disturbances that follow adverse neurochemical changes and are defined by the animal species in question, the age, the gender, the genetic profile, the dose, the route and the period of exposure. However, chronic exposure to a neurotoxic agent may induce irreversible neuronal damage and degeneration. Aluminum (Al), which is the third most abundant element in nature, exerts diverse neurotoxic effects, depending on the metal’s chemical form, the dose, the route and the period of exposure, while its implication in the pathogenesis of Alzheimer’s disease remains controversial. Aflatoxin B1 (AFB1) is classified to the group of mycotoxins (secondary metabolite of the fungi of Aspergillus sp.), contaminates crops and feeds and constitutes potent hepatotoxin and hepatocarcinogen. Nevertheless, AFB1 neurotoxicity is poorly studied and the few reports focus on the manifestation of behavioral disorders after exposure at developmental stage. During the last decades, extensive research on the neuroprotective action of medicinal plants and their bioactive components is carried out, with the aim of prevention or treatment of brain dysfunction that is provoked by genetic and/or environmental agents. The plant Crocus sativus L. is of particular interest in Greece ,due to its large-scale cultivation and the high commercial value of its styles (saffron); saffron is used as a spice in diet and its medicinal properties have been recognized for millenia. The aim of the present study was to contribute to the investigation of the neurotoxic activity of Al and AFB1 and the neuroprotective role of saffron, focusing on aspects of memory function, brain cholinergic/monoaminergic transmission and oxidant/antioxidant state in adult mice. METHODS: Male adult Balb-c mice (n=7-10/group) received either AlCl3 orally (50 mg/kg body weight/day) dissolved in normal drinking water for 5 weeks or AFB1 intraperitoneally (i.p.) (0.3 and 0.6 mg/kg body weight/day) for 4 days. The potential of saffron extracts and crocetin, the main bioactive metabolite of saffron carotenoid constituents (crocins), in prevention or reversal of the detrimental effects of Al and AFB1 on mouse brain, was investigated by adopting the following administration schemes: a) aqueous methanolic extract of saffron (60 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for the last 6 days of AlCl3 treatment period (50 mg/kg body weight/day in drinking water for 5 weeks), b) saffron infusion (0.45 mg/mL) was consumed for 2 weeks prior to AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for the last 4 days of saffron infusion treatment period), and c) pure crocetin (4 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for 3 days before or after AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for 4 days). The effects of the previous administration schemes of saffron infusion and crocetin on brain of healthy adult mice, were also studied. The learning/memory ability of mice was evaluated by step-through passive avoidance task. The activity of acetylcholinesterase [AChE, salt-(SS)/detergent-soluble (DS) isoforms], butyrylcholinesterase (BuChE, SS/DS isoforms) and monoamine oxidase (MAO, -A and -B isoforms) was assessed in whole brain (-ce, minus cerebellum) and cerebellum, as indices of cholinergic and monoaminergic transmission, respectively. Moreover, malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) concentrations were determined as indices of lipid peroxidation and antioxidant defence, respectively, in cerebral tissues. Cerebral tissues’ Al levels were measured by atomic absorption spectrometry, while, for the first time, crocetin was determined in mouse whole brain (-ce) after i.p. administration of saffron extract by HPLC analysis. RESULTS: Long-term intake of high dose of AlCl3 through drinking water resulted in learning/memory impairment of mice, significant reduction of AChE and BuChE activity, increase of MAO isoforms’ activity in whole brain (-ce), but inhibition of cerebellar MAO-B, significant elevation of brain MDA levels and decrease of GSH content in cerebral tissues. Metal accumulation was recorded in brain tissues of AlCl3 treated mice. Mice receiving high (0.6 mg/kg) but not low dose (0.3 mg/kg) of AFB1 displayed memory deficit. Furthermore, short-term i.p. administration of mycotoxin inhibited cholinesterases (ChEs), activated MAO, increased significantly lipid peroxidation and reduced GSH levels in cerebral tissues. However, brain tissues’ BuChE and MAO isoforms presented differential response to AFB1 exposure, depending on the administered dosage. Both long-term saffron infusion intake and short-term i.p. administration of crocetin exerted anti-cholinesterase and antioxidant action in healthy mice’ cerebral tissues, while their memory performance remained unchanged. Although short-term co-administration of saffron extract at the end of AlCl3 treatment period had no effect on cognitive capacity of mice, it reversed significantly the Al-induced changes in MAO activity and the levels of MDA and GSH of cerebral tissues. Moreover, cerebral AChE isoforms’ activity was further significantly decreased following saffron extract co-administration. HPLC analysis of mouse whole brain (-ce) revealed, for the first time, the presence of crocetin after short-term saffron extract co-administration, which was not detected in control mice. Long-term daily consumption of saffron infusion prior to AFB1 (high dose) exposure prevented the mycotoxin-induced memory impairment, inhibition of whole brain (-ce) DS-BuChE, increase of brain MAO-A and cerebellar MAO-B activity, and oxidative damage of lipids in brain tissues. Also, saffron infusion pre-treated mice displayed further significant decrease of the activity of AChE isoforms in whole brain (-ce), DS-AChE in cerebellum and the levels of GSH in cerebral tissues. Although, short-term i.p. administration of pure crocetin before or after AFB1 (high dose) exposure had no effect on learning/memory ability of mice, it effectively prevented or reversed the mycotoxin-induced inhibition of whole brain (-ce) BuChE, activation of brain MAO isoforms and elevation of cerebral tissues’ lipid peroxidation. However, only crocetin pre-treatment inhibited the increase of cerebellar MAO-B activity and reduction of brain tissues’ GSH content which were provoked by AFB1 administration. Cerebral tissues’ AChE isoforms presented differential response (further decrease or increase) to crocetin treatment, depending on time course of administration. CONCLUSION: The findings of the present study show that long-term intake of AlCl3 through drinking water and short-term systemic exposure to AFB1, exert strong neurotoxic effects on adult mice, as evidenced by the induction of memory impairment and the neurochemical disturbances. The inhibition of cognitive deficit by long-term saffron infusion consumption supports its neuroprotective action against AFB1 neurotoxicity and highlights saffron as a promising dietary agent in prevention of brain dysfunction. However, the beneficial effects of crocetin on neurochemical indices of brain function under toxicity and the demonstration of its bioavailability in brain, suggest the contribution of saffron carotenoids in saffron’s neuroprotective properties and encourage their further investigation as neuroprotective agents.

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie de forte incidence affectant les articulations. Elle est caractérisée principalement par une dégradation du cartilage articulaire, un déséquilibre au niveau du remodelage osseux et une sclérose de l’os sous-chondral. L’étiologie de cette pathologie reste encore méconnue, cependant il semble de plus en plus que tous les tissus composant l’articulation soient affectés dans cette pathologie. L’importance du rôle de l’os dans le développement de l’OA est incontestable et représente donc une cible thérapeuthique intéressante. Des études effectuées par tomodensitométrie ont démontré une structure et une organisation anormales du tissu osseux des patients OA. Parallèlement, les cultures primaires d’ostéoblastes (Ob) humains OA issus de l’os sous-chondral démontrent un phénotype altéré et une faible minéralisation in vitro. La signalisation Wnt, essentielle dans l’embryogenèse, a montré avoir un rôle clé dans la régulation de l’ostéogenèse en régulant notamment la différenciation terminale des Ob. Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), un facteur agissant notamment sur la prolifération et sur le début de la différenciation des Ob, est surexprimé par les Ob OA et pourrait moduler cette signalisation. Aussi, deux populations de patients OA peuvent être différenciées in vitro par la production de prostaglandines E2 (PGE2) par leurs Ob et les PGE2, dans une étude sur le cancer colorectal, ont montré moduler la signalisation Wnt. Notre hypothèse de travail est que l’activation de la voie de signalisation Wnt/β-caténine est diminuée dans les Ob OA. Cette diminution est responsable de la sous-minéralisation et de l’altération du phénotype des Ob humains OA. Par ailleurs, DKK2, dont l’expression est contrôlée par TGF-β1, est responsable de la diminution de l’activité Wnt/β-caténine et les PGE2 peuvent en partie corriger cette situation. L’objectif général de cette étude est d’une part, de démontrer le rôle de TGF-β1, DKK2 et de PGE2 sur l’altération de la signalisation Wnt/β-caténine et d’autre part, de démontrer le lien entre TGF-β1 et DKK2 et l’effet de ces derniers sur le phénotype des Ob. Dans cette étude on a montré que la signalisation canonique Wnt est altérée dans les Ob OA et que cela était responsable de l’altération du phénotype des Ob OA. On a montré, parmi les acteurs de la signalisation Wnt, que l’expression de l’antagoniste Dickkopf-1 (DKK1) était relativement similaire entre les Ob OA et normaux contrairement à celle de l’antagoniste DKK2 qui était augmentée et à celle de l’agoniste Wnt7B qui était diminuée dans les Ob OA. On a également montré que les PGE2 pouvaient potentialiser l’activité de la signalisation Wnt dans les Ob OA. L’inhibition de DKK2 a permis d’augmenter l’activité de la signalisation Wnt et de corriger le phénotype anormal ainsi que d’augmenter la minéralisation des Ob OA. L’inhibition de TGF-β1, un facteur aussi surexprimé dans les Ob OA, a également permis la correction du phénotype et l’augmentation de la minéralisation dans les Ob OA. L’inhibition de TGF-β1 a aussi menée à l’inhibition de DKK2. Le contraire ne fût pas observé démontrant ainsi la régulation de DKK2 par TGF-β1. En conclusion, la signalisation canonique Wnt est diminuée dans les Ob OA et cela est dû au niveau élevé de DKK2 dans ces Ob. TGF-β1 régule positivement DKK2 et donc la surexpression de TGF-β1 entraîne celle de DKK2 ce qui a pour conséquences d’altérer le phénotype des Ob. Les PGE2 ont aussi montré pouvoir potentialiser l’activité de la signalisation Wnt et auraient donc un rôle positif. Ensemble, ces données suggèrent que ces altérations au niveau des Ob OA pourraient être responsables de la structure osseuse anormale observée chez les patients OA. / Osteoarthritis (OA) is a disease affecting joints and it has a very strong incidence in the population. It is characterized by articular cartilage degradation, an abnormal bone remodelling cycle and subchondral bone sclerosis. The aetiology of this disease is still unknown although OA is now considered as a joint disease involving all the tissues of the joint. The importance of bone in OA pathogenesis is now considered as fundamental and thus bone represent an interesting target for treatments. Tomodensitometric studies have shown an abnormal structure and organisation of the bone tissue of OA patients. In parallel, primary human OA osteoblast (Ob) cultures grown from the tibiofemoral subchondral bone show an abnormal phenotype and a reduced mineralization in vitro. The Wnt signalling pathway, known primarily for its important role in embryogenesis, is of utmost importance in osteogenesis and it has been shown to regulate terminal Ob differentiation. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1), known to act on proliferation and on early phases of the differentiation of Ob, is overexpressed by OA Ob and could also modulate the Wnt signalling activity. Furthermore, two populations of OA patients can be discriminated in vitro by the production of prostaglandins E2 (PGE2) of their Ob. In a study on colorectal cancer, PGE2 was shown to modulate the canonical Wnt signalling pathway. Our hypothesis is that canonical Wnt signalling is diminished in OA Ob. This reduction is responsible for the poor mineralization and the abnormal phenotype of human OA Ob. Furthermore, DKK2, overexpressed in OA Ob and whose expression is controlled by TGF-β1, is responsible for the diminution of Wnt signalling activity, and PGE2 can partly correct this situation. The general goal of this study is twofold: 1) to demonstrate the role of TGF-β1, DKK2 and of PGE2 in the Wnt signalling activity; 2) to demonstrate the link between TGF-β1 and DKK2 and their effect on the abnormal OA Ob phenotype. We have shown in this study that the canonical Wnt signalling pathway is altered in OA Ob and that this was responsible for the altered phenotype observed in OA Ob. Also, we have shown that among the mediators of the Wnt signalling pathway, the expression of antagonist Dickkopf-1 (DKK1) was similar between OA and normal Ob. In contrast, the antagonist DKK2 was overexpressed and the expression of the agonist Wnt7B was low in OA Ob. Moreover, PGE2 increased Wnt signalling activity in OA Ob. The inhibition of DKK2 expression also increased Wnt signalling activity and corrected the abnormal phenotype along with increasing the mineralization of OA Ob. The inhibition of TGF-β1 expression, also overexpressed in OA Ob, also resulted in the correction of the phenotype and increased the mineralization of OA Ob. Inhibiting TGF-β1 expression also led to DKK2 inhibition. As the contrary was not observed, this demonstrated that TGF-β1 could regulate DKK2 expression. To conclude, Wnt signalling is reduced in OA Ob and this is due to elevated DKK2 levels in these cells. High levels of TGF-β1 in OA Ob increased DKK2 expression which could be responsible, at least partially, for their altered phenotype. PGE2 was shown to also increase Wnt signalling activity in OA Ob. Taken together these data suggest that such alterations in OA Ob could be responsible for the abnormal bone structure observed in OA patients.

Liver disease is now a leading cause of non-AIDS related morbidity and mortality in people living with HIV (PLWH). The present study investigated the interplay between adverse lifestyle factors that are prevalent in PLWH, biological mediators of liver pathogenesis, and a non-invasive measure of liver fibrosis (FIB-4 index) in HIV mono- and HIV/HCV co-infected individuals. The results of this investigation in the Miami Adult Studies of HIV (MASH) cohort show that the odds of liver fibrosis progression significantly increased over two years for HIV mono-infected participants who drank alcohol hazardously (OR 3.038, P=0.048), and had BMI ≥ 28kg/m2 (OR 2.934, P=0.027). Cocaine use reduced the odds of advancing one stage of liver fibrosis (OR 0.228, P=0.038), but an interaction between high BMI and cocaine use slightly raised the odds by 4.8% of liver fibrosis progression (P=0.072). HIV/HCV co-infected participants showed interactions between cocaine use and high BMI with increased FIB-4 stage (OR 4.985, P= 0.034), however no lifestyle factors could independently predict FIB-4 stage in this group. Biological mediators previously associated with liver pathogenesis were associated with higher FIB-4 index over 2 years in a subset of (n=65) HIV mono-infected participants. Plasma measures of oxidative stress (% oxidized glutathione: OR 4.342, P= 0.046), hepatocyte-specific apoptosis (Cytokeratin-18 (CK-18): OR 1.008, P=0.021), and microbial endotoxin (lipopolysaccharide (LPS): OR 1.098, P= 0.097) were associated with having higher odds of progressing at least one stage of FIB-4 over 2 years. The same biological mediators were also associated with liver fibrosis within HIV infected people who also had a harmful lifestyle characteristic. FIB-4 index was significantly associated with % oxidized glutathione in obese subjects (β=0.563, P=0.018), TGF-β1 in cocaine users (β=0.858, P=0.027), and CK-18 in HIV infected individuals without any adverse lifestyle factors (β=0.435, P=0.015). Taken together, the findings of these studies describe interrelationships between HIV disease status, lifestyle, and biological mediators of liver fibrosis. The results show interactions between lifestyle conditions and the mediators of liver fibrosis may account for higher rates of liver disease in HIV infection. Research is warranted to develop personalized therapeutics for PLWH to curb the burden of liver disease.