Η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι έναντι της α5β1, ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πλειοτροπίνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από τη θέση δέσμευσης της αλληλουχίας RGD της ιντεγκρίνης. Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο το οποίο αντιστοιχεί στην κυστεϊνική θηλιά (177CYDMKTTC184) στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β3 ανέστειλε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3 και την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ενώ η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β3 διαμεσολαβείται μέσω του RPTPβ/ζ και της καθοδικής αυτού κινάσης c-Src, η οποία επιπλέον αλληλεπιδρά και με την ιντεγκρίνη β3. Η midkine βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, αλλά όχι με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ προκάλεσε μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο ίδιο πλαίσιο, η πλειοτροπίνη ανέστειλε τη μετανάστευση διαφορετικών κυτταρικών σειρών γλοιώματος τα οποία εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, αλλά όχι την ιντεγκρίνη ανβ3¬, ενώ προκάλεσε επαγωγή της μετανάστευσης στα κύτταρα U87MG, που εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη. Υπερέκφραση της ιντεγκρίνης β3 σε κύτταρα γλοιώματος είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Παρόμοια, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση στη μετανάστευση κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β3, ενώ προκάλεσε σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων σταθερά διαμολυσμένων ώστε να υπερεκφράζουν την ιντεγκρίνη β3. Σε κύτταρα CHO σταθερά διαμολυσμένα ώστε να υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ιντεγκρίνης β3, στην οποία οι τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή του σήματος της πλειοτροπίνης που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση. Το γεγονός ότι και η midkine προκάλεσε επαγωγή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 773 δείχνει επιπλέον ότι η φωσφορυλίωση αυτή από μόνη της δεν είναι ικανή να οδηγήσει σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα μόριο που καθορίζει την επαγωγική ή ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εξιχνιάσθηκε ο μηχανισμός δράσης ενός πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (πεπτίδιο S1), και το οποίο έχει βρεθεί να αναστέλλει την αγγειογένεση in vivo και την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση και το σχηματισμό αυλών των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro. Το πεπτίδιο S1 βρέθηκε ότι αναστέλλει την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ δεν επηρεάζει την αλληλεπίδρασή της με τον RPTPβ/ζ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ανταγωνιστική δράση μεταξύ της πλειοτροπίνης και του πεπτιδίου S1 για πρόσδεση στην ιντεγκρίνη ανβ3 θα μπορούσε να εξηγήσει την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου στις επαγόμενες από την πλειοτροπίνη βιολογικές δράσεις, αλλά το κυριότερο, δείχνει ότι η το καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης είναι υπεύθυνο τμήμα για τη δέσμευσή της στην ιντεγκρίνη ανβ3. Επιπλέον, ανοίγει το δρόμο για την ανάπτυξη μορίων που θα αναστέλλουν τις δράσεις της πλειοτροπίνης μέσω της ιντεγκρίνης ανβ3 και θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν θεραπευτικά σε καταστάσεις, στις οποίες η αλληλεπίδραση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο. / Pleiotrophin is a growth factor that among other functions, plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Our group has previously shown that pleiotrophin is able to induce migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ). In the present study we show that a monoclonal antibody against ανβ3 but not α5β1 integrin abolished pleiotrophin-induced human endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. Integrin ανβ3 was found to directly interact with pleiotrophin in an RGD-independent manner, whereas a synthetic peptide corresponding to the specificity loop of the β3 integrin extracellular domain (177CYDMKTTC184) inhibited pleiotrophin-ανβ3 interaction and totally abolished pleiotrophin-induced endothelial cell migration. Interestingly, ανβ3 was also found to directly interact with RPTPβ/ζ, and pleiotrophin-induced Y773 phosphorylation of β3 integrin was dependent on both RPTPβ/ζ and the downstream c-Src kinase activation, which furthermore interacts with β3 integrin. Midkine was found to interact with RPTPβ/ζ, but not with ανβ3, and caused a small but statistically significant decrease in cell migration. In the same line, pleiotrophin decreased migration of different glioma cell lines that express RPTPβ/ζ but do not express ανβ3, while it stimulated migration of U87MG cells that express ανβ3 on their cell membrane. Overexpression of β3 in glioma cells stimulated the effect of pleiotrophin on cell migration. In the same line, pleiotrophin had no effect on migration of CHO cells that do not express β3, while it induced proliferation of the same cells, stably transfected to over-express wild-type β3. In cells over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosines 773 and 785 to phenylalanines, PTN had no effect on migration, suggesting that PTN-induced phosphorylation of tyrosine 773 is required for PTN-induced cell migration. However, the fact that midkine also induces phosphorylation of tyrosine 773 suggests that it is not sufficient by itself to transducer the stimulatory effect of PTN. Collectively, these data suggest that ανβ3 is a key molecule that determines the stimulatory or inhibitory effect of pleiotrophin on cell migration. Furthermore, the mode of action of a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of the C-terminal region of pleiotrophin (S1 peptide) and has inhibitory effects on angiogenesis in vivo and on pleiotrophin-induced endothelial cell migration and tube formation in vitro was further clarified. The peptide was found to inhibit pleiotrophin binding to ανβ3 integrin whereas it did not affect pleiotrophin binding to RPTPβ/ζ in human endothelial cells. These data explain the inhibitory effects of peptide S1 on pleiotrophin-induced biological activities and clarify that the C-terminal region of pleiotrophin is the domain responsible for the interaction with ανβ3 integrin. Finally, peptide S1 can be used to develop effective molecules in inhibiting actions of pleiotrophin through integrin ανβ3, in order to be used for treating pathologies where pleiotrophin seems to have significant role.

Τα γλοιώματα είναι η πιο συχνή κακοήθης μορφή καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος. Δυστυχώς, είναι επίσης μεταξύ των πιο δύσκολων μορφών όσο αναφορά τη θεραπεία, με αποτέλεσμα την κακή πρόγνωση των ασθενών. Γλοιώματα παρουσιάζουν πολύπλοκη κυτταρική και γενετική ετερογένεια, περιορίζοντας σημαντικά τις στοχευμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η ανακάλυψη γονιδίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν την επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων θα βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικών θεραπειών. Η πρωτεΐνη απόκρισης στο κυκλικό-AMP (CREB) είναι ένα πυρηνικό μόριο που ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης από κινάσες σερίνης/θρεονίνης και ελέγχει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων στα νευρικά κύτταρα. Ο ρόλος του CREB στη νευρωνική λειτουργία κυμαίνεται από την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό σε πιο πολύπλοκες εγκεφαλικές λειτουργίες, όπως η μνήμη και οι συμπεριφορές εθισμού. Δεδομένα από πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως ανώμαλη έκφραση ή ενεργοποίηση του CREB μπορεί να προσδώσει καρκινικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους ιστών και κυττάρων. Επίσης το CREB συμμετέχει σε διαδικασίες επιβίωσης και μετάστασης σε μεγάλο αριθμό καρκινικών κυτταρικών σειρών. Με βάση αυτά μελετήθηκε ο ρόλος του CREB σε κύτταρα καρκίνου του εγκεφάλου, με έμφαση στις περιπτώσεις γλοιοβλαστώματος. Δείξαμε ότι τόσο τα επίπεδα ενεργοποίησης όσο και ο αριθμός των κυττάρων που στα οποία το CREB είναι φωσφορυλιωμένο/ ενεργοποιημένο είναι σημαντικά αυξημένος σε σχέση με δείγματα παρακείμενου μη καρκινικού ιστού. Επιπλέων βρέθηκε πως η αποσιώπηση του CREB σε καρκινικές σειρές γλοιοβλαστώματος, με χρήση μορίων siRNA, επέφερε σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα τους. Τα παραπάνω ευρήματα συσχετίζουν για πρώτη φορά το μεταγραφικό παράγοντα CREB με το γλοιοβλάστωμα και του προσδίδουν ένα αρκετά σημαντικό ρόλο όσο αναφορά την επιβίωση των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. / Gliomas are the most common malignant cancers of the nervous system. Unfortunately, they are also amongst the most difficult cancers to treat, resulting in poor patient prognosis. Gliomas exhibit complex cellular and genetic heterogeneity, limiting effective targeted therapy approaches. Discovering the genes and pathways that regulate cancer cells survival and growth will aid in the development of novel and more effective treatments. The Cyclic-AMP Response Element Binding protein (CREB) is a serine/threonine kinase-regulated nuclear factor modulating the transcription of numerous genes in nerve cells and has various roles in neuronal function, ranging from survival and proliferation to more complex brain functions, such as memory and drug addiction behaviours. Given recent findings that aberrant CREB expression can impart oncogenic properties on myeloid cells, liver cells and ovarian epithelial cells, we explored the potential role of CREB in brain cancer biology by examining its expression in a panel of human patient brain tumour specimens. We show that both the level of expression and the number of cells expressing activated/phosphorylated CREB is markedly elevated in tumours compared with adjacent non-tumour control brain tissue. Moreover using siRNA molecules we knocked-down the expression of CREB in glioblastoma cell lines and then we studied the viability of these cells throughout 96 hours with the use of MTT assay. A significant reduction in viability was observed at CREB siRNA transfected cells against the control. These observations are the first to highlight a link between CREB and brain tumours. Our hypothesis is that CREB has a role in brain tumour development/growth and that at least some of CREB's neuro-oncogenic properties are due to its role in neural cells survival and proliferation.