Σκοπός της μελέτης ήταν η ανάδειξη της νεοαγγειογένεσης και ο προσδιορισμός της έκφρασης των VEGF-A, FGF-2, COX-2, AR και BCL-2 στην καλοήθη υπερπλασία και το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Το υλικό αφορούσε σε δείγματα προστατικού ιστού μονιμοποιημένα και εγκλεισμένα σε παραφίνη, από 24 περιστατικά καλοήθους υπερπλασίας και 139 περιστατικά προστατικού αδενοκαρκινώματος. Τα τελευταία χωρίστηκαν περαιτέρω σε 3 υποομάδες (Grade I, II και ΙΙΙ) ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησης του νεοπλάσματος κατά Gleason (2-4, 5-7 και 8-10 αντίστοιχα). Χρησιμοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος Βιοτίνης-Στρεπταβιδίνης-Υπεροξειδάσης, και εφαρμόστηκε ημιποσοτική μέθοδος για την εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης. Τα ευρήματά μας ανέδειξαν σαφή αύξηση της νεοαγγείωσης (MVD) στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη σε σχέση με την καλοήθη υπερπλασία, η οποία εμφάνισε στατιστικώς σημαντική θετική σχέση με το βαθμό κακοήθειας των προστατικών νεοπλασμάτων (ANOVA p<0.001) και με την έκφραση των VEGF-A και COX-2 (ANOVA p<0.001). Αναδείχθηκε αντίστροφη συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης του ανδρογονικού υποδοχέα (AR) με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.0001) και την έκφραση του VEGF-A στο προστατικό στρώμα (p<0.001 Spearman r = -0.312). Η έκφραση της BCL-2 παρουσιάστηκε αυξημένη στα προστατικά αδενοκαρκινώματα και σχετίστηκε με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.001) και την έκφραση των VEGF-A και COX-2 (p<0.001). Η έκφραση του VEGF-A σε όλα τα περιστατικά αδενοκαρκινώματος του προστάτη εμφάνισε στατιστικώς σημαντική σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.0001). Ωστόσο στα πτωχής διαφοροποίησης αδενοκαρκινώματα η μέση τιμή της έκφρασης του VEGF-A παρουσίασε πτώση. Αντίθετα, η σημασία της COX-2 στον προστατικό καρκίνο αναδείχθηκε με την έκφρασή της τόσο στην καλοήθη υπερπλασία όσο και στα αδενοκαρκινώματα του προστάτη. Η έκφραση παρουσίασε σημαντική σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.01). Η σαφώς αυξημένη έκφραση της COX-2 σε σχέση με τη μείωση της έκφρασης του VEGF-A στα πτωχής διαφοροποίησης νεοπλάσματα πιθανόν υποδηλώνει την ύπαρξη ενός αγγειογενετικού διακόπτη στα νεοπλάσματα αυτά όπου η COX-2 φαίνεται να παίζει σημαντικότερο ρόλο από τον VEGF-A. Η σημαντική αυτή πληροφορία θα μπορούσε να βρει πιθανή θεραπευτική εφαρμογή, καθώς σε πτωχής διαφοροποίησης αδενοκαρκινώματα του προστάτη ίσως η θεραπεία με COX-2 εκλεκτικούς αναστολείς να είχε πολύ καλύτερα αποτελέσματα από τις αντι-αγγειογενετικές θεραπείες με αναστολείς του VEGF. / The aim of this study was to immunohistochemically evaluate the expression of VEGF-A, FGF-2, COX-2, AR and BCL-2 in benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate carcinoma in relation to microvessel density (MVD) and the Gleason grade of the neoplasms. A total of 139 cases of primary prostate carcinoma and 24 cases of benign hyperplasia were included in the study. Tumors were graded according to the Gleason grading system and further divided into 3 subgroups (GRADE I, II and III). The immunostaining was performed according to the Streptavidin-Biotin Complex Peroxidase method, in formalin fixed paraffin-embedded tissue. Mean micro vessel density (MVD) was strongly related to tumor grade, VEGF-A and COX-2 histoscore (ANOVA, p<0.001). The androgen receptor was localized in the nuclei of prostate epithelial cells in 97% of cases. The comparison of AR staining with tumor grade revealed an inverse relationship between these two parameters (ANOVA, p<0,0001). An interesting finding was the inverse relationship of stromal AR expression in relation to VEGF-A immunoreactivity. BCL-2 expression was correlated with tumor grade in prostate carcinoma cases (p<0.001) and was strongly correlated with COX-2 and VEGF-A expression (p<0.001). These findings suggest that BCL-2 may play a dual role in tumorigenesis, possibly through an angiogenetic axis. VEGF-A expression was detected in only 17% of BPH cases but all prostate cancer specimens demonstrated some degree of immunoreactivity. COX-2 immunopositivity was present in 54% of BPH specimens and in 99% of primary prostate carcinomas. The increased COX-2 expression correlated significantly with Gleason grade. In our study, high-grade neoplasms presented low to moderate VEGF staining intensity compared to COX-2 expression. These results suggest the activation of an angiogenic switch in poorly differentiated neoplasms, where COX-2 may play a crucial role compared to VEGF and the possible key role of COX-2 in poorly differentiated cancers. According to our findings, anti-VEGF therapy could prove to be more beneficial in patients with low-grade disease, while patients with high-grade prostate carcinoma are more likely to respond to selective COX-2 inhibitors. Immunohistochemical determination of VEGF-A and COX-2 content might prove a useful tool in the design of patient-tailored, anti-angiogenic treatments.

Recent advances in radiation therapy have provided the possibility of combining different modalities, energies and particles in different parts of the treatment. However, there are very limited data on the clinical effectiveness of these modalities. The purpose of this study was the determination of the parameters D50 and γ for the prostate adenocarcinoma, the rectum and the penile bulb using different radiobiological models, when proton and photon beams are combined. / Πρόσφατες εξελίξεις στην ακτινοθεραπεία παρέχουν την δυνατότητα συνδυασμού διαφόρων μονάδων, ενεργειών και σωματιδίων σε διαφορετικά τμήματα της θεραπείας. Ωστόσο, υπάρχουν πολύ περιορισμένα δεδομένα που αφορούν στην κλινική αποτελεσματικότητα αυτών των συνδυασμών. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν ο προσδιορισμός των παραμέτρων D50 και γ για το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη το ορθό καθώς και τον βολβό του πέους με τη χρήση διαφόρων ραδιοβιολογικών μοντέλων, στην περίπτωση της συνδυασμένης χρήσης δέσμεων φωτονίων και πρωτονίων.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η δημιουργία ενός ευφυούς συστήματος για τη διάγνωση νοσημάτων του προστάτη αδένα με βάση σημεία και συμπτώματα που διαπιστώνονται σε έναν ασθενή όπως καταγράφονται κατά την κλινική του εξέταση. Τα βασικά σημεία της εργασίας είναι τα εξής: αρχικά παράγεται το μοντέλο της διαγνωστικής στρατηγικής που ακολουθείται για τη διάγνωση των συγκεκριμένων παθήσεων και στη συνέχεια γίνεται εκμαίευση της διαγνωστικής γνώσης από ειδικούς ή/και από εμπειρικά δεδομένα. Η διαδικασία και η γνώση αναπαρίστανται με χρήση υβριδικών μεθόδων αναπαράστασης και με τη χρήση ασάφειας ή/και αβεβαιότητας, η οποία είναι εγγενής σε τέτοια διαγνωστικά συστήματα. Το σύστημα αναπτύχθηκε με τέτοια εργαλεία που δίνουν την δυνατότητα στέγασής του σε ιστότοπο ώστε να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός συμβουλευτικός οδηγός από ενδιαφερομένους μη ειδικούς ιατρούς & από ασθενείς καθώς και από φοιτητές υγειονομικών σχολών για εκπαιδευτική χρήση. Το σύστημα περιέχει γνώση εμπειρογνωμόνων σε συνδυασμό με στοιχεία πλούσιας βιβλιογραφικής αναζήτησης και μελέτης. Τέλος πραγματοποιήθηκε επικύρωση των αποτελεσμάτων μέσα από μια τυχαιοποιημένη κλινική έρευνα. Η υλοποίηση του συστήματος μας στηρίζεται σε ένα ειδικό κέλυφος δημιουργίας ευφυών συστημάτων και σε εργαλεία μεθόδων μηχανικής μάθησης. Επίσης, υλοποιούνται δύο εκδοχές (Hirofilos Ι & ΙΙ) και γίνεται σύγκριση των απο-τελεσμάτων. Αναγνωρίστηκε η σαφής υπεροχή του Hirofilos ΙΙ που αναπτυχθηκε με σύστημα μηχανικής εκμάθησης και με δυνατότητα διαχρονικής αναβάθμισης. / During making this project our concern was the creation of a new expert system for diagnosis prostate disease depending on the clinical status of a patient as these are identified during medical examination. The main points were as follows: First has been constructed a diagnosis process model which was followed by the diagnosis for the most common prostate diseases. Secondly was implemented extracting of the medical knowledge based on specialists or/and experimental data. The whole process and the medical Knowledge will be developed using hybrid methods of representation and having the partcipation of such saying fuzziness or inaccuracy, that is innate in that kind of intelligent decision-support. The new intelligent system is already accommodated on a hospital server and is used as a decision-support system, as well as an e-learning platform for medical students. For the implementation of the new system have been used an expert system shell and knowledge engineering tools.

Prostate cancer is a significant public health concern due to its high incidence and mortality, and that no consensus exists regarding the best form of treatment for any stage of the disease. Prostate cancer mortality can be reduced by the early prostate cancer detection. The earlier the detection the more effective the treatment would be. Prostate cancer screening or early detection has been accomplished applying the digital rectal examination (DRE) , the measurement of serum the prostate specific antigen (PSA), transrectal ultrasonography and combinations of these tests. MS based proteomics and particularly MS-SEDLI-TOF technology have assisted in discovering prostate cancer biomarkers. On the other hand, a major cause of mortality for women is the ovarian cancer. Malignant ovarian tumors are heterogeneous in their biological and clinical behaviour and a greater understanding of how they develop and progress is a prerequisite to successful early detection, screening programs, and treatment modalities. Accordingly, the aims of the present thesis are: (i) To develop a reliable pattern recognition system for the discrimination of healthy from patients with prostate cancer as well as controls from patients with ovarian cancer ,(ii) To develop efficient algorithms in order to handle the large number of features that are extracted from proteomic spectra, (iii) To develop a methodology to facilitate the investigation of the low intensity peaks which are the peaks in which biologists are mostly interested in, (iv) To propose potential biomarkers for discriminating healthy from prostate cancer cases and healthy from ovarian cancer cases . To cope with the above issues and in search of efficient methods for handling proteomic spectra a novel multi classifier pattern recognition methodology has been designed, developed and implemented, for the analysis of prostate and ovarian proteomic data. Furthermore, a novel method for splitting and grouping peaks according to their intensities has been developed to be consistent with biologist interest in investigating low intensity peaks. / Τα δεδομένα πρωτεομικής τα οποία εξάγονται από φασματογράφο μάζας έχουν ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός μονοδιάστατου σήματος το οποίο στον οριζόντιο άξονα έχει τιμές μάζας/φορτίο και στον κατακόρυφο άξονα έχει τις αντίστοιχες τιμές έντασης. Οι τιμές στον οριζόντιο άξονα (μάζα/φορτίο) οι οποίες αντιπροσωπεύουν πεπτίδια ή πρωτεΐνες έχουν ένα εύρος από 0 έως δεκάδες χιλιάδες. Επομένως τα πρωτεομικά φάσματα θεωρούνται ιδιαίτερα πολύπλοκα. Η διαχείριση της πληροφορίας των πρωτεομικών φασμάτων καθώς και η εξαγωγή διαγνωστικών συμπερασμάτων είναι ένα πεδίο ανοιχτό προς έρευνα. Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί την δεύτερη πιο σημαντική αιτία θανάτου στην Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής και τον Καναδά. Η θνησιμότητα που οφείλεται στον καρκίνο του προστάτη μπορεί να μειωθεί από την έγκαιρη πρόγνωσή του. Όσο ποιο έγκαιρη είναι η πρόγνωσή του τόσο ποιο αποτελεσματική είναι η θεραπεία του. Ο προστάτης είναι ένας αδένας που βρίσκεται στο εσωτερικό του σώματος, κάτω από την ουροδόχο κύστη του άνδρα και περιβάλλει την ουρήθρα. Τον αδένα αυτό τον έχει ένας άνδρας ήδη από την στιγμή που γεννιέται. Με την λειτουργία του συμβάλει, στον έλεγχο της ούρησης, το οποίο το πετυχαίνει λόγω της ανατομικής του θέσης, στον εμπλουτισμό του σπέρματος με χρήσιμα και απαραίτητα συστατικά και στη λειτουργία της εκσπερμάτισης. Ο καρκίνος του προστάτη είναι η ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων στον αδένα αυτόν. Τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ πιο γρήγορα από τα φυσιολογικά κύτταρα, και έτσι, η ολοένα αυξανόμενη συγκέντρωσή τους δημιουργεί όγκους. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα έχουν την δυνατότητα να μεταφέρονται σε άλλα σημεία του σώματος (κάνουν μετάσταση) και να καταστρέφουν τα υγιή κύτταρα. Η πρωτεομική με την εφαρμογή της φασματογραφίας μάζας έχει βοηθήσει σημαντικά στην πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη και στην ανακάλυψη γνωστών βιοδεικτών του καρκίνου του προστάτη όπως είναι το ειδικό αντιγόνο του προστάτη (PSA), η προστατική όξινη φωσφατάση (PAP), το ειδικό πεπτίδιο του προστάτη (PSP) και το ειδικό αντιγόνο μεμβράνης του προστάτη (PSMA). Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια συνήθεις γυναικολογική κακοήθεια με ποικίλα ιστολογικά χαρακτηριστικά. Είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνου ανάμεσα σε όλες τις γυναικολογικές κακοήθειες, καθώς και ο πέμπτος πιο συχνός τύπος καρκίνου μεταξύ γυναικών του δυτικού κόσμου. Η πλειοψηφία των κακοηθών όγκων των ωοθηκών εμφανίζεται σε γυναίκες ηλικίας άνω των 65 χρόνων, ενώ οι καλοήθεις όγκοι είναι συνηθέστεροι σε νεότερης ηλικίας γυναίκες μεταξύ 25 και 45 χρόνων. Λόγω της πολυπαραγοντικής φύσης του καρκίνου, είναι πολύ πιθανό, μια ομάδα βιοδεικτών να είναι πιο ενδεικτικοί για την πρόβλεψη της βιολογικής συμπεριφοράς διαφόρων όγκων, από την χρήση ενός μόνο βιοδείκτη. Το CA-125 είναι ένας δείκτης ο οποίος χρησιμοποιείται για την διάγνωσης και συγκεκριμένα στην πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Η επιβεβαίωση του και αξιοπιστία του βιοδείκτη CA-125 οδήγησε στην ευρέως χρήση του, ως βιοδείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών, καθώς και στην κλινική διάγνωση της ανταπόκρισης του ασθενούς κατά την θεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατες προσπάθειες επικεντρώθηκαν στην βελτίωση της διαγνωστικής ακρίβειας του CA-125, είτε χρησιμοποιώντας μόνο τον συγκεκριμένο βιοδείκτη (CA-125), είτε χρησιμοποιώντας τον με νέους βιοδείκτες που έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο των ωοθηκών. Ο βιοδείκτης CA-125 βρίσκεται στο μητρικό γάλα και στο αμνιακό υγρό στις υγιείς γυναίκες. Παρόλα αυτά υπάρχει επίσης σε γυναίκες με γυναικολογικά προβλήματα όπως μητρικό λειομύωμα και ενδομητρίωση μειώνοντας έτσι την ειδικότητα του βιοδείκτη. Επιπροσθέτως άλλοι βιοδείκτες οι οποίοι έχουν βρεθεί είναι οι prostasin, OVX1, CA-15.3, CA-72.4, και inhibin. Έτσι οι στόχοι της παρούσας διατριβής είναι: (i) ο κατάλληλος συνδυασμός των βημάτων, προεπεξεργασίας, εξαγωγής χαρακτηριστικών, επιλογής χαρακτηριστικών και επιλογής ταξινομητή ώστε η διάγνωση να είναι ακριβέστερη από τις υπάρχουσες μεθόδους. (ii) να προταθούν βιοδείκτες (biomarkers) και συγκεκριμένα τιμές φάσματος (μάζας/φορτίου) οι οποίες ενδεχομένως να σχετίζονται με τις ασθένειες προς μελέτη (Καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών). Για την εκπλήρωση των ανωτέρω στόχων σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες με στόχο την ακριβή διάκριση των υγειών από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και ωοθηκών. Προτείνονται τιμές μάζας/φορτίο οι οποίες ενδεχομένως να αποτελέσουν χρήσιμους βιοδείκτες για τον καρκίνο του προστάτη και για τον καρκίνο των ωοθηκών. Επίσης υλοποιήθηκε μεθοδολογία για να μπορέσουμε να ερευνήσουμε την διαγνωστική αξία των κορυφών, των πρωτεομικών φασμάτων, με διάφορες τιμές έντασης και κυρίως των χαμηλών, οι οποίες θεωρούνται ως πλούσιες σε πληροφορία από τους βιολόγους.

Ιστορικά, τα ευρήματα των C.B. Huggins (Huggins and Hodges, 1941; Huggins, 1963) και A.V. Schally (Schally et al., 1984) αποτέλεσαν την απαρχή μιας ερευνητικής πορείας με αφετηρία το πεδίο της νευροενδοκρινολογίας και προορισμό εκείνα της γυναικολογίας και της ογκολογίας. Η γνώση αναφορικά με τη φυσιολογία της ενδογενούς ορμόνης (LHRH) και το ρόλο της στην παθοβιοχημεία των ασθενειών (ενδοκρινικών διαταραχών και ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων) και υπό το πρίσμα της πρωτεύουσας ή υποστηρικτικής θεραπευτικής προσέγγισης, κατέστησε τον ιατρικό ευνουχισμό μέσω της δράσης στον υποδοχέα της LHRH – Ι στρατηγική επιλογής για την καταπολέμηση των ενδοκρινικών διαταραχών και των ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου, καρκίνος του προστάτη). Μια πληθώρα αναλόγων της LHRH έδωσε και δίνει το παρόν σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο, με τη συστηματική έρευνα, σύνθεση και ανάπτυξη να αποδίδουν μόρια – αγωνιστές ή – ανταγωνιστές του υποδοχέα της LHRH – Ι, πεπτιδικής (γραμμική ή κυκλική δομή, stapled peptides) ή μη φύσης ως μοναδιαίες οντότητες ή σε σύζευξη με ένα ευρύ φάσμα κυτταροτοξικών μορίων (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στην in vitro και in vivo αξιολόγηση και φαρμακοκινητική μελέτη καινοτόμων αναλόγων της LHRH – κυκλικής και γραμμικής δομής – στη βάση του ορθολογικού μοριακού σχεδιασμού και αποσκοπώντας σε εναλλακτικές προσεγγίσεις για την καταπολέμηση του καρκίνου του προστάτη (και έτερων ενδοκρινικών διαταραχών), συγκριτικά με το leuprolide (εμπορικά διαθέσιμος αγωνιστής του υποδοχέα της LHRH – Ι). Η παρούσα διδακτορική διατριβή θέτει ως υπόθεση εργασίας πως καινοτόμα ανάλογα της LHRH των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Η εν λόγω ερευνητική προσέγγιση εστιάζει στον καρκίνο του προστάτη, μια νόσο που χρήζει εναλλακτικής θεραπευτικής στρατηγικής, δεδομένης της χαμηλής αποτελεσματικότητας αυτής (η νόσος προοδευτικά γίνεται ανεξάρτητη των ορμονών και συνεπώς, μεταστατική), αλλά και της χαμηλής ποιότητας ζωής των ασθενών στη βάση του «συμβιβασμού» με τις οδούς χορήγησης που εφαρμόζονται σήμερα στην κλινική (depot formulations). Επιπρόσθετα και κατά την εκπόνηση της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν καινοτόμες μεθοδολογίες υγρής χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας (LC – MS/ MS) σε βιολογικά υγρά – ηπατικά μικροσώματα (μύα, επίμυα, ανθρώπου), νεφρικές μεμβράνες μύα, πλάσμα και όρχεις μύα – και έτερα υποστρώματα (κυτταρικά εκχυλίσματα, υδάτινο περιβάλλον ιχθύων Danio rerio), οι οποίες, εν συνεχεία, συζεύχθηκαν με in vitro ή/ και in vivo βιοδοκιμασίες. Τα πειραματικά ευρήματα συγκρίθηκαν με εκείνα των εμπορικά διαθέσιμων αναλόγων της LHRH, με αγωνιστική (leuprolide) ή ανταγωνιστική δράση (antide, cetrorelix). Πιο αναλυτικά και λαμβάνοντας υπόψην το «νοσηρό» φαρμακοκινητικό προφίλ των αναλόγων της LHRH που χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική, διερευνήθηκε η in vitro (ηπατικά μικροσώματα μύα, επίμυα και ανθρώπου – νεφρικές μεμβράνες μύα) και in vivo (πλάσμα μύα) πεπτιδική σταθερότητα των υπό μελέτη αναλόγων, συγκριτικά με την LHRH και εμπορικά διαθέσιμα ανάλογα αυτής (antide, leuprolide). Τα ευρήματα επέτρεψαν την αξιολόγηση και ταξινόμηση των αναλόγων του ενδιαφέροντος βάσει πεπτιδικής σταθερότητας (δοκιμασία σάρωσης). Ταυτόχρονα, προσδιορίστηκε το μεταβολικό τους προφίλ, αποκαλύπτοντας τους ευάλωτους πεπτιδικούς δεσμούς, καθώς και τις εμπλεκόμενες ενδοπεπτιδάσες (NEP – EC 3.4.24.11, ACE – EC 3.4.15.1). Τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με τη χρήση ειδικών ενζυμικών αναστολέων (ενδεικτικά: DL – Thiorphan). Ο νεφρός βρέθηκε να είναι το πρωτεύον μεταβολικό όργανο. Η ανίχνευση και η ημι – ποσοτικοποίηση των μεταβολικών προϊόντων οδήγησε στον προσδιορισμό σχέσεων δομής – δραστικότητας, αποτελώντας τη βάση του ορθολογικού σχεδιασμού καινοτόμων μορίων. Οι απορρέουσες σχέσεις δομής –δραστικότητας υποστηρίζουν πως (i) η μεθυλίωση της υδροξυλομάδας της Tyr5, (ii) η αντικατάσταση της Pro9 από Aze και (iii) η κυκλοποίηση ενισχύουν την πεπτιδική σταθερότητα των αναλόγων του ενδιαφέροντος. Στα πλαίσια μελετών φαρμακοδυναμικής, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης και των υπό μελέτη αναλόγων σε πλάσμα (0, 05 – 100 ng/mL) και όρχεις μύα (2, 0 – 2000 ng/g). Η τεστοστερόνη θεσπίστηκε βιοδείκτης αποτελεσματικότητας (efficacy) και τοξικότητας (toxicity) στη βάση του καίριου ρόλου που διαδραματίζει το εν λόγω στεροειδές στη φυσιολογία του άξονα υποθάλαμος – υπόφυση – γονάδες και την παθοβιοχημεία των ενδοκρινικών διαταραχών και του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη. Η φαρμακολογική απόκριση (απελευθέρωση τεστοστερόνης) βρέθηκε πως είναι ειδική και λαμβάνει χώρα μέσω του υποδοχέα της LHRH – Ι. Πιο σημαντικά, επετεύχθη ιατρικός ευνουχισμός, βάσει ιστοπαθολογικών ευρημάτων και προσδιορισμού της τεστοστερόνης (πλάσμα και όρχεις μύα), κατόπιν επαναλαμβανόμενης ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης του επιλεγμένου καινοτόμου γραμμικού αναλόγου της LHRH, linearGnRH1. Το ίδιο ανάλογο βρέθηκε να έχει κυτταροστατική δράση σε πειράματα κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κύτταρα LNCaP και PC3). Παράλληλα και υπό το πρίσμα του ρόλου της LHRH στην παθοβιοχημεία έτερων ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου), αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και βελτιστοποιήθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό της 17β – οιστραδιόλης σε βιολογικά υγρά. Τέλος, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό πεπτιδίων του ενδιαφέροντος στο υδάτινο περιβάλλον των ιχθύων του είδους Danio rerio. Το καινοτόμο γραμμικό ανάλογο της LHRH, linearGnRH1, δεδομένου του φαρμακοκινητικού/ φαρμακοδυναμικού του προφίλ, δρα υποστηρικτικά ως προς την υπόθεση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, σύμφωνα με την οποία καινοτόμα ανάλογα των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Το linearGnRH1 δύναται να αποτελέσει τη βάση για τον ορθολογικό σχεδιασμό μορίων (stapled peptides, μιμητές), αποσκοπώντας σε εναλλακτικές θεραπευτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου ή/ και των ενδοκρινικών διαταραχών. Πέραν του linearGnRH1, ας σημειωθεί πως κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής συγκεκριμένα καινοτόμα κυκλικά ανάλογα της LHRH (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) εμφάνισαν ένα διακριτό φαρμακοκινητικό προφίλ. Το φαρμακοδυναμικό προφίλ των εν λόγω κυκλικών πεπτιδίων απαιτείται να διερευνηθεί περαιτέρω με την εφαρμογή των καινοτόμων μεθοδολογιών LC – MS/MS που αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Συνολικά, η καινοτομία της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης έγκειται (i) στην ανάπτυξη, επικύρωση και βελτιστοποίηση ενός πλήθους μεθοδολογιών LC – MS/MS σε σύζευξη με in vitro και in vivo βιοδοκιμασίες, οι οποίες και αποτελούν ένα διακριτό αναλυτικό εργαλείο και (ii) στο προκλινικό φαρμακολογικό μοντέλο που αναπτύχθηκε με την επιλογή του μύα ως ζωικό πρότυπο. Κοινή συνισταμένη, η εν τω βάθει αξιολόγηση της φαρμακοκινητικής/ φαρμακοδυναμικής των πεπτιδίων του ενδιαφέροντος με το ερευνητικό βλέμμα στα πεπτιδικά φάρμακα.. stapled peptides.. μιμητές.. / The highly influential findings of C. B. Huggins (Huggins, 1963) and A. V. Schally (Schally et al., 1984) brought a new era in the research fields of neuroendocrinology, gynecology and oncology. The knowledge acquired regarding the physiology of LHRH and its role in the pathobiochemistry of the disease resulted in the consideration of medical castration via the LHRH receptor as a well established strategy for the treatment of endocrine disorders (e.g. precocious puberty) and hormone – dependent cancers (breast cancer, endometrial cancer, prostate cancer). Numerous LHRH analogues have been synthesized and evaluated both in the clinic and preclinical level. Overall, systematic work has resulted in the synthesis of LHRH receptor agonists and antagonists, either peptides (linear, cyclic, stapled peptides) or small organic molecules as entities or combined with various cytotoxic molecules (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010). Although extensive research has been carried out in the field of hormonal therapy, poor pharmacokinetic properties still characterize LHRH peptide analogues. Poor stability of LHRH analogues compromises efficacy, while the need for their subcutaneous administration (depot formulations) aggravates the quality of life for cancer patients. Nowadays, LHRH analogues in the clinic most likely achieve the desired pharmacologic effects by action primarily on the pituitary and to a much lesser extent by direct antiproliferative effects on tumor cells. Herein, we hypothesize that stable analogues of such super – agonists would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. In this context, the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of novel LHRH analogues were determined both in vitro and in vivo. Similarly, commercially available LHRH analogues (leuprolide, antide, cetrorelix) served as positive controls. Novel LC – MS/MS based approaches (LC – MS/ MS methodologies coupled to in vitro and in vivo bioassays) were developed, validated and optimized for the evaluation of the peptide analogues in question (linear or cyclic) in various biological fluids and matrices; (i) mouse, rat and human liver microsomes, (ii) mouse kidney membrane preparations, (iii) mouse plasma and tissue (testis), (iv) egg – water (Danio rerio embryos environment). Furthermore, a novel LC – MS/MS based approach was developed, validated and optimized for the simultaneous quantification of testosterone and peptides in question, upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. Testosterone served as an efficacy and toxicity biomarker. Peptide metabolism was thoroughly studied by an LC – MS/MS based approach coupled to an in vitro bioassay (mouse kidney membrane preparations), allowing (i) structural elucidation and semi – quantitation of metabolites (and peptides) as a function of time, (ii) determination of the susceptible to proteolysis peptide – bonds, (iii) structure – activity relationships (SARs) and (iv) peptide ranking (screening assay). Taking into account the role of LHRH in gynecology and hormone – dependent cancers of breast, endometrium and ovary, an LC – MS/MS based approach was developed for the quantification of 17β – oestradiol (efficacy and toxicity biomarker) in mouse plasma upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. A novel LC – MS/MS based approach was also developed for the quantification of peptides of interest in the aquatic environment of Danio rerio. Employing the aforementioned analytical tools, peptide stability against proteolysis was evaluated both in vitro (mouse kidney membrane preparations) and in vivo (mouse plasma). LHRH and commercially available analogues served as positive controls. The SARs derived suggested that enhanced stability was achieved by (i) methylation on the hydroxyl group of Tyr5, (ii) replacement of Pro9 by Aze and (iii) cyclisation. Hence, new promising chemical entities could be synthesized and developed on the basis of rational drug design. Metabolic profiles were also determined revealing the susceptible to proteolysis peptide bonds. Susceptible peptide bonds and endopeptidases involved were further confirmed in the presence of specific endopeptidase inhibitors. A facile preclinical mouse model was developed in the context of our objectives. Intraperitoneal administration was selected, since (i) it is a mix – mode type of administration with elements of rapid absorption and (ii) oral administration was not practical due to the low bioavailability of the peptides that were tested. The LC – MS/MS based quantification of the selected bioactive peptides and their corresponding metabolites as well as the selective monitoring of biomarkers (e.g. testosterone) in response to drug dose, in plasma and testes, combined with the appropriate preclinical mouse model, represents a distinctive approach. The mouse model described in this paper is particularly valuable, since (i) the human LHRH receptor is homologous to the mouse receptor (Millar, 2004), (ii) information on in vitro and in vivo stability can be obtained with a relatively small amount of peptide (1 – 2 mg), (iii) information on the LHRH receptor agonism (receptor specific in vivo modulation) can be obtained by using testosterone as a marker, (iv) it allows the determination of the dosing regimen required for efficacy based on action on the pituitary, (v) it can become the basis of follow up experiments on genetically modified mouse animal models or other tumour xenografted mouse models (Sharpless and Depinho, 2006; Morgan et al., 2008). The robust sensitive methodology that was developed for the quantification of testosterone in mouse plasma (0.05 – 100 ng/mL) or determination of testosterone in testes (2 – 2000 ng/g) provides an excellent handle on compound efficacy assessment. Testosterone as an efficacy and toxicity biomarker was found to be specific upon peptide binding to the LHRH receptor. Medical castration was achieved upon the repeated dosing of a selected novel linear analogue (linearGnRH1). Measurements in plasma were further supported by statistical significant testosterone values in testis and histopathological findings (atrophy). Moreover the testis weights of the treated animals were significantly lower in comparison to the control group (atrophy induced by dosing), thus making the differences in testosterone testis concentration between control and peptide treated animals even more pronounced. Although the binding affinity of linearGnRH1 on the LHRH receptor was not as high as the binding affinity of leuprolide (~ 15 nM versus <1 nM), the in vivo efficacy between the two analogues was similar (at the tested dose), suggesting that the enhanced stability or bioavailability of linearGnRH1, compensates for binding affinity differences. LinearGnRH1 was also found to be anti – proliferative upon dosing in LNCaP cells (as potent as the superagonist leuprolide). It is possible that linearGnRH1 can play a significant role for the treatment of hormone – dependent cancers, by acting not only at the pituitary level (thus, suppressing the pituitary – testicular axis), but also by exerting an antitumor activity directly on cancer cells, as has been previously shown for other LHRH agonists (Maudsley et al., 2004; Marelli et al., 2006). Except for linearGnRH1, selected cyclic analogues (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) exhibited a distinct pharmacokinetic profile. Their pharmacodynamic profiles should be evaluated further employing the novel LC – MS/MS based approaches developed and validated in this study. Overall, the novelty of the approach described herein consists of (i) the LC – MS/MS methodologies coupled with in vitro and in vivo bioassays developed, validated and employed that provide a distinct analytical tool and (ii) the facile preclinical pharmacological mouse model developed and employed. The approach aims to the pharmacokinetic/pharmacodynamic evaluation of the peptides of interest towards a new generation of peptide drugs.. stapled peptides.. mimetics. Considering the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of linearGnRH1, findings on this novel analogue satisfy our hypothesis according to which stable analogues of the LHRH super – agonists used in the clinic would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. LinearGnRH1 can serve as the platform for the rational drug design of new chemical entities (stapled peptides, mimetics) for the treatment of hormone – dependent cancers and/ or endocrine disorders.