Η αποικοδόμηση των ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών μέσω του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεοσώματος αποτελεί βασική διαδικασία που εξυπηρετεί σημαντικές ομοιοστατικές λειτουργίες του κυττάρου. Η ουβικιτίνη δεσμεύεται ομοιοπολικά στις πρωτεΐνες-στόχους μέσω ενός καταρράκτη ενζυμικών αντιδράσεων, στον οποίο καθοριστικό ρόλο παίζουν τα Ε3 ένζυμα, οι Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης. Η πρωτεΐνη Arkadia είναι μια Ε3 λιγάση με έναν χαρακτηριστικό RING τομέα 69 αμινοξικών καταλοίπων στο C-τελικό άκρο της, μέσω του οποίου ασκεί την δράση της. Εμπλέκεται στο TGF-β σηματοδοτικό μονοπάτι το οποίο ρυθμίζει θετικά, ουβικιτινιλιώνοντας και στοχεύοντας για αποικοδόμηση πρωτεΐνες που αποτελούν αρνητικούς ρυθμιστές του. Κύριο χαρακτηριστικό του RING τομέα της Arkadia, ο οποίος έχει μελετηθεί και χαρακτηριστεί δομικά μέσω πολυπυρηνικής και πολυδιάστατης NMR φασματοσκοπίας, είναι η δέσμευση δύο ιόντων Zn2+ με χαρακτηριστικό διασταυρώμενο τρόπο (cross brace). Γνωρίζοντας τον πολύ σημαντικό ρόλο του Zn στην δομή και κατ’επέκταση στην δραστικότητα των RING τομέων, πραγματοποιήθηκαν μεταλλάξεις σε δύο αμινοξέα που συμμετέχουν στα μοτίβα δέσμευσης των δύο ιόντων Zn2+, οι H962C και H965C. Το μετάλλαγμα της H962C, στο οποίο εστιάζει η παρούσα εργασία, παρήχθη με βάση τις κλασσικές τεχνικές κλωνοποίησης DNA. Κατάλληλα δείγματα πρωτεΐνης εμπλουτισμένα σε πυρήνες ενεργούς στην φασματοσκοπία NMR, 15N και 13C, προετοιμάστηκαν ώστε να διεξαχθούν τα απαραίτητα πειράματα για τον προσδιορισμό της δομής. Το σύνολο των NMR φασμάτων απέδειξε ότι πρόκειται για ένα καλά δομημένο και σταθερό πολυπεπτίδιο. Τα δεδομένα από τις μετρήσεις ατομικής απορρόφησης και την επεξεργασία των φασμάτων επιβεβαίωσαν την διατήρηση της δέσμευσης δύο ιόντων Zn2+ ανά πολυπεπτίδιο, όπως στον RING τομέα του φυσικού τύπου της Arkadia. Ταυτόχρονα, πραγματοποιούνται περαιτέρω NMR μελέτες και αναλύσεις των φασμάτων με χρήση των κατάλληλων υπολογιστικών προγραμμάτων για την διερεύνηση της δομής και ικανότητας αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο. / The degradation of the intracellular proteins through the ubiquitin-proteasome pathway is a crucial procedure that serves the cellular homeostasis. Ubiquitin is covalently attached to the target proteins through an enzymatic cascade, in which the E3 enzymes (E3 ubiquitin ligases) play a determinant role. Arkadia is an E3 ubiquitin ligase containing a characteristic RING domain in its C-terminus, comprised of 69 amino acids, which is responsible for its function. It is involved in TFG-β signaling pathway, where it ubiquitinates and subsequently leads negative regulators to proteasomal degradation. The most important characteristic of Arkadia’s RING domain, which has been studied and structurally characterized through multinuclear and multidimensional NMR spectroscopy, is that it bounds to zinc ions in a cross-brace manner. As the role of the zinc binding is critical for the structure and subsequently the activity of RING domains, His962 and His965, which participate in the zinc binding motifs, were mutated to cysteines. The Arkadia H962C mutant, on which the present work is focused, was produced through the classical techniques of DNA cloning. Protein samples were uniformly labeled in 15N and 13C nuclei in order for all the necessary NMR experiments to be carried out. The total of the NMR spectra demonstrated that Arkadia RING mutant H962C is a well structured and stable polypeptide. Furthermore, the information that came from the atomic absorption data and the analysis of the NMR spectra confirmed that the RING mutant maintains the RING wild type ability to bind two zinc ions. At the same time, further NMR studies are being carried out in order to investigate its structure and ability to interact with the E2 enzyme.

Οι ανησυχητικές διαστάσεις που έχει λάβει τα τελευταία χρόνια η περιβαλλοντική ρύπανση και ιδιαίτερα η ρύπανση του θαλάσσιου περιβάλλοντος, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη εύρεσης και εγκαθίδρυσης νέων βιοδεικτών που μπορούν να συμβάλουν δραστικά στην έγκαιρη αναγνώριση της κατάστασης της υγείας του θαλάσσιου οικοσυστήματος και συνεπώς στη λήψη βελτιωτικών μέτρων για την αποκατάστασή του. Κυρίαρχο ρόλο ανάμεσα στους θαλάσσιους ρύπους κατέχουν τα βαρέα μέταλλα, τα οποία λόγω της ικανότητάς τους να επάγουν ή να προκαλούν οξειδωτικό στρες μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές, ακόμη και θανατογόνες βλάβες στους θαλάσσιους οργανισμούς. Η έκθεση σε μέταλλα προκαλεί την απορρύθμιση πολλών κυτταρικών διαδικασιών και κυρίως αυτών που διεξάγονται από μακρομοριακά σύμπλοκα, όπως η μεταφραστική μηχανή, τα οποία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε συνθήκες stress. Οι αλλαγές που προκαλούνται από το κυτταρικό stress στη διαδικασία της μετάφρασης καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα αποκρίσεων, που μπορεί να περιλαμβάνει μείωση της ολικής μετάφρασης ή αύξηση της μετάφρασης ειδικών mRNAs. Ένας αποτελεσματικός τρόπος εκτίμησης των μεταφραστικών αποκρίσεων ενός οργανισμού στο περιβαλλοντικό stress είναι ο προσδιορισμός του μεταφραστικά ενεργού ριβοσωματικού κλάσματος των πολυσωμάτων. Επίσης, καθώς ρυθμιστικά γεγονότα μπορεί να συμβούν σε οποιοδήποτε βήμα της μετάφρασης, έγινε μία σειρά πειραμάτων, που αφορούν στον έλεγχο της μεταφραστικής λειτουργίας του μυδιού Mytilus galloprovincialis, οργανισμού που χρησιμοποιείται συχνά ως βιομάρτυρας, σε εργαστηριακές συνθήκες, υπό την επίδραση τριών μετάλλων, του υδραργύρου, του χαλκού και του καδμίου. Για την εκτίμηση της κατάστασης της υγείας των εκτεθειμένων μυδιών έγινε προσδιορισμός ορισμένων κλασικών, ευρέως χρησιμοποιούμενων βιοδεικτών, καθώς και βιοδεικτών οξειδωτικού στρες. Ο έλεγχος των μεταφραστικών αποκρίσεων των εκτεθειμένων μυδιών περιλάμβανε εκτίμηση του ποσοστού πολυσωμάτων και προσδιορισμό της επίδρασης των μετάλλων τόσο στο προπαρασκευαστικό στάδιο της μετάφρασης, δηλαδή την αμινοακυλίωση των υποστρωμάτων, όσο και στα τρία κύρια στάδια της μετάφρασης, δηλαδή την έναρξη, την επιμήκυνση και τον τερματισμό. Τα δεδομένα της μελέτης αυτής αποκαλύπτουν ότι τόσο ο υδράργυρος, όσο και ο χαλκός προκαλούν το ίδιο πρότυπο αλλαγών στη μεταφραστική λειτουργία των εκτεθειμένων μυδιών, οδηγώντας σε απορρύθμιση όλων των σταδίων και των ενδιάμεσων βημάτων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Οι διαταραχές αυτές οφείλονται στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τα μέταλλα αυτά και στην παράλληλη αδυναμία του συστήματος αντιοξειδωτικής άμυνας των κυττάρων να το αντιμετωπίσει. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων επιβεβαιώνει την αρνητική επίδραση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από τα μέταλλα στη μετάφραση, με μία στατιστικά σημαντική συσχέτιση το ποσοστού πολυσωμάτων με τους βιοδείκτες οξειδωτικού στρες. Από την άλλη, τα αποτελέσματα της έκθεσης των μυδιών στο κάδμιο διαφοροποιούνται σημαντικά. Αρχικά, η έκθεση των μυδιών στο μέταλλο αυτό προκαλεί μία έντονη διαταραχή στην πρωτεϊνοσυνθετική διαδικασία, οφειλόμενη στην πρόκληση οξειδωτικού στρες. Με την πάροδο όμως το χρόνου, τα κύτταρα καταφέρνουν να διεγείρουν τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς, που σε αυτή την περίπτωση αντιπροσωπεύονται κυρίως από τις μεταλλοθειονίνες, με αποτέλεσμα να καταφέρνουν να ανταπεξέλθουν στη δύσκολες συνθήκες και να αναχαιτίσουν την αρνητική επίδραση του καδμίου, γεγονός που οδηγεί σε ανάκαμψη της μεταφραστικής ικανότητας των μυδιών αυτών, στο τέλος της περιόδου έκθεσης. Το διφασικό προφίλ της επίδρασης του καδμίου αντανακλάται στην έλειψη συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού πολυσωμάτων των εκτεθειμένων στο κάδμιο μυδιών και των βιοδεικτών οξειδωτικού στρες αλλά και των λοιπών βιοδεικτών. / The alarming levels of the environmental and especially the marine pollution in recent years constitute an urgent need of finding and establishing new biomarkers which may contribute to the early detection of the health status of the marine ecosystem leading to ameliorating measures towards its restoration. Heavy metals, which are capable of causing severe or even leathal defects to marine organisms, through their ability to induce or produce oxidative stress, posess a leading role among the marine pollutants. Exporure to heavy metals may cause the deregulation of many cellular processeses, mainly of those that are carried out by macromolecular complexes, such as the translational machinery, which are particularly sensitive to stress conditions. The alterations induced by the cellular stress in the translation may cover a broad range of responses, including a decline of the global translation or an increase of the translation of certain mRNAs. An effective way to reveal translational responses of an organism to environmetal stress is the evaluation of the translationally active ribosomal fraction of polysomes. Moreover, considering the fact that regulatory events may occur at any step of the translational process, a set of experiments was carried out, concerning the examination of the translational function of the mussel Mytilus galloprovindialis, which is commonly used as a bioindicator, in laboratory conditions, under the influence of three metals, mercury, copper and cadmium. In order to evaluate the health condition of the exposed mussels, a battery of standard biomarkers was applied, including biomarkers of oxidative stress. The determination of the translational responses of the treated mussels included measurement of the polysome content and assessment of the metal effect on the preparative stage of protein synthesis, the aminacylation of the substrates, as well as on the three main stages of translation, that is the initiation, the elongation and the termination. The data of the study reveal that mercury as well as copper cause the same patern of alterations in the translational function of the exposed mussels, leading to a deregulation of every stage and intermediate step of protein synthesis. These perturbations are a consequence of the metal induced oxidative stress, followed by a failure of the antioxidant defense system to confront it. Statistical analysis of the results confirms the negative effect of the metals on the translation, with a statistically important correlation of the polysome content with the oxidative stress biomarkers. On the other hand, the results of the cadmium exposed mussels follow a different pattern. First, the exposure of mussels to the metal causes a severe perturbation of the translational process, due to the oxidative stress induction. Finally, cells stimulate antioxidant mechanisms, in this case represented by metallotheioneins, managing to cope with the difficult conditions and to block the negative effect of cadmium, which leads to a restoration of the translational capacity of the mussels, at the end of the exposure period.The two-phase profile of the cadmium effect is reflected on the absence of statistical correlation between the polysomal content and biomarkers of oxidative stress, as well as other biomarkers.

Η ακρίβεια και η πιστότητα της διαδικασίας διπλασιασμού του γονιδιώματος είναι μείζωνος σημασίας για την κυτταρική επιβίωση. Τυχόν ανωμαλίες όπως μεταλλάξεις ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην εμφάνιση κακοήθειας ή σε πρόωρο κυτταρικό θάνατο. Τα παραπάνω συνηγορούν στη μεγάλη σημασία που έχει η άρτια λειτουργία και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Δύο πρωτεϊνες, οι geminin και cdt1, κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Πιο συγκεκριμένα, η cdt1 αποτελεί έναν βασικό παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής. Δρα συνεργατικά με την πρωτεϊνη Cdc6 προκειμένου να γίνει η πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-RC), διασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτό τις απαραίτητες συνθήκες για τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (Maiorano D. et al., 2000). Η geminin συνιστά τον φυσικό αναστολέα της cdt1 στα μετάζωα. Προσδένεται ισχυρά στην τελευταία μετά την έναρξη της σύνθεσης του DNA, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την επαναπρόσδεσή της στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής παρουσιάζει ανωμαλίες σε περιπτώσεις καρκινικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, έχει δειχθεί σταθερή υπερέκφραση της cdt1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, τόσο σε πρωτεϊνικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο (Xouri G. et al., 2004). Παρομοίως, αυξημένη έκφραση της cdt1 έχει παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και πρώιμου καρκίνου του πνεύμονα, στον άνθρωπο (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Τα παραπάνω αποτελέσματα έχουν προκύψει κατόπιν μελέτης, η οποία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας. Αναφορικά με τη geminin, αυξημένα επίπεδα έκφρασής της έχουν συσχετιστεί με καρκινώματα παχέος εντέρου καθώς και με τη διαίρεση κακοηθών κυττάρων, γενικότερα (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Επιπροσθέτως, η geminin βρίσκει εφαρμογή ως ανεξάρτητος δείκτης σε περιπτώσεις επιθετικού καρκίνου του μαστού (Gonzalez M.A. et al., 2004). Βασιζόμενοι στα παραπάνω, θεωρούμε ότι το σύμπλοκο geminin-cdt1 συνιστά έναν ιδανικό στόχο για το σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Το πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία να έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Ενδεχόμενη εύρεση τέτοιων συνθετικών συστατικών καθώς και μετέπειτα φυσικοχημική βελτιστοποίησή τους είναι δυνατόν να οδηγήσει στη δημιουργία ενός νέου αντικαρκινικού φαρμάκου. Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος συνέβαλε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνικών μορίων στόχων, τα οποία εμπλέκονται στο μοριακό μηχανισμό διαφόρων ασθενειών. Με βάση τις εξελίξεις των τελευταίων χρόνων στον τομέα της φαρμακοβιομηχανίας, η αξιοποίηση αυτής της γνώσης συνδέεται με το μαζικό έλεγχο συνθετικών συστατικών έναντι αυτών των μορίων στόχων. Απώτερο στόχο αποτελεί η αναγνώριση κατάλληλων συνθετικών συστατικών τα οποία θα έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το μόριο-στόχος και κατ’επέκταση να μεταβάλλουν τον τρόπο λειτουργίας του, προκειμένου να έχουμε το επιθυμητό φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Αποφασιστικής σημασίας στην παραπάνω διαδικασία, αποτελεί η σωστή επιλογή της κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου των νέων υποψήφιων φαρμάκων – συνθετικών συστατικών – έναντι του μορίου στόχου. Στην παρούσα διπλωματική, επιλέχθηκε προς εφαρμογή η μέθοδος FRET. Ένα από τα βασικά της πλεονεκτήματα είναι η υψηλή αναλογία ‘σήματος-θορύβου’ που εμφανίζει καθώς και η υψηλή ποιότητα των δεδομένων που παρέχει. Αν και αποτελεί μία σχετικά καινούρια τεχνική, εντούτοις αποτελεί μία από τις πιο βασικές μεθόδους της σύγχρονης φαρμακοβιομηχανίας λόγω της αξιοπιστίας που την χαρακτηρίζει και επιπλέον της συμβατότητάς της με αυτοματοποιημένες τεχνικές. Ασφαλώς, απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου αποτελεί η απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεϊνης. Η έκφραση του πρωτεϊνικού συμπλόκου geminin-cdt1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βακτηριακών συστημάτων έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επίσης, ο καθαρισμός του συμπλόκου υπήρξε επιτυχής και βασίστηκε στην εφαρμογή των τεχνικών της χρωματογραφίας συγγένειας και της χρωματογραφίας διήθησης σε πηκτή. Το επόμενο βήμα ήταν να διαπιστώσουμε εάν η μέθοδος FRET καθιστά δυνατή την ανίχνευση σχηματισμού του συμπλόκου. Πράγματι, κάτι τέτοιο ήταν εφικτό καθώς σε συγκέντρωση 60-80nM του συμπλόκου, παρατηρήθηκε αύξηση του σήματος σχεδόν κατά πέντε φορές υψηλότερα από το επίπεδο “θορύβου”. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό καθώς συνεπάγεται ότι με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι εφικτός ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Οι λόγοι που συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου για αυτό το σκοπό έγκεινται αφενός στην ευαισθησία την οποία εμφανίζει (αύξηση του σήματος μέχρι και πέντε φορές) και αφετέρου στην ειδικότητα και την αξιοπιστία της, όπως έχει δειχθεί και με τα αντίστοιχα πειράματα. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα αποτελεί και η μικρή σχετικά ποσότητα πρωτεϊνης (60-80nM), η οποία απαιτείται. Σύμφωνα με τα δεδομένα που έχουν προκύψει από την παρούσα διπλωματική , το FRET assay συνιστά μία ιδανική μέθοδο για την πραγματοποίηση μαζικού ελέγχου συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου geminin-cdt1. Δεδομένης της πολύ ισχυρής αλληλεπίδρασης του συγκεκριμένου συμπλόκου, πραγματοποιήθηκαν μεταλλαγές σε τρία υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα της cdt1, τα οποία κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στην αλληλεπίδραση με τη geminin, σύμφωνα με κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Lee C. et al., 2004). Οι μεταλλαγές αυτές ενδέχεται να συμβάλλουν σε ένα πολύ πιο εύκολα διασπάσιμο σύμπλοκο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην ευκολότερη και γρηγορότερη ταυτοποίηση υποψήφιων συνθετικών συστατικών. / The accurate and timely duplication of the genome is vital for cell survival. Mutations rearrangements or loss of chromosomes can be detrimental to a single cell as well as to the whole organism, causing malignant cell growth or death. Origins of replication are licensed by a multi-subunit complex (pre-replicative complex: pre-RC) during G1 (Lei M & Tye B.K., 2001). Pre-RC assembly is an ordered, sequential process in which the Origin Recognition Complex (ORC) first binds to each replication origin and then recruits two other proteins: Cdc6 and Cdt1 (Bell S.P. & Dutta A., 2002). These two proteins function synergistically to load the six mini-chromosome maintenance helicase proteins (MCM2-7) onto the pre-RC, establishing the conditions for DNA licensing (Maiorano D. et al., 2000). The prevention of ectopically induced re-replication is accomplished by functionally redundant mechanisms, including sequestration of MCM by Crm1 (Yamaguchi R. & Newport J., 2003), inactivation and export from the nucleus of Cdc6 (Delmolino L.M. et al., 2001; Jiang W. et al., 1999; Pelizon C. et al., 2000) and degradation of Cdt1 (Nishitani H. et al., 2001). Metazoans, have evolved an additional system for preventing re-replication: Geminin, which was originally identified in Xenopus as essential factor to exit from mitosis (McGarry T.J. & Kirschner M.W., 1998), binds tightly to Cdt1 and prevents Cdt1 assembly onto pre-RC (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Licensing system members are misregulated in cancer cells and differential expression of licensing components could be used for the diagnosis and prognosis of cancer (Shreeram S. & Blow J.J., 2003). Over-expression of Cdt1 can predispose cells to a malignant transformation. It has been shown that Cdt1 is consistently over-expressed in cancer cell lines at both the protein and RNA level (Xouri G. et al., 2004). Moreover, Cdt1 protein is highly expressed in cases of human colon cancer and primary human lung carcinomas (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Similarly, Geminin is also over-expressed in colon carcinomas and its expression levels were directly related to the cellular proliferation index in proliferating malignant cells (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Furthermore, expression of Geminin is considered as an independent indicator of adverse prognosis in cases of invasive breast cancer (Gonzalez M.A. et al., 2004). Given the crucial role of the Geminin-Cdt1 complex in cell cycle regulation and cancer, this complex could serve as target for the discovery and development of novel anti-cancer drugs. This requires the screening of compounds that are capable of disrupting the geminin-cdt1 complex. For that purpose we performed a HTP (high-throughput)-compatible assay, called FRET-assay. The acronym FRET stands for Fluorescence Resonance Energy transfer. The principle of the assay is based on the radiationless transfer of energy from an excited donor fluorophore (Europium Cryptate) to a suitable acceptor fluorophore (XL665). The first step was the expression and purification of the geminin-cdt1 complex. The complex was expressed by using E. coli bacterial cells and purified by metal affinity chromatography on a Ni+2 column. As soon as the complex was ready to use, we next tried to investigate whether the formation of the complex was detectable by using the FRET assay. Indeed, at the complex concentration of 60nM and 80nM, the signal was about 5 times above background. This was a first indication that the Geminin-Cdt1 complex can be used successfully for energy transfer based assays. Given the very high binding affinity of the two proteins (Lee C. et al., 2004), it could be quite unlikely to find a compound that can disrupt the complex. To overcome that obstacle, three single mutations were made at the highly conserved Geminin-contacting residues of hCdt1, Y170, F173 and L176. The mutation of these residues to alanine can possibly provide a more easily disruptable complex, which could be of importance concerning the faster and easier identification of any candidate compounds. Our data suggest that hGeminin-Cdt1 complex can be considered as a promising target for compound screening. Given the high importance of Geminin-Cdt1 balance for maintaining genomic stability integrity and that both proteins have been correlated with cases of cancer, that screening could hopefully lead to the discovery and development of lead compounds towards anti-cancer drugs.

Η κλινδαμυκίνη αποτελεί μέλος της οικογενείας των MLS αντιβιοτικών, με ευρύτατες εφαρμογές στην Ιατρική. Προσδεδενόμενη στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, δρα ως αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η ακριβής θέση δράσης της δεν έχει πλήρως διασαφηνισθεί. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει πως δρα στην Α θέση, ενώ άλλες στην Ρ θέση της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Στην παρούσα εργασία γίνεται λεπτομερής κινητική ανάλυση της αναστολής του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού από την κλινδαμυκίνη σε ιοντικό περιβάλλον που πλησιάζει το φυσιολογικό του κυττάρου (4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+). Συγκεκριμένα, η δράση της κλινδαμυκίνης μελετήθηκε σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου Escherichia coli, όπου ένας πεπτιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ πουρομυκίνης και AcPhe-tRNA, προσδεδενόμενου στην Ρ-θέση ριβοσωμάτων προγραμματισμένων με poly(U). Η πουρομυκίνη δρα ως ανάλογο του 3΄ άκρου ενός αμινοακυλο-tRNA ενώ το τριμερές AcPhe-tRNA∙ poly(U)∙ ριβόσωμα, σύμπλοκο C, ως ανάλογο του εναρκτήριου μεταφραστικού συμπλόκου. Η κινητική ανάλυση αποκάλυψε ότι η κλινδαμυκίνη συμπεριφέρεται ως αναστολέας βραδείας δεσμεύσεως. Μετά από μια παροδική αλληλεπίδραση με την Α-θέση, εγκαθίσταται κοντά στην Ρ-θέση του ριβοσώματος με αποτέλεσμα να επηρεάζει την ταχύτητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού. Στην συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των πολυαμινών στην αλληλεπίδραση της κλινδαμυκίνης με το σύμπλοκο C. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η σπερμίνη παρεμποδίζει την επίδραση της κλινδαμυκίνης στην Ρ-θέση, όμως επηρεάζει ευνοϊκά και σε μεγαλύτερο βαθμό, την αρχική δέσμευση του φαρμάκου στην Α-θέση ελαττώνοντας το εντροπικό κόστος. Η επίδραση αυτή δεν μεταβλήθηκε όταν αντί της σπερμίνης χρησιμοποιήθηκαν ριβοσώματα επισημασμένα μ’ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την Ν1-αζιδοβενζαμιδινο-σπερμίνη, ή όταν στο διάλυμα επώασης προστέθηκε μείγμα σπερμίνης και σπερμιδίνης. Πειράματα σταυρο-σύνδεσης έδειξαν ότι η σπερμίνη προσδένεται πλησίον της θέσης δέσμευσης της κλινδαμυκίνης. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην υπόθεση, ότι οι πολυαμίνες δεσμευόμενες πλησίον της θέσης πρόσδεσης της κλινδαμυκίνης επηρεάζουν την αλληλεπίδραση του αντιβιοτικού με το ριβόσωμα, επάγοντας αλλαγές διαμόρφωσης στο ριβοσωμικό σύμπλοκο. Η υπόθεση αυτή βρίσκεται σε συμφωνία με πειράματα χημικής προστασίας, που έδειξαν, ότι οι πολυαμίνες επηρεάζουν σημαντικά την τριτοταγή δομή του ριβοσώματος. Από άποψη φαρμακευτικών εφαρμογών η παρούσα μελέτη εισηγείται ότι, κάθε φορά που ένα αντιβιοτικό, με μοριακό στόχο το ριβόσωμα, είναι προς σχεδιασμό, η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη. / Clindamycin is a representative antibiotic of the MLS family, widely used in clinical practice. It inhibits protein synthesis by binding to the peptidyltransferase center of the ribosome. Clindamycin’s exact site of action is not known. Several studies have shown that it is an inhibitor of the A-site. However, there are also stydies that suggest that clindamycin acts at the P-site of the large ribosomal subunit. In this study, we re-examined the mechanism by which the antibiotic inhibits the formation of peptide bond in an ionic environment that resembles in vivo conditions (4.5 mM Mg2+, 150 mM NH4+). Clindamycin was investigated in a cell-free system derived from Escherichia coli, in which a peptide bond is formed between puromycin and AcPhe-tRNA bound at the P-site of poly (U) –programmed ribosomes. Puromycin can be considered as an analogue of the 3’-end of aminoacyl-tRNA, while the ternary complex AcPhe-tRNA∙poly(U)∙ ribosome (complex C) as an analogue of the initiation translation complex. Kinetics revealed that clindamycin behaves as a slow – binding inhibitor. After a transient interaction with the A-site of ribosomes, it slowly accommodates near the P-site so that peptide bond is still formed but with a lower velocity. Next, we investigated the influence of polyamines to the interaction of clindamycin with complex C. It was found that spermine hinders the accommodation of clindamycin to the P-site, but exerts a beneficial, more pronounced, effect on the potency of the drug by lowering the entropic cost of clindamycin binding to the A-site. Polyamine effect was not substantially altered when ribosomes labeled with a photoreactive analogue of spermine, N1-azidobenzamidino-spermine, were used or when a mixture of spermine and spermidine was added in the incubation mixture, instead of spermine alone. Cross-linking experiments have demonstrated that spermine binds to the vicinity of the antibiotic binding pocket. This observation temped us to suppose that polyamines bound adjacently to the binding site of clindamycin modulate the interaction of this drug with the ribosome by inducing conformational changes in the elongating ribosomal complex. Such a hypothesis is in agreement with chemical protection data revealing that polyamines influence significantly the tertiary structure of ribosomes. From the stand point of pharmaceutical applications, the present work postulates that when a drug is designed to target to the ribosome, the influence of the ionic environment should be taken into account.

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός παράγοντας (VEGF) επάγει την παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου(ΝΟ), το οποίο διαμεσολαβεί πολλές από τις αγγειογενετικές δράσεις του. Μολονότι, γνωρίζουμε ότι ο «υποδοχέας του ΝΟ» διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC) συμμετέχει στην αγγειογένεση που επάγεται από τον VEGF, ελάχιστα είναι χαρακτηρισμένα τα καθοδικά μόρια- εκτελεστές μέσω των οποίων το cGMP που προέρχεται από την sGC κατευθύνει την αγγειογενετική απάντηση. Για να προσδιορίσουμε την συμμετοχή της PKG (cGMP-dependent protein kinase) στην αγγειογένεση που επάγεται από τον VEGF, χρησιμοποιήσαμε τα πεπτίδια DT2 και DT3, δύο επιλεκτικούς αναστολείς της PKGIα. Έχοντας την απάντηση αυτού του ερωτήματος ως στόχο, πραγματοποιήσαμε in vivo (CAM, μοντέλο του κερατοειδή του ματιού κουνελιού, τροποποιημένη δοκιμασία Miles assay) και in vitro (πολλαπλασιασμός και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, εκβλάστηση σε δακτυλίους αορτής) μελέτες. Επιπλέον εκτιμήθηκε η ικανότητα του DT2 να παρεμβάλλεται στην μεταγωγή σήματος του VEGF. Επώαση CAM μεμβρανών με τους πεπτιδικούς αναστολείς της PKGIα είχε σαν αποτέλεσμα την μείωση του μήκους των αγγείων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με το DT3 να είναι πιο αποδοτικό από το DT2. Επιπρόσθετα παρατηρήσαμε, ότι το DT3 καταργεί την αγγεογενετική απάντηση που προέρχεται από τον VEGF στον κερατοειδή χιτώνα του ματιού κουνελιού. Η αναστολή της PKGI εμποδίζει επίσης την αγγειακή διαρροή που επάγεται από τον VEGF. In vitro, χορήγηση VEGF σε ενδοθηλιακά κύτταρα επάγει την φωσφορυλίωση της VASP στην Ser239 (επιλεκτικό υπόστρωμα για την PKGΙ) μέσω της ενεργοποίησης του VEGFR2 ενώ η συνχορήγηση του DT2 έχει σαν αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένης VASP πρωτεΐνης αποδεικνύοντας ότι σε άθικτα κύτταρα διέγερση του VEGFR2 οδήγησε σε ενεργοποίηση της PKGI. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με DT2 ή DT3 αναστέλλει την διαμεσολαβούμενη από τις ΜΑΡΚ κινάσες ERK1/2 και p38 μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και εκβλάστηση τους που επάγονται από τον VEGF. Εν κατακλείδι, παρέχουμε αποδείξεις ότι η PKGI είναι μέρος του μεταγωγικού μονοπατιού που διαμεσολαβεί τις αγγειογενετικές δράσεις του VEGF και ότι οι πεπτιδικοί αναστολείς της PKGI θα μπορούσαν να δοκιμαστούν σε ασθένειες που σχετίζονται με ενισχυμένη αγγειογένεση. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates nitric oxide (NO) production, which mediates many of its angiogenic actions. However, the angiogenic pathways that operate downstream of NO following VEGF treatment are not well characterized. Herein, we used DT2 and DT3, two highly selective cGMP-dependent protein kinase I peptide inhibitors to determine the contribution of PKGI in VEGF-stimulated angiogenesis. Incubation of chicken chorioallantoic membranes (CAM) with PKG-I peptide inhibitors decreased vascular length in a dose-dependent manner, with DT-3 being more effective than DT2. Moreover, inhibition of PKG-I with DT3 abolished the angiogenic response elicited by VEGF in the rabbit eye cornea. PKG-I inhibition, also blocked VEGF-stimulated vascular leakage. In vitro, treatment of cells with VEGF stimulated phosphorylation of the PKG substrate VASP through VEGFR2 activation; the VEGF-stimulated VASP phosphorylation was reduced by DT2. Pre-treatment of cells with DT2 or DT3 inhibited VEGF-stimulated mitogen activated protein kinase cascades (ERK1/2 and p38), growth, migration and sprouting of endothelial cells. The above observations taken together identify PKGI as a downstream effector of VEGFR2 in EC and provide a rational basis for the use of PKG-I inhibitors in disease states characterized by excessive neovascularization

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην επαγόμενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1, μιας από τις κυριότερες μεταλλοπρωτεϊνάσες του εξωκυτταρικού χώρου, από ινοβλάστες ανθρώπου και η διερεύνηση του μηχανισμού της κατασταλτικής επίδρασης του TGF-β1 στην επαγόμενη από IL-1β παραγωγή της μεταλλοπρωτεϊνάσης αυτής. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε ινοβλάστες αρθρικού υμένα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα ή ρευματοειδή αρθρίτιδα, ρινικού πολύποδα και πνεύμονα. Βρέθηκε ότι η επαγωγική δράση της IL-1 πραγματοποιείται μέσω του μονοπατιού της PKC, ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν η ενεργοποίηση του NF-kB, αλλά και των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας AP-1, μέσω των MAP κινασών. Το μονοπάτι, επίσης των κινασών τυροσίνης φαίνεται να συμμετέχει. Τα μονοπάτια αυτά φαίνεται ότι είναι κοινά στις ινοβλάστες, ανεξάρτητα από την προέλευση. Η δράση αυτή της IL-1β βρέθηκε ότι καταστέλλεται από το μονοπάτι cAMP/PKA στις ινοβλάστες αρθρικού υμένα και ρινικού πολύποδα όχι όμως και πνεύμονα. Ο TGF-β1 βρέθηκε ότι στις ινοβλάστες αρθρικού υμένα και ρινιού πολύποδα είχε κατασταλτική επίδραση στην επαγόμενη από IL-1β παραγωγή της MMP-1 ενώ σε αυτές από πνεύμονα είχε συνεργειακή. Η κατασταλτική δράση του TGF-β1 βρέθηκε ότι πραγματοποιείται μέσω ενεργοποίησης της PKA, κατά τρόπο ανεξάρτητο της παραγωγής cAMP. / The aim of present work was the study of signal tranduction pathways, which are implicated in IL-1β-induced production of MMP-1, one from the predominant metalloproteinases of extacellular matrix, from human fibroblasts, and the investigation of mechanism of suppressive effect of TGF-β1 on IL-1β-induced production of this metalloproteinases. The study was performed in fibroblasts with osteoarthrits or rheumatoid arthritis, nasal polyps and lung. It was found that the IL-1β-induced production of MMP-1 from fibroblasts, independently of their origin, is carried out via PKC pathway, while the activation of transcription factors NF-kB and AP-1, via MAP kinases, seems to play significant role. The tyrosine kinases pathway may also contributes. The IL-1β effect is suppressed from the cAMP/PKA pathway and nasal polyps fibroblasts but not in lung fibroblasts. TGF-β1 is able to antagonize the IL-1β-induced production of MMP-1 from synovial and nasal polyps fibroblasts, while in lung fibroblasts it exhibits synergistic effect. This suppressive effect of TGF-β1 is carried out via PKA activation, independently of cAMP production.