Spelling suggestions: "subject:"φαρμακευτική"" "subject:"φαρμακολογική""
1 |
Εφαρμογές του κλασματικού λογισμού στη φαρμακοκινητικήΜολώνη, Σοφία 25 May 2015 (has links)
Ο κλασματικός λογισμός είναι ο κλάδος της μαθηματικής ανάλυσης που μελετά παραγώγους και ολοκληρώματα κλασματικής τάξης, και επομένως επιτρέπει την διατύπωση κλασματικών διαφορικών εξισώσεων (FDEs). Aν και ο κλασματικός λογισμός εισήχθη για πρώτη φορά από τον Leibniz περισσότερα από 300 χρόνια πριν, εν τούτοις η εφαρμογή του σε προβλήματα της μαθηματικής φυσικής ξεκίνησε τις τελευταίες δεκαετίες. Συγκεκριμένα, η κλασματική ανάλυση ξεκίνησε βρίσκοντας εφαρμογή σε πολλούς τομείς των φυσικών επιστημών και της επιστήμης της μηχανικής, και μόλις το 2009 εισήχθη για πρώτη φορά στον τομέα της φαρμακοκινητικής.
Η φαρμακοκινητική είναι η επιστήμη η οποία μελετά την κινητική της απορρόφησης, της κατανομής και της απομάκρυνσης των φαρμάκων, δηλαδή περιγράφει τη χρονική εξέλιξη του φαρμάκου στον ανθρώπινο οργανισμό και χρησιμοποιεί κυρίως διαμερισματικά μοντέλα.
Έχει αποδειχθεί ότι συγκεκριμένα είδη φαρμάκων, μετά τη χορήγησή τους στο ανθρώπινο σώμα, ακολουθούν κινητική η οποία περιγράφεται καλύτερα με τη χρήση κλασματικών διαφορικών εξισώσεων. Ο κλασματικός λογισμός και οι εφαρμογές του είναι ένας αναπτυσσόμενος τομέας ενεργούς έρευνας. Σε ό,τι αφορά τη φαρμακοκινητική, πρόκειται για ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο και η αντίστοιχη βιβλιογραφία αυξάνεται ολοένα και περισσότερο.
Στην παρούσα εργασία μελετάται η εφαρμογή του κλασματικού λογισμού στη φαρμακοκινητική. Συγκεκριμένα, δίνουμε αναλυτική λύση σε γραμμικά συστήματα κλασματικών διαφορικών εξισώσεων, τα οποία αντιπροσωπεύουν φαρμακοκινητικά μοντέλα που έχουν προκύψει από την έως τώρα βιβλιογραφία. Όλα τα φαρμακοκινητικά μοντέλα που έχουν μελετηθεί δίνουν μόνο αριθμητικές λύσεις. Aυτό που επιχειρείται για πρώτη φορά στην παρούσα εργασία, είναι να δοθούν οι αναλυτικές λύσεις των μοντέλων αυτών, έστω και αν η μορφή τους είναι πολύπλοκη.
Αναλυτικότερα, το πρώτο κεφάλαιο της εργασίας περιέχει μια ανασκόπηση των βασικότερων στοιχείων της θεωρίας της κλασματικής ανάλυσης που θα χρησιμοποιήσουμε, όπως: συναρτήσεις Mittag-Leffler, βασικές ιδιότητες αυτών και υπολογισμός μετασχηματισμού Laplace συγκεκριμένων μορφών αυτών των συναρτήσεων, καθώς επίσης και ορισμός του κλασματικού ολοκληρώματος και της κλασματικής παραγώγου συναρτήσεων. Στο δεύτερο κεφάλαιο αναλύεται η σύνδεση της διαμερισματικής ανάλυσης με την φαρμακοκινητική. Στο τρίτο κεφάλαιο περιγράφεται η σύνδεση του κλασματικού λογισμού με τη φαρμακοκινητική, καθώς και οι λόγοι για τους οποίους υπερτερεί η προσέγγιση αυτή έναντι των προσεγγίσεων που χρησιμοποιούνταν έως και το 2009. Tο τέταρτο κεφάλαιο αφορά εφαρμογές του κλασματικού λογισμού, ενώ δίνονται οι αναλυτικές λύσεις των γραμμικών συστημάτων κλασματικών διαφορικών εξισώσεων που προκύπτουν. Ακόμη, στο Παράρτημα Α αναφέρονται κάποια στοιχεία που αφορούν στο ισοζύγιο μάζας, στο Παράρτημα Β δίνονται τα αποτελέσματα και οι γραφικές παραστάσεις των εφαρμογών που μελετήθηκαν στο τέταρτο κεφάλαιο, και, τέλος, στο Παράρτημα Γ δίνονται οι εντολές του Mathematica που χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση των αναλυτικών λύσεων. / Fractional calculus is the sector of mathematical analysis that deals with derivatives and fractional order integrals, resulting the derivation of Fractional Differential Equations (FDEs). Fractional calculus was first introduced by Leibniz more than 300 years ago. Nevertheless, its application on mathematical physics problems has just started the last few decades. In particular, fractional analysis started being applied on sciences of physics and mechanics . Furthermore, fractional analysis was introduced in the field of pharmacokinetics only a few years ago (2009).
Pharmacokinetics is the science that deals with the kinetics of the absorption, the distribution and the excretion of drugs. In other words, it describes the time course of the drug inside the human body. Pharmacokinetics mostly uses compartmental models .
It has been demonstrated that several types of drugs, follow a kinetic operation after entering in the human body, which is better described by Fractional Differential Equations. Fractional calculus and its applications is a developing sector of active research. Pharmacokinetics, in particular, is a promising tool and the corresponding literature is increasingly growing.
The present thesis deals with the application of fractional calculus in pharmacokinetics. In particular, we provide an analytical solution in fractional differential equations linear systems, which represent pharmacokinetic models that have emerged of the existing literature. All the pharmacokinetic models that have been studied provide only arithmetical solutions. The new aspect of the present thesis is an attempt to provide the analytical solutions of these models, even if their form is complicated.
In more detail, the first chapter of the study contains a review of the most fundamental fractional-analysis-theory elements that we will use, such as: Mittag-Leffler functions, their basic properties, calculation of Laplace transformation for specific forms of these functions, definition of the fractional integral and the fractional derivative of functions. In the second chapter the binding of compartmental analysis with pharmacokinetics is analyzed. In the third chapter the binding of fractional calculus with pharmacokinetics is described, as well as the reasons why this approach is superior to the previous approaches that were used until 2009. The fourth chapter contains applications of fractional calculus. The analytical solutions for the fractional differential equations linear systems that arise are also given.
Furthermore, Appendix A includes some elements related to the mass balance, while Appendix B contains the results and graphs of the applications that were studied in the fourth chapter. Finally, Appendix C provides the Mathematica code that were used for the illustration of the analytical solutions.
|
2 |
Model based characterization of pharmacokinetic interaction between voriconazole and cytarabine in patients with acute myeloid leukemiaΜατθιός, Ανδρέας 06 November 2014 (has links)
Voriconazole is a broad spectrum antifungal agent. Patients with acute myeloid leukemia that are susceptible to fungal infections receive simultaneously voriconazole and antitumor regimens. Drug-drug interactions between voriconazole and cytarabine involving the CYP3A4 enzyme are thought to affect the pharmacokinetic profile of the drugs and as a result their toxicological or pharmacological outcome. Population pharmacokinetic models were used to characterize these interactions and optimize the dose schemes after coadministration. Simulations and estimations were conducted by using NONMEM. The optimal dose for one hour intravenous infusion of voriconazole was estimated to 5mg/h. The proposed time points based on the pharmacokinetic profile of voriconazole for validated the model by using a small cohort of patients are 2h, 26h, 27h, 50h, 51h, 120h, 335h, 336h after the first administration of the antifungal agent. / Η βορικοναζόλη αποτελεί έναν ευρέως φάσματος αντιμυκητιασικό παράγοντα. Ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ) που θεωρούνται ευπαθείς στην ανάπτυξη μυκητιάσεων λαμβάνουν βορικοναζόλη σε συγχορήγηση με τα αντικαρκινικά φάρμακα. Αλληλεπιδράσεις φαρμάκων που λαμβάνουν χώρα κατά την διάρκεια του μεταβολισμού των χρησιμοποιούμενων φαρμάκων από κοινά ισοένζυμα του κυττοχρώματος P450 πιθανότατα να επιρεάζουν το φαρμακοκινητικό προφίλ τών φαρμάκων. Πληθυσμιακά φαρμακοκινητικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό αυτών των αλληλεπιδράσεων και την βελτιστοποίηση του δοσολογικού σχήματος. Προσομοιώσεις και υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν μέσω του προγράμματος NONMEM. Η βέλτιστη δόση μετά μια ώρα έγχυσης της βορικοναζόλης είναι 5mg/L. Τα προτεινόμενα χρονικά σημεία βασισμένα στο φαρμακοκινητικό προφίλ της βορικοναζόλης για την διεξάγωγή μικρού μήκους κλινικής μελέτης που θα επιτρέψει την αξιολόγηση του μοντέλου είναι 2h, 26h, 27h, 50h, 51h, 120h, 335h, 336h μετά την χορήγηση του αντιμυκητιασικού φαρμάκου.
|
3 |
Δόμηση υπολογιστικού μηχανισμού πρόβλεψης της δράσης και των παρενεργειών των νευροψυχιατρικών φαρμάκωνΣολωμού, Αναστασία 20 September 2010 (has links)
Στην καθημερινή ιατρική πρακτική υπάρχουν δυσκολίες κατά την επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού σχήματος που ωφελεί ατομικά τον ασθενή, ο οποίος αποτελεί μία ξεχωριστή και μοναδική οντότητα.
Η διαδικασία που ακολουθεί ένα φάρμακο από τη στιγμή που λαμβάνεται ακολουθεί τους κανόνες της φαρμακοκινητικής και φαρμακοδυναμικής, που με τη σειρά τους εξαρτώνται από παράγοντες όπως είναι η ηλικία, το φύλο, το περιεχόμενο του γαστρεντερικού σωλήνα (ΓΕΣ), ο τρόπος ζωής του ατόμου, οι συνήθειές του, οι συμπαρομαρτούσες νόσοι καθώς και άλλα φάρμακα που μπορεί να συγχορηγούνται. Οι μοριακοί μεσολαβητές όλων αυτών των παραγόντων υπόκεινται σε διακύμανση που απορρέει από την ύπαρξη γενετικών πολυμορφισμών. Γενετικοί πολυμορφισμοί σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες-μεταφορείς διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο. Οι παράγοντες αυτοί συνολικά επηρεάζουν την «τύχη» του φαρμάκου στον οργανισμό μέσω προαγωγής ή αναστολής μεταφορέων του τοιχώματος του ΓΕΣ, μέσω μεταβολής του pH ή της βακτηριακής χλωρίδας, μέσω αναστολής ή προαγωγής του μεταβολισμού του στο ήπαρ ή και μέσω της επιρροής της απέκκρισης και της κατανομής του φαρμάκου. Όσον αφορά την φαρμακοδυναμική, δηλαδή το αποτέλεσμα του ιδίου του φαρμάκου στον οργανισμό, επίσης εξαρτάται από τους παραπάνω παράγοντες όπως η ηλικία, το φύλο, συνοδές παθήσεις, άλλα φάρμακα ή χημικές ουσίες (που τυχόν δρουν ως ανταγωνιστές της θέσης δράσης) και φυσικά, οι γενετικοί πολυμορφισμοί των υποδοχέων θέσεων δράσης.
Στην ιατρική πράξη και κατά τη συνταγογράφηση πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όλα τα προαναφερθέντα στοιχεία. Φυσικά, η πολυπλοκότητα αυτού κάνει κάτι τέτοιο να φαίνεται αδύνατο για έναν ιατρό. Για το λόγο αυτό, θα επιχειρηθεί ο θεωρητικός σχεδιασμός ενός υπολογιστικού συστήματος-λογισμικού που θα υλοποιήσει τον μέχρι τώρα ακατόρθωτο συνδυασμό όλων αυτών των αποσπασματικών παραμέτρων που επηρεάζουν την δράση των φαρμάκων και συγκεκριμένα των νευροψυχιατρικών.
Η υλοποίηση ξεκινά με τη συλλογή των δεδομένων που στο εξής ονομάζονται παράμετροι-μεταβλητές του συστήματος και των οποίων ο συνδυασμός θα δίνει το αναμενόμενο αποτέλεσμα της χρήσης ενός νευροψυχιατρικού φαρμάκου σε κάθε ασθενή ξεχωριστά, αναλόγως της ηλικίας, του φύλου, του τρόπου ζωής, τις συνοδές παθήσεις, συγχορηγούμενα φάρμακα και τυχόν γνωστών γενετικών πολυμορφισμών.
Το σύστημα θα είναι έτσι σχεδιασμένο, ώστε ανά πάσα στιγμή θα μπορούν να διοχετευθούν νέα δεδομένα, ανάλογα με την πρόοδο της έρευνας.
Στο μέλλον, θα μπορούσε η μελέτη αυτή να θέσει τις βάσεις για ένα πλήρες σύστημα πρόβλεψης της δράσης όλων των κατηγοριών των φαρμάκων για τον ξεχωριστό ασθενή με απώτερο σκοπό την αποτελεσματικότερη και ασφαλέστερη ατομική θεραπεία. / -
|
4 |
Εξατομίκευση της εφαρμογής του tacrolimus σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού : φαρμακοκινητική και φαρμακογενετική προσέγγισηΚατσακιώρη, Παρασκευή 27 December 2010 (has links)
Το tacrolimus παραμένει ο ακρογωνιαίος λίθος στην ανοσοκατασταλτική αγωγή που λαμβάνουν οι ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού. Το στενό θεραπευτικό παράθυρο και η σημαντική ενδοϋποκειμενική και διϋποκειμενική διακύμανση της κινητικής του εκθέτει τον ασθενή στον κίνδυνο υπερδοσολογίας και πιθανής εμφάνισης τοξικότητας ή υποδοσολογίας και κινδύνου απόρριψης του μοσχεύματος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η φαρμακοκινητική και η φαρμακογενετική προσέγγιση με στόχο την εξατομίκευση της χρήσης του tacrolimus σε ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού.
Τον πληθυσμό μελέτης αποτέλεσαν 40 ασθενείς με μεταμόσχευση νεφρού της Νεφρολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών. Η γονοτύπιση αφορούσε στην ανεύρεση του CYP3A5*1 και *3 αλληλομόρφου και πραγματοποιήθηκε με τη μεθοδολογία της απόμονωσης DNA από λευκά αιμοσφαίρια περιφερικού αίματος των ασθενών, την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τον πολλαπλασιασμό του τμήματος ενδιαφέροντος και την ανάλυση πολυμορφισμού περιοριστικών θραυσμάτων. Για τη στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν το Student’s t-test ή τo Mann-Whitney test, ανάλογα με το εάν οι μεταβλητές ακολουθούσαν κανονική ή όχι κατανομή, η μέθοδος της γραμμικής παλινδρόμησης και η μεθόδος των γενικευμένων γραμμικών μοντέλων-ανάλυση επαναλαμβανόμενων μετρήσεων.
Η συχνότητα του CYP3A5*3/*3 και CYP3A5*1/*3 γονοτύπου ήταν 87,5% (35/40) και 12,5% (5/40), αντίστοιχα. Δεν ανευρέθησαν ομοζυγώτες για το CYP3A5*1 αλληλόμορφο. Ανεδείχθη συσχέτιση του CYP3A5*1 με χαμηλότερες προβλεπόμενες τιμές της προσαρμοσμένης στη δόση συγκέντρωσης και υψηλότερες προβλεπόμενες τιμές του όγκου κατανομής του υπό μελέτη φαρμάκου. Οι ασθενείς που έφεραν το CYP3A5*1 αλληλόμορφο απαιτούσαν υψηλότερες δόσεις tacrolimus για την επίτευξη της επιθυμητής συγκέντρωσης στο αίμα σε σχέση με τους ομοζυγώτες για το CYP3A5*3 νωρίς αλλά και στην απώτερη φάση μετά τη μεταμόσχευση. Η επίδραση της χρονικής στιγμής, δηλαδή του χρόνου μετά τη μεταμόσχευση, στην κινητική του tacrolimus ήταν σημαντική ενώ δεν ανεδείχθη σημαντική επίδραση του φύλου. Δεν ανευρέθη ανάγκη για πιο τακτικό έλεγχο από το σύνηθες της συγκέντρωσης του tacrolimus σε μεταμοσχευμένους νεφρού που δεν εκφράζουν το CYP3A5 και λαμβάνουν ομεπραζόλη ή στατίνη (ατορβαστατίνη, σιμβαστατίνη, πραβαστατίνη ή φλουβαστατίνη). Η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα των στατινών διατηρήθηκε κατά τη συγχορήγηση με tacrolimus.
Η φαρμακοκινητική και η φαρμακογενετική προσέγγιση αναδεικνύουν τις γενετικές και επιγενετικές εκείνες παραμέτρους που επηρεάζουν την κινητική του tacrolimus και συμβάλλουν στην εξατομίκευση της χορήγησής του. / Tacrolimus remains the centerpiece of the maintenance treatment scheme in renal transplant recipients. Both its narrow therapeutic window and its highly pharmacokinetic variance may lead to overtreatment and toxicity or insufficient treatment and transplant rejection, conditions that are usually seen in clinical practice. Our aim was to determine the impact of patient characteristics, drug-to-drug interactions and genotype (presence of CYP3A5*1 and CYP3A5*3) on the kinetics of tacrolimus in renal transplant recipients.
Our patient population consisted of 40 renal transplant recipients. CYP3A5 genotyping was performed based on the following procedures: DNA extraction from blood, polymerase chain reaction and accordingly, restriction fragment length polymorphism. Statistical analysis was performed with Student’s t-test or Mann-Whitney test, according to the presence of normality of the studied parameters, linear regression analysis and general linear model-repeated measures.
The frequency of CYP3A5*3/*3 genotype was 87.5% (35/40) whereas the frequency of the CYP3A5*1/*3 genotype was 12.5% (5/40). No individual homozygote for CYP3A5*1 was detected. CYP3A5*1 variant was associated with significant lower tacrolimus dose adjusted concentration. Carriers of CYP3A5*1 allele had lower predicted measures for tacrolimus dose adjusted concentration and higher predicted measures for volume of distribution. Timepoint, in contast with gender, had a statistically significant impact on tacrolimus kinetics. No statistically significant difference was observed in tacrolimus kinetics during the coadministration of omeprazole or statin. Statistically significant decrease in serum cholesterol was observed after the initiation of statin whilst renal and hepatic function remained unchanged. No skeletal muscle abnormalities were reported during the coadministration of statin.
Pharmacokinetic and pharmacogenetic approach can be used to elucidate genetic and epigenetic factors that influence tacrolimus kinetics and thus, they can contribute to dose individualization.
|
5 |
Φαρμακοκινητικός και φαρμακοδυναμικός χαρακτηρισμός μιας μεταλλαγμένης μορφής της απολιποπρωτεϊνης Ε με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες / Pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of a recombinant apolipoprotein E variant apoE4 with improved biological propertiesΛαμπροπούλου, Αγγελική 31 January 2013 (has links)
Φυσιολογικά επίπεδα της αγρίου τύπου απολιποπρωτεϊνης Ε (apoE) στο πλάσμα διαμεσολαβούν στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών ενώ υψηλότερα επίπεδα από τα φυσιολογικά προκαλούν υπερτριγλυκεριδαιμία. Αυτή η ιδιότητα της αγρίου τύπου apoE μειώνει σημαντικά την θεραπευτική της αξία ως ένα πιθανό βιολογικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας. Πρόσφατα, έχει δημιουργηθεί και μελετηθεί μια μεταλλαγμένη μορφή της apoE, apoE4 [ L261A, W264A, F265A, L268A, V269A ] (apoE4mut1) με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, αυτή η μεταλλαγμένη μορφή μπορεί να φέρει τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σε φυσιολογικές τιμές χωρίς να προκαλέσει υπερτριγλυκεριδαιμία ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε φαρμακοδυναμική και φαρμακοκινητική ανάλυση της apoE4mut1 σε πειραματόζωα. Με γονιδιακή μεταφορά μέσω ιού σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στον LDL υποδοχέα (LDLr-/-) και σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στην apoE (apoE-/-), δείχθηκε οτι η δράση της apoE4mut1 ( μείωση της χοληστερόλης ) εξαρτάται από την έκφραση ενός λειτουργικού κλασσικού LDL υποδοχέα. Εφάπαξ έγχυση της apoE4mut1 συνδεδεμένης με λιποσώματα σε apoE-/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 6 εβδομάδες αποκάλυψε οτι η εξωγενώς συντιθέμενη apoE4mut1 διατηρεί άθικτη την ικανότητά της να κανονικοποιεί τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης αυτών των ποντικιών με μια μέγιστη φαρμακολογική απόκριση που παρατηρείται σε μόλις 10 ώρες μετά την έγχυση. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός οτι τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος παρέμειναν σημαντικώς μειωμένα για τις επόμενες 24 ώρες μετά την έγχυση της apoE4mut1- λιποσώματα. Μετρήσεις συγκεντρώσεων της apoE έδειξαν οτι η apoE4mut1 στην μορφή των πρωτεολιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει χρόνο ημίσειας ζωής 15.8 h. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα οτι η καθαρή apoE4mut1 μπορεί να αποτελέσει ένα νέο υποψήφιο φάρμακο για την άμεση αντιμετώπιση της υπερχοληστερολαιμίας σε άτομα που εκφράζουν έναν λειτουργικό LDL υποδοχέα. / Physiological levels of wild-type (wt) apolipoprotein E (apoE) in plasma mediate the clearance of cholesterol-rich atherogenic lipoprotein remnants while higher than normal plasma apoE concentrations fail to do so and trigger hypertriglyceridemia. This property of wt apoE reduces significantly its therapeutic value as a potential biological drug for dyslipidemia. Recently, we reported the generation of a recombinant apoE variant, apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] (apoE4mut1) with improved biological functions. Specifically, this variant can normalize high plasma cholesterol levels without triggering hypertriglyceridemia, even at supraphysiological levels of expression. In the present study we performed pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4mut1 in experimental mice. Using adenovirus-mediated gene transfer in LDL receptor deficient (LDLr-/-) and apoE deficient (apoE-/-) mice, we show that the cholesterol lowering potential of apoE4mut1 is dependent on the expression of a functional classical LDLr. Bolus infusion of apoE4mut1-containing proteoliposomes in apoE-/- mice fed western-type diet for 6 weeks indicated that exogenously synthesized apoE4mut1 maintains intact its ability to normalize the high cholesterol levels of these mice with a maximum pharmacological effect obtained at only 10 hours post-treatment. Interestingly, plasma cholesterol levels remained significantly reduced even 24 hours following intravenous infusion of apoE4mut1 proteoliposomes. Measurements of plasma apoE levels indicated that apoE4mut1 in the form of proteoliposomes used in the study has a half-life of 15.8 h. Our data suggest that purified apoE4mut1 may be an attractive new candidate for the acute correction of hypercholesterolemia in subjects expressing functional LDL receptor.
|
6 |
Ανάπτυξη, βιοκατανομή και φαρμακοκινητική μελέτη πεπτιδικών αναλόγων μπομπεσίνης επισημασμένων με διαγνωστικά ραδιονουκλίδια για την αντιμετώπιση του καρκίνου / Radiochemical, radiopharmacological, biodistribution and pharmacokinetic studies for the development of new bombesin analogues radiolebeled with diagnostic radionuclides for the treatment of cancerΛιόλιος, Χρήστος 22 March 2013 (has links)
Η παρούσα διατριβή αναφέρεται στην ανάπτυξη νέων πεπτιδικών αναλόγων μπομπεσίνης (ΒΝ) με απώτερο στόχο την ενδεχόμενη κλινική εφαρμογή τους στο πεδίο της διαγνωστικής ογκολογίας με SPECT (Υπολογιστική Τομογραφία Εκπομπής ενός Φωτονίου, Single-photon emission computed tomography) και PET (Τομογραφία Εκπομπής Ποζιτρονίων, Positron emission tomography). Η ΒΝ αποτελεί έναν εξειδικευμένο πεπτίδιο-προσδέτη για τους υποδοχείς του πεπτιδίου απελευθέρωσης της γαστρίνης (gastrin-releasing peptide receptors, GRPrs), οι οποίοι υπερεκφράζονται στην επιφάνεια διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων. Οι υποδοχείς GRP δυνητικά θα μπορούσαν να θεωρηθούν ιδανικός στόχος για την απεικόνιση νευροενδοκρινικών όγκων μετά από χορήγηση ραδιοεπισημασμένων παραγώγων ΒΝ, με τεχνικές μοριακής διαγνωστικής, αλλά και για την στοχευμένη θεραπευτική αντιμετώπιση του καρκίνου. Με αυτό τον στόχο σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα ΒΝ για τα οποία πραγματοποιήθηκε μία σειρά προκλινικών μελετών με σκοπό τη διαμόρφωση και την εφαρμογή ενός πλαισίου διάκρισης των κατάλληλων ραδιοχημικών και ραδιοφαρμακολογικών χαρακτηριστικών τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν ένα από αυτά τα υποψήφια διαγνωστικά σκευάσματα του σε κλινικές μελέτες ανίχνευσης του καρκίνου.
Μέθοδος: Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα BN, κατάλληλα για επισήμανση με ραδιονουκλίδια, με την παρακάτω γενική δομή:
Υ-Χ-ΒΝ(2-14)
όπου Υ = ο χηλικός παράγοντας για τη σύμπλεξη του ραδιομετάλλου, Χ = η συνδετική ομάδα και ΒΝ(2-14) το φαρμακοφόρο τμήμα. (a) Προκειμένου να απεικονισθούν όγκοι με SPECT όπου: Υ = [GlyGlyCys-] για τη σύμπλεξη με το 99mTc και το 185/187Re (μη ραδιενεργό), Χ = -(αργινίνη)3-, (BN-A), ή -(ορνιθίνη)3-, (BN-O). (b) Ενώ για τη μοριακή απεικόνιση όγκων με την τεχνική PET, όπου Υ = [c-carboxylic acid-cyclam] για σύμπλεξη με 64Cu, και Χ = -(ορνιθίνη)3-, (BN-C). Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε το τμήμα της φυσικής αλληλουχίας του πεπτιδίου μπομπεσίνη, από το 2o εως το 14ο αμινοξύ, σε συνδυασμό με αμινοξική, θετικά φορτισμένη, συνδετική ομάδα (spacer). Τα παραπάνω παράγωγα και τα αντίστοιχα σύμπλοκα τους με τα μέταλλα αρχικά αξιολογήθηκαν χημικά και ραδιοχημικά με διάφορες αναλυτικές μεθόδους. Ακολούθησε η ραδιοφαρμακολογική αξιολόγηση τους με τις παρακάτω in vitro δοκιμασίες: (a) μελέτη σταθερότητας σε δείγματα αίματος, (b) προσδιορισμός της συγγένειας τους με τον GRPr (υπολογισμός τιμών IC50) και (c) του ρυθμού εσωτερικοποίησης/εξωτερικοποίησης σε κύτταρα PC-3 (ανθρώπινου καρκίνου προστάτη). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν μελέτες in vivo (βιοκατανομή, απεικόνιση με γ-κάμερα), σε φυσιολογικά ζωικά πειραματικά πρότυπα (ποντίκια, αρουραίους και κουνέλια) και σε πειραματικά πρότυπα καρκίνου (ποντίκια SCID, με όγκους από κύτταρα PC-3). Επιπλέον με βάση τα in vivo αποτελέσματα διεξάχθηκε η φαρμακοκινητική αξιολόγηση τους και ο συσχετισμός μεταξύ δομικών και φαρμακοκινητικών χαρακτηριστικών. Τέλος επιχειρήθηκε η αλλομετρική κλιμάκωση των φαρμακοκινητικών αποτελεσμάτων από τα διάφορα είδη πειραματοζώων στον άνθρωπο.
Αποτελέσματα: Για τα παράγωγα τα οποία συντέθηκαν για σύμπλεξη με 99mTc προκειμένου να απεικονισθούν όγκοι με SPECT, παρατηρήθηκαν τα εξής: Τα BN-A και BN-O συμπλέχθηκαν αποτελεσματικά με το 99mTc (απόδοση > 98%), αλλά και το χημικά όμοιο του ρήνιο (μη ραδιενεργό). Κατά τις μελέτες σταθερότητας το παράγωγο 99mTc-BN-O αποδείχθηκε σταθερότερο του 99mTc-BN-Α, (π.χ. πλάσμα του ποντικού σε 5 min επώασης το % άθικτο πεπτίδιο ήταν 44.28 και 42.48, ενώ στο ανθρώπινο πλάσμα σε 1 ώρα επώασης ήταν 63.05 και 60.2 αντίστοιχα).
Η συγγένεια πρόσδεσης στον GRPr των παραπάνω παραγώγων, αλλά και των συμπλόκων τους με το μη ραδιενεργό Re, τα οποία προσομοιάζουν τα αντίστοιχα ραδιενεργά σύμπλοκα τους με το 99mTc (IC50, BN-Α, 0.5 ± 0.09, 185/187Re-BN-A, 1.58 ± 0.16, BN-Ο, 0.46 ± 0.04, 185/187Re-BN-Ο, 0.77 ± 0.07 nM), ήταν κοντά στο πρότυπο [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Το συνολικό ποσοστό εσωτερικοποίησης των παραπάνω συμπλόκων 99mTc-BN-Α και 99mTc-BN-Ο στα κύτταρα PC-3 ήταν παρόμοιο (~25%), αλλά ο ρυθμός εσωτερικοποίησης τους διέφερε, καθώς χρειάστηκαν 120 min και 60 min για φτάσουν τη μέγιστη τιμή εσωτερικοποίησης αντίστοιχα. Ο ρυθμός εξωτερίκευσης ήταν ο ίδιος. Μετά από 90 min επώασης το ~ 70% της αρχικής ποσότητας πεπτιδίου παραμένει εγκλωβισμένο στα κύτταρα.
Από τις μελέτες βιοκατανομής και φαρμακοκινητικής του 99mTc-BN–A και του 99mTc-BN–Ο σε φυσιολογικά ποντίκια φάνηκε ότι και τα δύο ραδιοπεπτίδια απομακρύνονται γρήγορα από το αίμα, καθώς μικρό ποσοστό της χορηγούμενης δόσης (ID)/g (2.61 και 2.76 % αντίστοιχα) παραμένει 30 min μετά τη χορήγηση (p.i.). Η βασική οδός απομάκρυνσης τους από τον οργανισμό ήταν το ουροποιητικό σύστημα καθώς μεγάλο ποσοστό των ραδιοπεπτιδίων εντοπίστηκε στα ούρα 1 h p.i. (64.16 και 56.33 % ID αντίστοιχα). Το γεγονός αυτό συσχετίσθηκε με την παρουσία της θετικά φορτισμένης συνδετικής ομάδας. Η νεφρική απέκκριση επιδιώκεται έναντι της ηπατοχολικής, γιατί με αυτόν τον τρόπο μειώνεται η συσσώρευση της ραδιενέργειας στην άνω κοιλιακή χώρα και διευκολύνεται η εντόπιση όγκων στην περιοχή αυτή. Το 99mTc-BN–A απομακρύνεται ταχύτερα από το αίμα από τα νεφρά και γενικότερα από τον οργανισμό από ότι το 99mTc-BN–Ο, αλλά εμφανίζει μεγαλύτερη συσσώρευση στο ήπαρ (4.43 ± 1.04 και 0.99 ± 0.20 %ID/g, 60 min p.i. αντίστοιχα). Από τις μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης με γ-κάμερα σε ποντίκια SCID με όγκους PC-3 το παράγωγο 99mTc-BN–A εντόπισε αποτελεσματικά τον όγκο. Μετά από πειράματα συγχορήγησης φυσικής ΒΝ παρατηρήθηκε μείωση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου στον όγκο και στο πάγκρεας, τα σημεία στα οποία εντοπίζονται υποδοχείς GRPrs, επιβεβαιώνοντας έτσι την ειδική δέσμευση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου σε αυτούς. Συγκρίνοντας τα παραπάνω αποτελέσματα με το 99mTc-BN–Ο διαπιστώθηκαν καλύτεροι λόγοι διάκρισης από το 99mTc-BN–A στους διάφορους χρόνους μελέτης (π.χ. 60 min p.i. ήταν όγκος/αίμα, 6.67 έναντι 3.62, όγκος/μύες, 14.0 έναντι 5.60, όγκος/ήπαρ, 2.9 έναντι 0.82, αντίστοιχα). Εξαιτίας όλων των παραπάνω αποτελεσμάτων το παράγωγο 99mTc-BN-Ο επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Για το 99mTc-BN-Ο πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω in vitro μελέτες σταθερότητας σε πλάσμα αίματος αρουραίων και κουνελιών και in vivo μελέτες βιοκατανομής (απεικόνισης σε γ-καμερα). Παράλληλα πραγματοποιήθηκε και η φαρμακοκινητική ανάλυση των δεδομένων. Επιπλέον επιχειρήθηκε να αντιμετωπισθεί το πρόβλημα της νεφρικής συσσώρευσης του 99mTc-BN-Ο στα νεφρά με τη συγχορήγηση Gelofusine (Gelo). Από τη συγχορήγηση Gelo στα φυσιολογικά (ποντίκια, αρουραίοι) και καρκινικά πειραματικά πρότυπα (ποντίκια SCID με όγκους PC-3) παρατηρήθηκαν ταχύτερη κάθαρση του αίματος και αποβολής από τα νεφρά. Τέλος πραγματοποιήθηκε πρωτότυπη μελέτη αλλομετρικής κλιμάκωση των φαρμακοκινητικών αποτελεσμάτων του 99mTc-BN-Ο με στόχο την πρόβλεψη της συμπεριφοράς του καθώς της συμπεριφοράς παρόμοιων μορίων στον άνθρωπο κατά τη διεξαγωγή κλινικών μελετών.
Εξαιτίας των παραπάνω θετικών αποτελεσμάτων αναφορικά με το τμήμα Η2Ν-(ορνιθίνη)3-ΒΝ(2-14) και προκειμένου να επιτευχθεί η βελτιστοποίηση της ικανότητα σύμπλεξής του με ιόντα χαλκού (π.χ. 64Cu για διάγνωση με PET) συνδέθηκε ομοιοπολικά με αυτό ένας νέος χηλικός παράγοντα το c-carboxylic acid cyclam. Από την ομοιοπολική σύζευξη των παραπάνω προέκυψε ένας νέο ανάλογο ΒΝ, το ΒΝ-C. Με τη χρήση διαφόρων αναλυτικών τεχνικών (IR, UV-Vis, ESI-MS, ESR, κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ) διαπιστώθηκε ότι τόσο ο c-carboxylic acid cyclam όσο και ΒΝ-C, ο τελικός πεπτιδικός προσδέτης, έχουν την ικανότητα σύμπλεξης με CuII. Το πεπτιδικό παράγωγο BN-C και το σύμπλοκο του με το χαλκό, Cu-BN-C. δοκιμάσθηκαν ως προς τη συγγένεια δέσμευσης τους με τον GRPr σε κυτταρικές καλλιέργειες PC-3 όπου και παρουσίαζαν συγγένεια (IC50 = 0.3 ± 0.03 και 0.33 ± 0.03 nM, αντίστοιχα) παρόμοια με το πρότυπο πεπτίδιο προσδέτη [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM).
Συμπέρασμα: Οι παραπάνω μελέτες οριοθετούν ένα γενικότερο πλαίσιο προκλινικού προσδιορισμού εκείνων των ραδιοχημικών και ραδιοφαρμακολογικών in vitro και in vivo ιδιοτήτων, οι οποίες θα μπορούσαν να οδηγήσουν ένα παράγωγο ΒΝ σε περαιτέρω κλινικές μελέτες. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκε και αναπτύχθηκε ένα πεπτιδικό ανάλογο ΒΝ, το οποίο σε κάθε περίπτωση αποδείχθηκε ότι διαθέτει τον κατάλληλο συνδυασμό των παραπάνω χαρακτηριστικών για περαιτέρω ανάπτυξη ως ραδιοδιαγνωστικό σκεύασμα για SPECT (BN-O) και PET (ΒΝ-C) σε κλινικό επίπεδο. Επιπλέον η φαρμακοκινητική ανάλυση και η αλλομετρική κλιμάκωση των παραπάνω αποτελεσμάτων συνεισφέρουν σημαντικά στην αύξηση της πιθανότητας μελλοντικής κλινικής εφαρμογής των παραπάνω παραγώγων στον άνθρωπο. / The present Thesis refers to the development of new peptidic bombesin (BN) analogs for application in the field of tumor diagnosis with the SPECT (Single-photon emission computed tomography) and PET (Positron emission tomography) techniques. The BN peptide is a specific ligand for the gastrin-releasing peptide receptors (GRPrs), which are over-expressed on the surface of various types of tumor cells. GRPrs can be considered as an ideal target for radiolabeled BN analogues in the molecular diagnosis of neuro-endocrine tumors as well as in the targeted treatment of cancer. Taking the above into consideration, three BN analogues were designed and synthesized as potential molecular diagnostics of tumors. Thus, a series of preclinical studies were conducted in order to find out the best candidate for further development in clinical studies.
Methods: All the BN analogues of the present study can be described by the following general structure:
Υ-Χ-ΒΝ(2-14)
Where Y = the chelator group for the radionuclide, X = a spacer group and BN(2-14) = the pharmacophore group. (a) For the diagnosis of tumors with SPECT: Υ = [GlyGlyCys-], suitable for the complexation of 99mTc and 185/187Re and X= -(arginine)3-, (BN-A), or -(ornithine)3-, (BN-O). (b) Further on, for tumor diagnosis with PET: Υ = [c-carboxylic acid-cyclam] suitable for the complexation of 64Cu, και Χ = -(ornithine)3-, (BN-C). For all the above cases the part from the 2nd to the 14th amino acid of the naturally occurring BN was used, in combination with a spacer group composed of three positively charged amino acids. The amino acids were either naturally occurring (arginine) or not (ornithine). The above BN analogues as well as their metal complexes were chemically and radiochemically analyzed and evaluated in vitro. The in vitro evaluation of the BN derivatives included assays for the determination of (a) their stability in blood samples, (b) their affinity for the GRPrs (by the calculation of their IC50 values), (c) as well as of their internalization and externalization rates in PC-3 cell (human prostate cancer cell line) cultures. Additionally a series of in vivo assays were conducted including: biodistibution studies in normal (mice, rats, rabbits) and in experimental cancer animal models (SCID mice with PC3 tumors). For the later in addition to the biodistribution tumor imaging studies were carried out using an experimental small animal gamma camera. Based on the results of the in vivo studies, a series of pharmacokinetic analyses were performed and the results were correlated with the structural characteristics of the BN analogues. Finally, the results from the pharmacokinetic analyses of the three different animal species, (mouse, rat, rabbit) were combined and scaled up for a human of 70 Kg, by using the allometric approach.
Results: The BN analogues BN-A and BN-O, which were designed for application in tumor imaging with SPECT, were able to form stable complexes with 99mTc (in high yield > 98%), as well as with Re (non radioactive). The two elements 99mTc and Re belong to the same group of the Periodic Table of elements and thus they are considered to have similar chemical properties. During the in vitro stability assays 99mTc-BN-O prove to be more stable than the 99mTc-BN-Α i.e. the % percentages of intact peptide for mouse plasma (after 5 min incubation) were 44.28 and 42.48 %, while for human plasma the percentages of intact peptide (after 1h of incubation) were 63.05 and 60.2 respectively.
The affinities (IC50 values) of BN-Α (0.5 ± 0.09 nM), and BN-Ο (0.46 ± 0.04 nM), as well as of their non radioactive complexes with Rhenium 185/187Re-BN-A, 1(.58 ± 0.16 nM) and 185/187Re-BN-Ο (0.77 ± 0.07 nM) were similar to the one of the control peptide [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM). Although the total amount of internalized radiolabeled peptide was the same for both 99mTc-BN-Α and 99mTc-BN-O (~25%), their rates of internalization differed. The ornithine-spacer analogue, 99mTc-BN-O, internalized a lot faster (60 min for maximum internalization plateau) than the arginine-spacer analogue, 99mTc-BN-Α (120 min for maximum internalization plateau). The externalization rates for both analogues were the same, with ~ 70% of the initially internalized radiolabeled peptide remaining inside the cells even after 90 min of incubation.
From the biodistribution and pharmacokinetic studies of 99mTc-BN–A and 99mTc-BN–Ο a fast blood clearance was observed for both peptides, with small amounts of the initial dose remaining in the blood stream 30 min p.i. (2.61 and 2.76 % ID/g, respectively). The main clearance route throughout the body in both cases was the urinary system and high percentages of the radiolabeled peptides were detected in the urine 1 h p.i (64.16 and 56.33 % ID respectively). The latter was related to the presence of the positively charged spacer group. A clearance through the urinary system is preferred instead of the hepatobiliary system since in that way the decrease of the upper abdominal region background radiation is achieved. Although the arginine-spacer analogue 99mTc-BN–A was cleared from the kidneys and the body with higher rates than 99mTc-BN–Ο, it showed a higher liver accumulation than the latter (4.43 ± 1.04 and 0.99 ± 0.20 %ID/g, 60 min p.i. respectively).
Both in the biodistribution and in the gamma-camera tumor-imaging studies the BN analogue 99mTc-BN–A was able to efficiently locate the tumour. During the GRPrs blocking studies the amount of 99mTc-BN–A was reduced both in the tumour and in the pancreas, where the GRPrs are located, proving thus the specific binding of 99mTc-BN–A to those receptors. Comparing the tumor/normal tissue contrast ratios between 99mTc-BN–Ο and 99mTc-BN–A the ornithine spacer analogue proved a better choice since it presented greater values (i.e. 60 min p.i. tumor/blood, 6.67 vs 3.62, tumor/muscle, 14.0 vs 5.60, tumor/liver, 2.9 vs 0.82, respectively).
According to all the above results 99mTc-BN-Ο was selected between the two SPECT tumor imaging agent candidates for further studies. For 99mTc-BN-Ο additional in vitro stability assays were conducted in rats and rabbits plasma, which were followed by in vivo biodistribution studies in normal rats and imaging studies in normal rabbits. The in vivo data were analyzed with the appropriate pharmacokinetic approaches.
In an effort to achieve a faster clearance of 99mTc-BN-Ο from the kidneys a new approach was tested by its co-injection with Gelofusine (Gelo). During the Gelo co-injection studies in normal mice, in rats as well as in SCID mice with PC-3 tumors a faster renal clearance was observed. Finally by combining the in vivo results of 99mTc-BN-Ο from the three different animal species (mice, rats, rabbits) the allometric scale up of the pharmacokinetic parameters was achieved and the prediction of those parameters for a man of 70 kg. The results of latter study could probably be extended to predict the pharmacokinetic profile of other similar molecules in the preclinical stage of development.
Due to promising results of obtained from the BN analogue with the ornithine spacer, Η2Ν-(ornithine)3-ΒΝ(2-14), and in order to improve its ability to form complexes with copper radionuclides i.e. 64Cu, which are suitable for PET imaging, a new chelator group was introduced into the peptide sequence. The chelator group c-carboxylic acid cyclam was covalently attached to the peptide chain Η2Ν-(ornithine)3-ΒΝ(2-14) to give a new bombesin analogue ΒΝ-C. The chelator group and the new BN analogue were able to form complexes with cold copper fast and under mild conditions. The copper complexes of the above molecules were analyzed with a variety of techniques like IR, UV-Vis, ESI-MS, ESR, X ray crystallography. Additionally both the BN analogue BN-C and its complex with copper Cu-BN-C were tested for their affinity for GRPrs in PC-3 cell lines, where it was found that their IC50 values of both were similar (IC50 = 0.3 ± 0.03 και 0.33 ± 0.03 nM, respectively) to the control peptide [Tyr4]-BN (0.45 ± 0.04 nM).
Conclusion: The above studies can be considered the essential parts of a discrimination process of the ideal radiochemical and radiopharmacological characteristics, which could lead a BN analogue to clinical trials. According to the results of the above preclinical studies a suitable BN analogue was selected for further clinical development as a tumor imaging agent with SPECT (BN-O) as well as PET (ΒΝ-C). Additionally the pharmacokinetic analysis in three different animal species and allometric scale up of those parameters for the human will enhance the probability of its further application in clinical trials.
|
7 |
In vivo βιολογική αξιολόγηση και φαρμακοκινητική μελέτη με χρήση HPLC-MS-MS του Leuprolide και αναλόγων του που εμπλέκονται στη θεραπεία του καρκίνου / In vivo biological evaluation and pharmacokinetic studies of Leuprolide and analogues in the treatment of cancer, using HPLC-MS-MSΚατσίλα, Θεοδώρα 12 January 2012 (has links)
Ιστορικά, τα ευρήματα των C.B. Huggins (Huggins and Hodges, 1941; Huggins, 1963) και A.V. Schally (Schally et al., 1984) αποτέλεσαν την απαρχή μιας ερευνητικής πορείας με αφετηρία το πεδίο της νευροενδοκρινολογίας και προορισμό εκείνα της γυναικολογίας και της ογκολογίας. Η γνώση αναφορικά με τη φυσιολογία της ενδογενούς ορμόνης (LHRH) και το ρόλο της στην παθοβιοχημεία των ασθενειών (ενδοκρινικών διαταραχών και ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων) και υπό το πρίσμα της πρωτεύουσας ή υποστηρικτικής θεραπευτικής προσέγγισης, κατέστησε τον ιατρικό ευνουχισμό μέσω της δράσης στον υποδοχέα της LHRH – Ι στρατηγική επιλογής για την καταπολέμηση των ενδοκρινικών διαταραχών και των ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου, καρκίνος του προστάτη). Μια πληθώρα αναλόγων της LHRH έδωσε και δίνει το παρόν σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο, με τη συστηματική έρευνα, σύνθεση και ανάπτυξη να αποδίδουν μόρια – αγωνιστές ή – ανταγωνιστές του υποδοχέα της LHRH – Ι, πεπτιδικής (γραμμική ή κυκλική δομή, stapled peptides) ή μη φύσης ως μοναδιαίες οντότητες ή σε σύζευξη με ένα ευρύ φάσμα κυτταροτοξικών μορίων (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010).
Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στην in vitro και in vivo αξιολόγηση και φαρμακοκινητική μελέτη καινοτόμων αναλόγων της LHRH – κυκλικής και γραμμικής δομής – στη βάση του ορθολογικού μοριακού σχεδιασμού και αποσκοπώντας σε εναλλακτικές προσεγγίσεις για την καταπολέμηση του καρκίνου του προστάτη (και έτερων ενδοκρινικών διαταραχών), συγκριτικά με το leuprolide (εμπορικά διαθέσιμος αγωνιστής του υποδοχέα της LHRH – Ι). Η παρούσα διδακτορική διατριβή θέτει ως υπόθεση εργασίας πως καινοτόμα ανάλογα της LHRH των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Η εν λόγω ερευνητική προσέγγιση εστιάζει στον καρκίνο του προστάτη, μια νόσο που χρήζει εναλλακτικής θεραπευτικής στρατηγικής, δεδομένης της χαμηλής αποτελεσματικότητας αυτής (η νόσος προοδευτικά γίνεται ανεξάρτητη των ορμονών και συνεπώς, μεταστατική), αλλά και της χαμηλής ποιότητας ζωής των ασθενών στη βάση του «συμβιβασμού» με τις οδούς χορήγησης που εφαρμόζονται σήμερα στην κλινική (depot formulations).
Επιπρόσθετα και κατά την εκπόνηση της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν καινοτόμες μεθοδολογίες υγρής χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας (LC – MS/ MS) σε βιολογικά υγρά – ηπατικά μικροσώματα (μύα, επίμυα, ανθρώπου), νεφρικές μεμβράνες μύα, πλάσμα και όρχεις μύα – και έτερα υποστρώματα (κυτταρικά εκχυλίσματα, υδάτινο περιβάλλον ιχθύων Danio rerio), οι οποίες, εν συνεχεία, συζεύχθηκαν με in vitro ή/ και in vivo βιοδοκιμασίες. Τα πειραματικά ευρήματα συγκρίθηκαν με εκείνα των εμπορικά διαθέσιμων αναλόγων της LHRH, με αγωνιστική (leuprolide) ή ανταγωνιστική δράση (antide, cetrorelix).
Πιο αναλυτικά και λαμβάνοντας υπόψην το «νοσηρό» φαρμακοκινητικό προφίλ των αναλόγων της LHRH που χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική, διερευνήθηκε η in vitro (ηπατικά μικροσώματα μύα, επίμυα και ανθρώπου – νεφρικές μεμβράνες μύα) και in vivo (πλάσμα μύα) πεπτιδική σταθερότητα των υπό μελέτη αναλόγων, συγκριτικά με την LHRH και εμπορικά διαθέσιμα ανάλογα αυτής (antide, leuprolide). Τα ευρήματα επέτρεψαν την αξιολόγηση και ταξινόμηση των αναλόγων του ενδιαφέροντος βάσει πεπτιδικής σταθερότητας (δοκιμασία σάρωσης). Ταυτόχρονα, προσδιορίστηκε το μεταβολικό τους προφίλ, αποκαλύπτοντας τους ευάλωτους πεπτιδικούς δεσμούς, καθώς και τις εμπλεκόμενες ενδοπεπτιδάσες (NEP – EC 3.4.24.11, ACE – EC 3.4.15.1). Τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με τη χρήση ειδικών ενζυμικών αναστολέων (ενδεικτικά: DL – Thiorphan). Ο νεφρός βρέθηκε να είναι το πρωτεύον μεταβολικό όργανο. Η ανίχνευση και η ημι – ποσοτικοποίηση των μεταβολικών προϊόντων οδήγησε στον προσδιορισμό σχέσεων δομής – δραστικότητας, αποτελώντας τη βάση του ορθολογικού σχεδιασμού καινοτόμων μορίων. Οι απορρέουσες σχέσεις δομής –δραστικότητας υποστηρίζουν πως (i) η μεθυλίωση της υδροξυλομάδας της Tyr5, (ii) η αντικατάσταση της Pro9 από Aze και (iii) η κυκλοποίηση ενισχύουν την πεπτιδική σταθερότητα των αναλόγων του ενδιαφέροντος.
Στα πλαίσια μελετών φαρμακοδυναμικής, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης και των υπό μελέτη αναλόγων σε πλάσμα (0, 05 – 100 ng/mL) και όρχεις μύα (2, 0 – 2000 ng/g). Η τεστοστερόνη θεσπίστηκε βιοδείκτης αποτελεσματικότητας (efficacy) και τοξικότητας (toxicity) στη βάση του καίριου ρόλου που διαδραματίζει το εν λόγω στεροειδές στη φυσιολογία του άξονα υποθάλαμος – υπόφυση – γονάδες και την παθοβιοχημεία των ενδοκρινικών διαταραχών και του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη. Η φαρμακολογική απόκριση (απελευθέρωση τεστοστερόνης) βρέθηκε πως είναι ειδική και λαμβάνει χώρα μέσω του υποδοχέα της LHRH – Ι. Πιο σημαντικά, επετεύχθη ιατρικός ευνουχισμός, βάσει ιστοπαθολογικών ευρημάτων και προσδιορισμού της τεστοστερόνης (πλάσμα και όρχεις μύα), κατόπιν επαναλαμβανόμενης ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης του επιλεγμένου καινοτόμου γραμμικού αναλόγου της LHRH, linearGnRH1. Το ίδιο ανάλογο βρέθηκε να έχει κυτταροστατική δράση σε πειράματα κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κύτταρα LNCaP και PC3). Παράλληλα και υπό το πρίσμα του ρόλου της LHRH στην παθοβιοχημεία έτερων ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου), αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και βελτιστοποιήθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό της 17β – οιστραδιόλης σε βιολογικά υγρά. Τέλος, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό πεπτιδίων του ενδιαφέροντος στο υδάτινο περιβάλλον των ιχθύων του είδους Danio rerio.
Το καινοτόμο γραμμικό ανάλογο της LHRH, linearGnRH1, δεδομένου του φαρμακοκινητικού/ φαρμακοδυναμικού του προφίλ, δρα υποστηρικτικά ως προς την υπόθεση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, σύμφωνα με την οποία καινοτόμα ανάλογα των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Το linearGnRH1 δύναται να αποτελέσει τη βάση για τον ορθολογικό σχεδιασμό μορίων (stapled peptides, μιμητές), αποσκοπώντας σε εναλλακτικές θεραπευτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου ή/ και των ενδοκρινικών διαταραχών. Πέραν του linearGnRH1, ας σημειωθεί πως κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής συγκεκριμένα καινοτόμα κυκλικά ανάλογα της LHRH (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) εμφάνισαν ένα διακριτό φαρμακοκινητικό προφίλ. Το φαρμακοδυναμικό προφίλ των εν λόγω κυκλικών πεπτιδίων απαιτείται να διερευνηθεί περαιτέρω με την εφαρμογή των καινοτόμων μεθοδολογιών LC – MS/MS που αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής.
Συνολικά, η καινοτομία της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης έγκειται (i) στην ανάπτυξη, επικύρωση και βελτιστοποίηση ενός πλήθους μεθοδολογιών LC – MS/MS σε σύζευξη με in vitro και in vivo βιοδοκιμασίες, οι οποίες και αποτελούν ένα διακριτό αναλυτικό εργαλείο και (ii) στο προκλινικό φαρμακολογικό μοντέλο που αναπτύχθηκε με την επιλογή του μύα ως ζωικό πρότυπο. Κοινή συνισταμένη, η εν τω βάθει αξιολόγηση της φαρμακοκινητικής/ φαρμακοδυναμικής των πεπτιδίων του ενδιαφέροντος με το ερευνητικό βλέμμα στα πεπτιδικά φάρμακα.. stapled peptides.. μιμητές.. / The highly influential findings of C. B. Huggins (Huggins, 1963) and A. V. Schally (Schally et al., 1984) brought a new era in the research fields of neuroendocrinology, gynecology and oncology. The knowledge acquired regarding the physiology of LHRH and its role in the pathobiochemistry of the disease resulted in the consideration of medical castration via the LHRH receptor as a well established strategy for the treatment of endocrine disorders (e.g. precocious puberty) and hormone – dependent cancers (breast cancer, endometrial cancer, prostate cancer). Numerous LHRH analogues have been synthesized and evaluated both in the clinic and preclinical level. Overall, systematic work has resulted in the synthesis of LHRH receptor agonists and antagonists, either peptides (linear, cyclic, stapled peptides) or small organic molecules as entities or combined with various cytotoxic molecules (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010).
Although extensive research has been carried out in the field of hormonal therapy, poor pharmacokinetic properties still characterize LHRH peptide analogues. Poor stability of LHRH analogues compromises efficacy, while the need for their subcutaneous administration (depot formulations) aggravates the quality of life for cancer patients. Nowadays, LHRH analogues in the clinic most likely achieve the desired pharmacologic effects by action primarily on the pituitary and to a much lesser extent by direct antiproliferative effects on tumor cells.
Herein, we hypothesize that stable analogues of such super – agonists would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. In this context, the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of novel LHRH analogues were determined both in vitro and in vivo. Similarly, commercially available LHRH analogues (leuprolide, antide, cetrorelix) served as positive controls.
Novel LC – MS/MS based approaches (LC – MS/ MS methodologies coupled to in vitro and in vivo bioassays) were developed, validated and optimized for the evaluation of the peptide analogues in question (linear or cyclic) in various biological fluids and matrices; (i) mouse, rat and human liver microsomes, (ii) mouse kidney membrane preparations, (iii) mouse plasma and tissue (testis), (iv) egg – water (Danio rerio embryos environment). Furthermore, a novel LC – MS/MS based approach was developed, validated and optimized for the simultaneous quantification of testosterone and peptides in question, upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. Testosterone served as an efficacy and toxicity biomarker. Peptide metabolism was thoroughly studied by an LC – MS/MS based approach coupled to an in vitro bioassay (mouse kidney membrane preparations), allowing (i) structural elucidation and semi – quantitation of metabolites (and peptides) as a function of time, (ii) determination of the susceptible to proteolysis peptide – bonds, (iii) structure – activity relationships (SARs) and (iv) peptide ranking (screening assay). Taking into account the role of LHRH in gynecology and hormone – dependent cancers of breast, endometrium and ovary, an LC – MS/MS based approach was developed for the quantification of 17β – oestradiol (efficacy and toxicity biomarker) in mouse plasma upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. A novel LC – MS/MS based approach was also developed for the quantification of peptides of interest in the aquatic environment of Danio rerio.
Employing the aforementioned analytical tools, peptide stability against proteolysis was evaluated both in vitro (mouse kidney membrane preparations) and in vivo (mouse plasma). LHRH and commercially available analogues served as positive controls. The SARs derived suggested that enhanced stability was achieved by (i) methylation on the hydroxyl group of Tyr5, (ii) replacement of Pro9 by Aze and (iii) cyclisation. Hence, new promising chemical entities could be synthesized and developed on the basis of rational drug design. Metabolic profiles were also determined revealing the susceptible to proteolysis peptide bonds. Susceptible peptide bonds and endopeptidases involved were further confirmed in the presence of specific endopeptidase inhibitors.
A facile preclinical mouse model was developed in the context of our objectives. Intraperitoneal administration was selected, since (i) it is a mix – mode type of administration with elements of rapid absorption and (ii) oral administration was not practical due to the low bioavailability of the peptides that were tested. The LC – MS/MS based quantification of the selected bioactive peptides and their corresponding metabolites as well as the selective monitoring of biomarkers (e.g. testosterone) in response to drug dose, in plasma and testes, combined with the appropriate preclinical mouse model, represents a distinctive approach. The mouse model described in this paper is particularly valuable, since (i) the human LHRH receptor is homologous to the mouse receptor (Millar, 2004), (ii) information on in vitro and in vivo stability can be obtained with a relatively small amount of peptide (1 – 2 mg), (iii) information on the LHRH receptor agonism (receptor specific in vivo modulation) can be obtained by using testosterone as a marker, (iv) it allows the determination of the dosing regimen required for efficacy based on action on the pituitary, (v) it can become the basis of follow up experiments on genetically modified mouse animal models or other tumour xenografted mouse models (Sharpless and Depinho, 2006; Morgan et al., 2008).
The robust sensitive methodology that was developed for the quantification of testosterone in mouse plasma (0.05 – 100 ng/mL) or determination of testosterone in testes (2 – 2000 ng/g) provides an excellent handle on compound efficacy assessment. Testosterone as an efficacy and toxicity biomarker was found to be specific upon peptide binding to the LHRH receptor. Medical castration was achieved upon the repeated dosing of a selected novel linear analogue (linearGnRH1). Measurements in plasma were further supported by statistical significant testosterone values in testis and histopathological findings (atrophy). Moreover the testis weights of the treated animals were significantly lower in comparison to the control group (atrophy induced by dosing), thus making the differences in testosterone testis concentration between control and peptide treated animals even more pronounced. Although the binding affinity of linearGnRH1 on the LHRH receptor was not as high as the binding affinity of leuprolide (~ 15 nM versus <1 nM), the in vivo efficacy between the two analogues was similar (at the tested dose), suggesting that the enhanced stability or bioavailability of linearGnRH1, compensates for binding affinity differences. LinearGnRH1 was also found to be anti – proliferative upon dosing in LNCaP cells (as potent as the superagonist leuprolide). It is possible that linearGnRH1 can play a significant role for the treatment of hormone – dependent cancers, by acting not only at the pituitary level (thus, suppressing the pituitary – testicular axis), but also by exerting an antitumor activity directly on cancer cells, as has been previously shown for other LHRH agonists (Maudsley et al., 2004; Marelli et al., 2006). Except for linearGnRH1, selected cyclic analogues (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) exhibited a distinct pharmacokinetic profile. Their pharmacodynamic profiles should be evaluated further employing the novel LC – MS/MS based approaches developed and validated in this study.
Overall, the novelty of the approach described herein consists of (i) the LC – MS/MS methodologies coupled with in vitro and in vivo bioassays developed, validated and employed that provide a distinct analytical tool and (ii) the facile preclinical pharmacological mouse model developed and employed. The approach aims to the pharmacokinetic/pharmacodynamic evaluation of the peptides of interest towards a new generation of peptide drugs.. stapled peptides.. mimetics. Considering the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of linearGnRH1, findings on this novel analogue satisfy our hypothesis according to which stable analogues of the LHRH super – agonists used in the clinic would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. LinearGnRH1 can serve as the platform for the rational drug design of new chemical entities (stapled peptides, mimetics) for the treatment of hormone – dependent cancers and/ or endocrine disorders.
|
Page generated in 0.0425 seconds