京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第22021号 / 生博第418号 / 新制||生||55(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 福澤 秀哉, 教授 河内 孝之, 教授 荒木 崇 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

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Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS). / In contaminated environments, organisms are often exposed to multiple contaminants at the same time. Based upon the current models for predicting metal effects on organisms (e.g., Biotic Ligand Model, BLM, the free ion model, FIAM), the presence of a second metal is predicted to decrease the bioaccumulation and biological effects of the first. In contrast to this prediction, antagonistic, synergistic and additive effects have been well documented in the literature. Phytochelatins (PCs) are a family of thiol-rich peptides with a general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly with n=2-11. PCs are involved in both metal homeostasis and the protection of plants from metal toxicity, through their role as metal chelators. Their synthesis depends upon the metal exposure, the duration of exposure and the biological species involved. Therefore, the objective of this study was to determine, in binary mixtures of metals, if the synthesis of phytochelatins could be predicted using equilibrium models, such as the BLM. The study initially examined binary mixtures: Cd-Ca, Cd-Pb and Cd-Cu by comparing the quantity of internalized metal to the amount of phytochelatins produced by Chlamydomonas reinhardtii in response to a metal stress. The bioaccumulation results, after six hours of exposure, showed that Cd decreased in the presence of Ca and very high concentrations of Pb and Cu. In contrast, it increased in the presence of Cu and remained unchanged in the presence of moderate concentrations of Pb. For mixtures of Cu and Cd, a good correlation was observed between the production of PC2, PC3 and PC4 and the quantity of internalized metals. Both bioaccumulation and phytochelatin synthesis were considered to be synergistic. For mixtures of Cd and Ca, the amount of PC3 and PC4 produced decreased with the internalized metal (antagonistic effect); however, in the presence of added Ca, GSH and PC2 production was much higher than predicted. The detection and quantification of the PCs were performed using an optimized protocol for high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection (HPLC-FL); metal uptake was determined using atomic absorption spectrometry (AAS) or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).

Au cours de la dernière décennie, les nanoparticules ont connu un essor sans précédent dans plusieurs domaines. On peut retrouver ces nanoparticules dans des secteurs aussi variés tels que la médecine, l’électronique, les écrans solaires, les cosmétiques et les plastiques, pour ne nommer que ceux-là. Cette utilisation massive a eu un effet pervers sur l’environnement, sachant qu’une grande partie de ces produits se sont retrouvés inévitablement dans les milieux naturels. Plusieurs études révèlent qu’autant la présence des nanoparticules que leurs produits de dissolution sont à prendre en considération lorsque des travaux toxicologiques ou le devenir de ces matériaux sont étudiés. Il est désormais clair que les propriétés de surface de ces nanoparticules jouent un rôle central sur leur comportement dans les solutions aqueuses; que ce soit les interactions avec des organismes ou entre les particules elles-mêmes. Afin d’évaluer le devenir de nZnO, une étude sur la dissolution ainsi que la bioaccumulation a été réalisée avec l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en présence de nanoparticules ayant différents enrobages. Les nanoparticules d’oxyde de zinc suivantes ont été étudiées : (i) nZnO sans enrobage (nZnO); (ii) nZnO avec enrobage d’acide polyacrylique (nZnO-PAA) et (iii) nZnO avec enrobage d’hexamétaphosphate de sodium (nZnO-HMP). La dissolution était mesurée à l’aide de trois techniques : ultrafiltration par centrifugation (CU); technique potentiométrique (scanned stripping chronopotentiometry, SSCP) et spectrométrie de masse – plasma à couplage inductif couplé à une résine échangeuse d’ions (resin-based inductively coupled plasma-mass spectrometry, resin-based ICP-MS). Les résultats obtenus démontrent une grande tendance à la dissolution pour le nZnO (presque totale) tandis que pour le nZnO-PAA et le nZnO-HMP, la dissolution est dépendante de la nature de l’enrobage le composant. Pour la bioaccumulation sur l’algue testée, les données montrent une grande dépendance au zinc libre issu de la dissolution pour nZnO et nZnO-PAA. À l’inverse, le nZnO-HMP démontre une bioaccumulation plus élevée par comparaison aux mêmes concentrations d’expositions du zinc libre, expliquée par la stimulation de l’internalisation du zinc provoqué par la présence de phosphate constituant l’enrobage de nZnO-HMP. / Over the last decade, the use of nanoparticles (NP) has been increasing exponentially in numerous sectors, leading to their massive release into the environment. For example, zinc oxide nanoparticles (nZnO) can be found in areas such as medicine, electronics, sunscreens, cosmetics and plastics. Concerns have therefore been raised about the impacts of the NP on the natural environment, as well as their consequences for humans. Multiple studies reveal that not only the NP but also their dissolution products may have impacts on environmental systems. It is well understood that surface properties of engineered nanoparticles in aqueous solution play a pivotal role in nanoparticle behavior, including their interactions with organisms. Therefore, in order to assess the behavior of nZnO, this study focuses on their dissolution and evaluates the bioaccumulation of 3 nanoparticles with different surface stabilizations by the freshwater algae Chlamydomonas reinhardtii. The following NP were studied: (i) bare nZnO, (ii) polyacrylic acid coated (nZnO-PAA) and (iii) sodium hexametaphosphate coated (nZnO-HMP). Three different techniques were used to quantify dissolution of the nZnO: centrifugal ultrafiltration (CU), scanned stripping chronopotentiometry (SSCP) and resin-based inductively coupled plasma-mass spectrometry (resin-based ICP-MS). The results reveal a high dissolution of the bare nZnO (nearly total) while the dissolution of the polyacrylate coated and hexamataphosphate coated nZnO were highly dependent on the nature of the stabilizer. As a consequence, bioaccumulation in model algae C. reinhardtii was strongly related to the release of free zinc in the bare nZnO and the nZnO-PAA. On the other hand, algae exposed to nZnO-HMP appeared to be stimulated by the phosphate coating, leading to higher bioaccumulation than for the free zinc, once again demonstrating the importance of the nature of the stabilizer.

This thesis describes an investigation of the molecular mechanism underlying solar conversion processes that occur in Type I photosynthetic reaction centers, in which P700 plays a central role. Static Fourier transform infrared (FTIR) difference spectroscopy (DS) was used to probe the electronic and structural organization of P700 and P700+. In combination with isotope labeling and site directed mutagenesis we have investigated how protein interactions such as histidine ligation and hydrogen bonding modulate this organization. Comparison of (P700+-P700) FTIR difference spectra (DS) obtained using wild type and mutant PS I led us to suggest that the 131 keto carbonyl group of PA is essentially free from hydrogen bonding in the ground state. Upon cation formation, this hydrogen bonding becomes stronger, probably because of a cation induced reorientation of the hydroxyl group of a nearby threonine residue. We also tentatively suggested that a difference band at 1639(-)/1660(+) cm-1 in (P700+-P700) FTIR DS might be due to a C=C mode of the imidazole side chain of the ligating histidine residues. Most of this thesis is geared towards investigating the validity of this interpretation. (P700+-P700) FTIR DS obtained using mutant PS I particles in which hydrogen bonding to P700 is altered can be reconciled within the context of our new interpretation. (P700+-P700) FTIR DS obtained using uniformly 2H, 15N, and 13C labeled PS I particles also support our new interpretation, and indicate that the difference band at 1639(-)/ 1660(+) cm-1 cannot be associated with a strongly hydrogen bonded keto carbonyl group of PA. To investigate if the imidazole side-chain of ligating histidine residues could contribute to bands in (P700+-P700) FTIR DS vibrational mode frequencies and intensities for several protonation forms of 4-methylimidazole were calculated. The calculations suggest that the 1639(-)/1660(+) cm-1 band in (P700+-P700) FTIR DS may not be due to a C=C mode of the imidazole side chain of the ligating histidine residues. Thus we have produced data that suggests neither of the proposed interpretations alone can adequately explain the origin of the 1639(-)/1660(+) cm-1 difference band in (P700+-P700) FTIR DS. The origin of the 1639(-)/1660(+) cm-1 difference band in (P700+-P700) FTIR DS is therefore still an open question.

Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS). / In contaminated environments, organisms are often exposed to multiple contaminants at the same time. Based upon the current models for predicting metal effects on organisms (e.g., Biotic Ligand Model, BLM, the free ion model, FIAM), the presence of a second metal is predicted to decrease the bioaccumulation and biological effects of the first. In contrast to this prediction, antagonistic, synergistic and additive effects have been well documented in the literature. Phytochelatins (PCs) are a family of thiol-rich peptides with a general structure (γ-Glu-Cys)n-Gly with n=2-11. PCs are involved in both metal homeostasis and the protection of plants from metal toxicity, through their role as metal chelators. Their synthesis depends upon the metal exposure, the duration of exposure and the biological species involved. Therefore, the objective of this study was to determine, in binary mixtures of metals, if the synthesis of phytochelatins could be predicted using equilibrium models, such as the BLM. The study initially examined binary mixtures: Cd-Ca, Cd-Pb and Cd-Cu by comparing the quantity of internalized metal to the amount of phytochelatins produced by Chlamydomonas reinhardtii in response to a metal stress. The bioaccumulation results, after six hours of exposure, showed that Cd decreased in the presence of Ca and very high concentrations of Pb and Cu. In contrast, it increased in the presence of Cu and remained unchanged in the presence of moderate concentrations of Pb. For mixtures of Cu and Cd, a good correlation was observed between the production of PC2, PC3 and PC4 and the quantity of internalized metals. Both bioaccumulation and phytochelatin synthesis were considered to be synergistic. For mixtures of Cd and Ca, the amount of PC3 and PC4 produced decreased with the internalized metal (antagonistic effect); however, in the presence of added Ca, GSH and PC2 production was much higher than predicted. The detection and quantification of the PCs were performed using an optimized protocol for high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection (HPLC-FL); metal uptake was determined using atomic absorption spectrometry (AAS) or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).

Fabrication of effective algae cultivation systems adjacent to coal-fired power plants to fixate waste CO2 would represent a sizable step towards achieving a carbon neutral energy cycle. However, emission gas would elevate the algal cultivation system temperature and decreases its pH without expensive preprocessing. Increased temperature and acidity constitutes a profound stress on the algae. Although stressed algae produce heat shock proteins (HSPs) that promote protein folding and protect against stress, the ordinary biological response is insufficient to protect against coal flue gas. Experimental upregulation of HSPs could make algae respond to the stress caused by high temperatures and low pH at an elevated level. However, no work has been done to determine whether HSPs can be experimentally upregulated in algae. Here, the Chlamydomonas reinhardtii algal strain was selected because it has a sequenced genome and singular cell structure ideal for genetic modifications. Two genetic modification methods: transformation with plasmids pCB720/pCB740, and cloned pchlamiRNA3/pchlamiRNA3int with yeast HSP gene SSA1 were evaluated. pCB720/pCB740 up regulate algae production of native HSP, HSP70B. pCB720 transformation success was observed but statistically, data varied. pchlamiRNA3/pchlamiRNA3int were cloned with SSA1. Chlorophyll content measured growth indirectly. Quantitative HSP detection could be done using RT-PCR.

Chlamydomonas reinhardtii possesses a single-cell-based CO2-concentrating mechanism (CCM). The CCM is an important element of algal photosynthesis, metabolism, growth and biomass production, which works by increasing the concentration of inorganic carbon (Ci) in the pyrenoid, a dense RuBisCO-packed structure within the chloroplast. This suppresses RuBisCO oxygenase activity and associated photorespiration. The enhanced efficiency of CO2 assimilation in the pyrenoid via CCM had been modelled theoretically as a requirement for successful CCM in higher plant systems. The ultimate aim of my research is to understand the biogenesis of the pyrenoid using a set of CCM mutants with pyrenoidal defects. Immunofluorescence methods and spot growth tests under different CO2 concentrations were performed on mutants with CCM defects generated by an insertional mutagenesis screen. Morphological and physiological characterisation of these mutants revealed differences in the pyrenoid morphology, the ability for RuBisCO to aggregate into the pyrenoid and the formation of thylakoidal tubule network associated with the pyrenoid. The thylakoid tubule network may be linked to the transport of inorganic carbon into the pyrenoid as part of the CCM. Further characterisation of one of the mutants gave rise to the hypothesis that the gene of interest, Cre11.g467712 (SAGA), is a multi-functional anchor protein related to the structural formation of the pyrenoid and may be another essential component of the pyrenoid.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第20525号 / 生博第367号 / 新制||生||48(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 佐藤 文彦, 教授 河内 孝之, 教授 福澤 秀哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DFAM

Les triacylglycérols d'algues (TAG) représentent une source prometteuse de biocarburants. Les principales étapes de la synthèse des acides gras et du métabolisme du TAG des algues ont été déduites de celles des plantes terrestres, mais on en sait peu sur les sources de carbones et d’énergie intervenant dans la synthèse de lipides de réserve. Nous avons donc étudié la synthèse des acides gras chez l’algue modèle Chlamydomonas reinhardtii en utilisant une combinaison d'approches génétiques, biochimiques et microscopiques. Plus précisément, j'ai d'abord examiné la localisation subcellulaire de gouttelettes de lipides dans des cellules d'algues exposées à une forte lumière, conditions où une plus grande quantité de pouvoir réducteur est produite. J'ai ensuite contribué à mettre en évidence que la bêta-oxydation des acides gras est un processus peroxysomal, et que pendant une carence en azote réalisée en conditions photoautotrophe, des mutants dépourvus de la malate déshydrogénase 2 peroxysomale (mdh2) accumulent 50% plus TAG que les souches parentales. Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence l'importance du contexte redox cellulaire sur la synthèse lipidique. Cette étude a également permis de révéler l’existence d'un échange d’énergie entre le peroxysome et le chloroplaste. Enfin, en caractérisant des mutants déficients dans la dégradation des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), j'ai montré que le catabolisme des BCAAs joue un double rôle dans la synthèse de TAG en fournissant des précurseurs carbonés et de l'ATP. L'ensemble de ces travaux ouvert de nouvelles pistes pour l'amélioration génétique future de souches d'algues pour la production de biocarburants. / Algal triacylglycerols (TAG) represent a promising source for biofuel. The major steps for fatty acid synthesis and TAG metabolism have been deduced based on that of land plants, but little is known about carbon and energy sources. To address this question, we investigated fatty acid synthesis in algal cells using a combination of genetic, biochemical and microscopic approaches in the model microalga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, I first examined subcellular localization of lipid droplets in algal cells exposed to high light, a condition favoring production of reducing power. Secondly, I contributed to put on evidence that the beta-oxidation of fatty acids is a peroxisomal process, and that during photoautotrophic nitrogen starvation, knock-out mutants of the peroxisomal malate dehydrogenase 2 (mdh2) made 50% more TAG than parental strains, highlighting the importance of cellular redox context on lipid synthesis. This study also revealed for the first time the occurrence of an energy trafficking pathway from peroxisome to chloroplast. And finally, by characterizing mutants defected in degradation of branched-chain amino acids (BCAAs), I showed that BCAA catabolism plays a dual role in TAG synthesis via providing carbon precursors and ATP. Taken together, this work highlighted the complex interplay between carbon and energy metabolism in green photosynthetic cells, and pointed future directions for genetic improvement of algal strains for biofuel productions.